PLoS ONE: Den Notch-2 Gene reguleres af Wnt signalering i dyrkede Kolorektal Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

Notch og Wnt veje er vigtige regulatorer af tarm homeostase og ændringer i disse veje kan føre til udvikling af colorektal cancer (CRC). I CRC

Apc /β-catenin

gener i Wnt signaling pathway hyppigt muterede og aktiv Notch signalering bidrager til tumorigenese ved at holde epithelcellerne i en proliferativ tilstand. Disse veje er samtidig aktiv i proliferative adenom celler og en krydstale mellem dem har tidligere været foreslået i normal udvikling samt i kræft.

vigtigste resultater

I denne undersøgelse

i silico

analyse af formodede promotorer involveret i transskriptionel regulering af gener, der koder for proteiner i Notch signalvejen afslørede adskillige formodede lef-1 /TCF lokaliteter som potentielle mål for β-catenin og kanoniske Wnt signalering. Yderligere resultater fra konkurrencedygtige elektroforetisk mobilitet-shift assay (EMSA) undersøgelser tyder binding af flere formodede steder i Notch pathwaygen-initiativtagere til

in vitro

oversat β-catenin /Lef-1. Vildtype (wt) APC negativt regulerer β-catenin. Ved induktion af vildtype-APC eller β-catenin silencing i HT29-celler observerede vi, at flere gener i Notch bane, herunder

Notch-2

blev nedreguleret. Endelig blev aktiv Notch signalering verificeret i

Apc

Min /

+ musemodel hvor

Hes-1

mRNA niveauer blev fundet signifikant opreguleret i intestinale tumorer i forhold til normal tarm slimhinde. Luciferaseassays viste en forøget aktivitet for kernen og proximale

Notch-2

promotor ved co-transfektion af HCT116-celler med høj ekspression af rekombinant TCF-4, lef-1 eller β-catenin.

konklusioner

I dette papir, vi identificerede

Notch-2

som en ny mål for β-catenin-afhængige Wnt signalering. Desuden understøtter vores data opfattelsen af, at yderligere gener i Notch vej kunne være transkriptionelt reguleret af Wnt signalering i kolorektal cancer

Henvisning:. Ungerbäck J, Elander N, Grünberg J, Sigvardsson M, Söderkvist P (2011) Den

Notch-2

Gene reguleres af Wnt signalering i dyrkede Colorectal Cancer Cells. PLoS ONE 6 (3): e17957. doi: 10,1371 /journal.pone.0017957

Redaktør: Kerstin Borgmann, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Tyskland

Modtaget: Juli 28, 2010; Accepteret: 21 Februar 2011; Udgivet: 18 marts 2011

Copyright: © 2011 Ungerbäck et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af det svenske forskningsråd og Östergötland County Council. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

epitelet i mavetarmkanalen kontinuerligt erstattet med en omsætning på to til syv dage. For at opretholde homeostase af tarmepitelet, fremgangsmåder cellulær proliferation, differentiering, migration og død skal reguleres strengt [1] – [3]. Et par, men yderst bevarede signalveje menes at drive disse processer (revideret i [4], [5] og [6]). Den kanoniske Wnt signalering pathway var den første til at blive opdaget som værende væsentlig for intestinal crypt celleproliferation og homeostase [7] – [10]. Et centralt element i denne pathway er det cytoplasmiske protein β-catenin, der, når translokeres til kernen som følge af Wnt signaler, fungerer som en co-faktor for transkriptionsfaktorer af lef-1 /Tcf (Lymfoid enhancer faktor-1 /T Cell Factor) familie at muliggøre aktivering af en nedstrøms genetisk program [11]. Niveauet af β-catenin i colon epitel reguleres af ubiquitinin-proteasom-systemet [12]. En af de kritiske bestanddele af β-catenin ødelæggelse kompleks det adenomatøs polypose coli (APC) protein [11]. Mutations-inaktivering af dette gen forårsager stabilisering af β-catenin [13] og forøget celleproliferation og repræsenterer en af ​​de mest almindelige genetiske ændringer i kolorektal cancer (CRC) [14]. Dette resulterer i forhøjede niveauer og nukleare translokation af β-catenin og efterfølgende dysreguleret aktivering af LEF-1 /TCF målgener [5].

modning af intestinale stamceller er også reguleret af Notch signalvej repræsenterer en anden evolutionær bevaret signalsystem involveret i at opretholde kolon epitel homeostase [2] – [4], [15] – [17]. Core elementer i denne signalvej er de monomere transmembrane bundet Notch receptorer (Notch1-4 i pattedyr), der efter binding til ligand (Deltalike-1, -3, -4, Jagged-1 eller -2) frigive et intracellulært domæne (NiCd ), der fungerer som en transkriptionel co-faktor. Specificiteten af ​​ligand /receptor-interaktion bestemmes ved tilsætning af sukkerdele af glykosyltransferaser fra

Fringe

genfamilien (

Lunatic Fringe

,

Lfng

;

Maniac frynser

,

Mfng

Radikal frynser

,

Rfng

) [18] – [20]. NICD translokerer ind i kernen til at danne en transkriptionel aktivering kompleks med DNA-bindende faktor CSL (RBP-JK) og co-aktivatorer, der hører til

Mastermind-lignende

familie (

Maml

) [ ,,,0],15], [21], [22]. Nogle af de bedst karakteriserede mål for denne transkriptionel aktivering kompleks hører til

Hes

-og

Hey

familie af gener, der fungerer som transkriptionelle repressorer af yderligere downstream mål som

mate- 1

(mus homolog af menneskelig

Hath-1

) [23] – [25]. Det er blevet foreslået, at Notch-1 og Notch-2-funktionen redundant i tarmen, og at kanoniske pathway aktivering via en af ​​disse receptorer er tilstrækkeligt til at forhindre differentiering af proliferative krypt progenitorceller til post-mitotiske slimceller, hvilket indikerer, at Notch signalering kunne være disponeret for malign transformation [2]. Dette har været forbundet med derepression af cyklin-afhængige kinase hæmmere p27

Kip1 og p57

Kip2 [2] samt opregulering af

Math-1

mRNA og protein [2], [26 ], [27]. Imidlertid

Notch-2

er også blevet foreslået, at have en tumor undertrykkende virkning i CRC [28], hvilket tyder kompleks, eventuelt trin relaterede, funktioner af Notch signalering i tarmen.

Desuden til de uafhængige roller Wnt og Notch signalveje i tumorigenese i colon, bekræftes, at tumorudvikling i Apc-defekte mus er øget ved samtidig aktivering af hak og Wnt signaler [29], og at mange intestinale tumorer udviser unormal aktivering af begge pathways [3] antyder en molekylær vekselvirkning mellem Notch og Wnt-signalering i dannelsen af ​​CRC. Trods den tilsyneladende vigtigheden af ​​dette crosstalk og at koordinerede foranstaltninger er blevet rapporteret på forskellige niveauer [30], lidt om de molekylære mekanismer, der forbinder disse veje i tarmens epitel. Det er blevet påvist, at

Hath-1

udtryk øges, når Wnt-vejen er spærret [26], og at

Hes-1

er et direkte mål for kanoniske Wnt signalering i kolorektale adenomer og karcinomer [29], [31] Desuden Jagged-1 er blevet vist, at repræsentere en molekylær forbindelse mellem Wnt og Notch i CRC, hvor

Jagged-1

genet er direkte reguleret af β-catenin /Tcf-4 [32]. Samspillet mellem Wnt og Notch i CRC, og resultaterne heraf, er ikke fuldt forstået, og resultaterne fra forskellige undersøgelser er ofte divergerende [3], [31]. Dette understreger kompleksiteten af ​​krydstale og foreslår, at det ikke blot kan være et spørgsmål af fælles nedstrøms mål af veje.

I denne undersøgelse har vi undersøgt potentialet i Wnt signalvejen til direkte regulering af gener involveret i Notch signalering. Dette viste, at flere af de formodede promotorområder i Notch pathway associerede gener indeholder Lef-1 /TCF-bindingssteder. Nogle af disse gener blev nedreguleret efter ekspression af et funktionelt genet APC i HT29 CRC-cellelinien, støtter ideen om, at unormal Wnt signalering har en direkte indvirkning på ekspressionen af ​​gener, der koder proteiner involveret i Notch signalering. Således har vi foreslå, at vigtige dele af Notch signalvejen er direkte påvirket af Wnt signalering med implikation, at selv en genetisk normal Notch vej kan bidrage til tumorigenese grund af respons til p-catenin eller

Apc

mutationer. Salg

Resultater

Promoter sæt og

i silico

identifikation af potentielle LEF-1 /TCF-steder i Notch pathway initiativtagere

for at identificere potentielle mål for interaktioner mellem Notch og Wnt signalveje, 65 gener, der vides at være vigtige for Notch og Wnt-signalering, blev udvalgt bioinformatically hjælp opfindsomhed pathways Analyse (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com), sammen med omfattende litteratursøgning. Gene promotorsekvenser blev ekstraheret under anvendelse af Genomatix Gene2Promoter software og den gennemsnitlige længde af det formodede kerne, proximale og dele af de distale promotorer blev indstillet til ca. 2500 bp (detaljer er tilgængelige på anmodning). Ved hjælp af den Matlnspector software [33] promotor- sæt til putatitve lef-1 /TCF steder blev identificeret med de formodede konsensussekvenser: 5 ‘- (A /T) (A /T) CAA (A /T) G-3 »[34]. Fireogtyve af de undersøgte gener i Notch vej viste sig at indeholde en eller flere formodede LEF-1 /TCF steder (fig. 1 og supplerende oplysninger S1).

I silico

analyse af de genetiske netværk direkte involveret i hak og Wnt signalering foreslå overlapning og direkte krydstale via Notch målgenet aktivering via kanoniske Wnt signalering. Ved hjælp af Matlnspector, [33] genpromotorer i Notch vej viste sig at indeholde mindst et formodet LEF-1 /TCF-site (antal lokaliteter i pr gen er beskrevet i kantede parenteser). Gener i grå kasser blev udsat for yderligere semi kvantitativ RT-PCR-analyse.

Således

i silico

analyse af de genetiske netværk involveret i hak og Wnt signalering understøtter de tidligere viste interaktioner med

Hes-1

[31] og

Jagged-1

[32], og desuden tyder på en direkte krydstale via target genaktivering på flere andre niveauer i Notch vej.

den β-catenin /Lef-1-kompleks binder in vitro til notch pathway genpromotorer

for at afgøre, om

i silico

identificeret LEF-1 /TCF bindende sekvenser fysisk binder til den β-catenin /Lef-1-komplekset

in vitro

, gennemførte vi en konkurrencedygtig elektroforetisk mobilitet-(EMSA) med et radioaktivt mærket konsensus LEF-1 /TCF stærk binding sonde (CD1TOP [35]) og duplex oligonukleotider, der dækker de potentielle steder i mål initiativtagere. Notch pathway EMSA promoter prober (tabel S1) blev testet mod en

in vitro

oversat Lef-1 /ß-cateninkomplekset.

For at bekræfte, at radioaktivt mærket CD1TOP binder Lef-1 specifikt plasmid -fri reticulocytlysater var underlagt

in vitro

oversættelse og inkuberes med et radioaktivt mærket probe. Som forventet, ingen binding blev observeret (fig. 2). Alle de undersøgte

Notch

genpromotorer,

Notch-2

,

Jagged-1

,

Maml-1

,

Hes-1

,

Rfng

,

Lfng

og

Numbl

viste binding af mindst én formodede LEF-1 /TCF websted i deres promotorområder identificeret

i silico

(fig. 2) (ekstra konkurrencedygtige EMSA resultater er fundet i). Til vores viden

Notch-2

,

Maml-1

,

Rfng

Lfng

er nye potentielle Wnt målgener ikke er beskrevet tidligere. To af de stærkeste bindingssteder blev fundet i

Jagged-1

promotor på -1933 og -1635 i forhold til oversættelsen startstedet, hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, hvor

Jagged-1

har vist sig at være en β-catenin /TCF-4 regulerede gen i human CRC [32] samt i muse hårsækkene [36].

Hes-1

er for nylig også blevet identificeret som en direkte transkriptionel mål for β-catenin /Tcf-4-afhængige Wnt signalering i CRC [31] og vores EMSA data understøtter dette begreb ved klart at identificere

Hes -1

-528 som et bindingssted for den β-catenin /Lef-1-kompleks (fig. S1).

Competitive elektromobilitet-ændring-assay af den proksimale

Notch-2

promotoren. Duplex CD1TOP sonder blev “End mærket” med [

32p] dATP, inkuberes med

in vitro

oversat β-catenin /Lef-1 og udsat for konkurrence med overflod af kolde eller kolde muterede promotor duplex oligonukleotider ( × 300 og × 900 henholdsvis). De protein-DNA-komplekser blev separeret ved elektroforese og visualiseret ved autoradiografi. Som en konkurrence kontrol kold CD1TOP og kold muteret CD1FOP konkurrerede med radioaktivt mærket CD1TOP og at bekræfte, at radioaktive mærkede CD1TOP binder Lef-1 specifikt blev plasmid-fri reticulocytlysat udsat for

in vitro

oversættelse og inkuberes med radioaktivt mærkede probe. Gene nummerering beskriver positionen af ​​LEF-1 /TCF-site relative genet translationsstartstedet. blev udført justeringer i hele billedet kontrast niveauer i Adobe Photoshop CS4.

Resultaterne fra både

i silico

og DNA-bindende analyser tyder på, at en transskriptionel netværk forbinder Wnt og Notch vej , hvilket indebærer en funktionel regulering af kanoniske Wnt signalering på flere niveauer i Notch vej.

canonical Wnt signalering regulerer Notch pathway gener i HT29 kolorektal cancer cellelinje og murine tarm adenomer

Mutationsanalyse inaktivering af

Apc

gen er en central begivenhed i kolorektal carcinogenese og gør konstitutiv aktiv Wnt signalering [13], [14]. For at udvikle de

in silico

og DNA bindende analyser og funktionelt undersøge virkningerne af aktiverede Wnt signalering på Notch pathway gener, nitten gener i Notch vej, vides at være vigtige for kanonisk Notch signalering (fig. 1 og tabel S1), der indeholder formodede LEF-1 /TCF-sites, blev udvalgt til yderligere undersøgelser med semi-kvantitativ RT-PCR. For at aktivere wt-Apc og derved begrænser niveauerne af nukleare β-catenin blev en HT29 cellelinie bærer en Zn-inducerbart wt-Apc vektor, der anvendes. Som forventet var der en stigning af vægt-APC-niveauer i HT29-APC, 6-24 timer efter Zn

2 + -stimulation, men ikke i HT29-β-gal-celler (fig. 3A). De 19 Notch pathway gener blev analyseret ved semikvantitativ RT-PCR og

Hes-1

,

Hes-7

,

Notch-2

,

Maml- 1

,

Lfng

,

Rfng

,

Numb

Numbl

viste sig at være transskriptionelt nedreguleret, mens den negativt reguleret gen

Hath-1

var klart opreguleret 18-24 timer efter vægt-Apc induktion (fig. 3B). Som en positiv kontrol,

cyclin D1

-gen ekspression, induceret af β-catenin [37], blev nedreguleret 6-24 timer efter Zn-induktion, hvilket bekræfter inhibering af Wnt-vejen via ekspression af vildtype-Apc og reduceret β-catenin-niveauer. Resultaterne er i konkordans med tidligere undersøgelser, hvor der er fundet β-catenin-proteinniveauer, der skal nedreguleres [38] og β-catenin /hTcf-4 nukleare kompleks reduceres [39] upon Zn-stimulering i HT29-APC-celler indikerer, nedsat niveauer af nukleare β-catenin. Interessant, kunne vi ikke finde nogen indflydelse Wnt signalering og wt-Apc udtryk på

Jagged-1

i HT29-celler, selvom en bekræftet specifik binding af CD1TOP til

in vitro

oversat Lef-1 blev fordrevet med en 300-fold overskud af kolde

Jagged-1

-1933 og -1635 sonder, men ikke med deres muterede varianter (fig. 2). For at bestemme hvorvidt nedregulering af Notch pathwaygener, vægt–Apc, er direkte under kontrol af β-catenin, udførte vi anti-β-catenin siRNA silencing eksperimenter (fig. S2), ved anvendelse af en pulje af fire forskellige siRNAs targeting β- catenin. Generelt nedregulering var mindre markant end Zn inducerede fald i

Notch-2

,

Numb og Numbl

(Fig. 2A), viser en svag, men konsekvent fald i deres respektive mRNA-niveauer.

Hes-1

var klart nedreguleret 72-96 timer efter transfektion, bestyrke resultaterne af Peignon

et

al. [31].

Rfng

Lfng

blev ikke påvirket af β-catenin lyddæmpning angiver, at deres nedregulering af Wnt signalering observeret i fig. 3B kan ikke være en direkte virkning af β-catenin induceret transkription anvendes i denne eksperimentelle opsætning.

cyclin D1

blev anvendt som en positiv kontrol for siRNA eksperimenter og var klart nedreguleret 72-96 timer efter transfektion. For at teste mere langsigtede virkninger af dereguleret Wnt signalering i tarmepitel vi analyseret

Notch-1

,

Notch-2

og

HES-1

mRNA ekspressionsniveauer i Apc

Min /+ mus (fig. 3C), der bærer en kimlinie beskærer heterozygotisk mutation ved codon 850. mRNA niveauer af

mHes-1 Salg fandtes at være signifikant opreguleret i adenomer (median relative ekspression = 2,0, interkvartile område = 1,5-2,4) sammenlignet med normal intestinal mucosa (median relative ekspression = 1,5, interkvartile område = 0,9-1,7) (Mann-Whitney U-test,

s

= 0,013), hvilket indikerer overaktivt Notch signalering i musen adenomer.

sås A

tendens til opregulering for

mNotch-2

i tumorvæv (median relativ udtryk = 1,6, interkvartile område = 1,0-2,0) sammenlignet med normal tarmslimhinde (median relativ udtryk = 1,3 , interkvartile område = 0,9-1,8) (Mann-Whitney U-test,

s

= 0,14), mens der kunne påvises nogen statistisk signifikante forskelle for

mNotch-1 Hotel (median relativ udtryk = 3.9, interkvartile område = 2,5-5,7 (tumorvæv)) vs. (median relativ udtryk = 3,8, interkvartilt område = 2,4-5,3 (normalt væv)) (Mann-Whitney

U

-test,

p

= 0,9).

Wt-Apc blev induceret i HT29-APC-celler ved tilsætning af 100 uM ZnC

2 til vækstmediet. Semikvantitative RT-PCR blev udført på cDNA omvendt transkriberet fra 200 ng totalt RNA fra hvert tidspunkt (0-24 timer efter wt-Apc induktion). Barer beskrive den relative ekspression af

Notch-2

i HT29-APC-celler (*) versus HT29-β-galactosidase-celler (**) normaliseret mod

GAPDH

udtryk.

cyclin D1

blev anvendt som en positiv kontrol for Wnt inaktivering. (B) Protein ekspression af Apc (~310 kDa), Notch-2 (~265 kDa), wt og ladningskontrol, GAPDH, blev bestemt med Western blot efter 0-24 timer af zink stimulation. blev udført justeringer i hele billedet kontrast niveauer i Adobe Photoshop CS4. (C) Relativ mRNA udtryk for murine

Notch-1

,

Notch-2

og

Hes-1

i tumorer og tilsvarende ikke-tumor normal tarmslimhinden af ​​Apc

Min /+ mus. mRNA-ekspression var relateret til den endogene kontrol genet GAPDH. Hvide søjler (n = 16), sort søjler (n = 22). Bars præsenteres som median ekspressionssystemer værdier. Fejllinjer beskrive interkvartile område.

Det kan konkluderes, inaktivering af Wnt vej gennem aktivering af wt-Apc i HT29 CRC celler nedregulerer adskillige målgener i Notch vej, mens mRNA-niveauer af Notch mål

mHes-1

signifikant opreguleret i intestinale tumorer fra APC manglende mus. Denne yderligere understøtter en direkte transkriptionel crosstalk foreslået af

i silico

og

in vitro

DNA-bindende analyser.

i silico

identificeret hak 2 promotor indeholder fire formodede LEF1 /TCF-sites og bidrager til en høj luciferasegen aktivitet

Notch-2 funktioner redundant med Notch-1 i kolon epitelceller, hvor begge gener er vigtige for at holde cellerne i krypten rummet i en proliferativ og udifferentieret tilstand [2]. Men relativt lidt om transkriptionel regulering af

hak

gener og en potentiel regulering af

Notch-2

gennem Wnt signalering kunne være af betydning for udviklingen og /eller progression af CRC og potentielt i andre maligniteter samt. Tidligere er det blevet vist, at både

Hes-1

og

Jagged-1

er direkte mål for kanoniske Wnt signalering i CRC [31], [32]. Vores resultater fra

i silico

,

in vitro

DNA-bindende analyser og aktivering af wt-Apc, tyder på, at der er en direkte positiv regulering af

Notch-2

gennem Wnt-signalering. Derfor ønskede vi at yderligere at belyse β-catenin /Lef-1 /Tcfs regulering potentiale

Notch-2

promotoren i CRC cellelinier HT29 og HCT116.

Som beskrevet ovenfor,

in silico

analyser blev anvendt til at identificere det humane

Notch-2

promotor og et potentielt transkriptionelle startsted (TSS) blev fundet 256 bp opstrøms det translationelle startsted, verificere resultatet fra Gene2Promoter analyse. Fire formodede LEF-1 /TCF konsensus sites blev identificeret i kernen og proximale promotorregion ved positionerne -2261, -869, -689 og -110 i forhold til det translationelle startsted (fig. 4A). Den -110 webstedet viste stærk binding til Lef-1 i

in vitro

DNA bindende konkurrencedygtig EMSA assay mens sites -2261 og -689 viste svag binding (fig. 2).

(A ) Skematisk afbildning af den proksimale

Notch-2

promotor med de fire formodede lef-1 /TCF-bindende konsensus sites, der er konstateret med Genomatix Matlnspector, ved positionerne -2261, -869, 0,689 og -110 relative translatoriske startsted (ATG). En potentiel transskription startstedet blev kortlagt til position -256 hjælp Genomatix Gene2Promoter og PromoterInspector software. Store bogstaver angiver kernen konsensussekvensen. (B) N2PR -2327 /-99, N2PR -110 i pGL3-TATA samt tomme pGL3-TATA (Smith

et al

, 2002 [40]) blev transficeret i HCT116 og og cotransficeret med pSV-β-galactosidase kontrolvektoren. Cellelysatet 24 timer efter transfektion blev underkastet luciferase reporter assays og relativ luciferaseaktivitet bestemmes. Fejllinjer beskrive SEM.

For at analysere

Notch-2

promotor, vi fokuseret på 2200 nukleotider region spænder både den 5 ‘og 3’ regioner i

Notch -2 formodede

transkriptionelle startsted. To separate konstruktioner blev genereret, én spænder fra position -2327 til -99 (N2PR -2327 /-99) (tal i forhold til translationsstartsted), og derved dækker alle fire formodede LEF-1 /TCF-sites og én, der dækker formodede LEF- 1 /TCF-site -110. De blev klonet ind i en ildflue luciferase reporter vektor (pGL3 Luciferase reporter vektor, Promega) indeholdende en TATA-boks til at opdage eventuelle enhancer og repressor

cis

virkende elementer (tidligere beskrevne [40]). Konstruktionerne blev transient transficeret ind HCT116 eller HT29 celler og reportergenassays aktiviteter blev målt 24 timer efter transfektion. Promotoraktivitet blev forøget 13 gange til N2PR -2327 /-99 vs. 1,7 gange for N2PR -110 promotorkonstruktionen i forhold til baggrund i HCT116 cellelinier (p 0,007 vs. p = 0,04, n = 6 (fig 4B. )). Luciferase assay viser, at den klonede område af det formodede

Notch-2

promotoren indeholder enhancerelementer fører til forøget transkription af luciferasegenet. Disse resultater antyder kraftigt placering af kernen, den proksimale del og dele af den distale

Notch-2

promotor som identificeret af

i silico

analyse.

Overekspression af β-catenin, Lef-1 eller TCF-4 resultat i øget Notch-2-promotor-aktivitet

Notch-2

mRNA og protein niveauer er klart nedreguleret 18-24 timer efter Zn-induktion af wt-Apc i HT29-celler (fig. 3B og B).

Notch-2

mRNA-ekspression blev også analyseret efter

RNAi

inaktivering af β-catenin i HT29 celler, hvor en svagere virkning blev observeret ligner den anden wt-Apc /β-catenin reguleret Notch pathway gener (fig. S2).

resultaterne fra HT29-APC-cellelinie hvor Apc blev aktiveret eller β-catenin lyddæmpet, indebærer en aktiverende rolle Wnt-vejen på

Notch-2

og nedstrøms målgen

Hes-1

[31].