PLoS ONE: LFG-500 Hæmmer invasion af kræftceller via nedregulering af PI3K /AKT /NF-KB Signaling Pathway

Abstrakt

Kræft celle invasion, en af ​​de afgørende begivenheder i lokal vækst og metastatisk spredning af tumorer, besidder et bredt spektrum af mekanismer, især ændret ekspression af matrixmetalloproteinaser. LFG-500 er et hidtil ukendt syntetiseret flavonoid med stærk anticanceraktivitet, hvis nøjagtige molekylære mekanisme forbliver ufuldstændigt forstået. Denne aktuelle undersøgelse blev designet til at undersøge virkningerne af LFG-500 på tumor metastase hjælp

in vitro

og

in vivo

analyser. LFG-500 kunne inhibere adhæsion, migrering og invasion af MDA-MB-231 humane brystcarcinom-celler. I mellemtiden er det reducerede aktiviteter og ekspressionen af ​​MMP-2 og MMP-9 via undertrykke transkriptionel aktivering af NF-KB i stedet for AP-1 eller STAT3. Desuden LFG-500 undertrykte TNF-α inducerede celleinvasion gennem inhibering NF-KB og efterfølgende MMP-9-aktivitet. Yderligere belysning af mekanismen vist, at PI3K /AKT men ikke MAPK-signalvejen var involveret i den inhiberende virkning af LFG-500 på NF-KB-aktivering. LFG-500 kunne også undertrykke lunge metastase af B16F10 murine melanom celler

in vivo

. Tilsammen disse resultater viste, at LFG-500 kunne blokere kræftcellen invasion via nedregulering af PI3K /AKT /NF-KB signalvejen, som giver nye beviser for den anti-cancer aktivitet af LFG-500.

Henvisning: Li C, Li F, Zhao K, Yao J, Cheng Y, Zhao L, et al. (2014) LFG-500 Hæmmer invasion af kræftceller via nedregulering af PI3K /AKT /NF-KB signalvejen. PLoS ONE 9 (3): e91332. doi: 10,1371 /journal.pone.0091332

Redaktør: Zhe Zhang, Xuzhou Medical college, Kina

Modtaget: November 1, 2013; Accepteret: 9. februar 2014 Udgivet: marts 11, 2014

Copyright: © 2014 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Natural Science Foundation of China (nr 21.072.232), Project Program of State Key Laboratory of Natural Medicines, Kina Farmaceutiske Universitet (nr JKGZ201101, SKLNMZZ201210, SKLNMZZCX201303, SKLNMZZJQ201302), Natural Science Foundation i Jiangsu-provinsen (Nej . BK2011620, BK20130220), Program for Changjiang Scholars og Innovative Research Team i University (IRT1193), National Science Teknologi Major Project (nr 2013ZX0 9103-001-007, 2012ZX09304-001), Kina Postdoc Science Foundation finansieret projekt (2013M 541.733), de Jiangsu planlagte projekter for postdoc Funds (1301015B), og Natural Science Foundation i højere uddannelsesinstitutioner i Jiangsu-provinsen (13KJB350007). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Aktivering invasion og metastase, nøglen kendetegnende for kræft [1], er blevet bredt anerkendt som en primær årsag til kræft-relaterede dødsfald. Overdreven basalmembraner og ekstracellulær matrix (ECM) nedbrydning er afgørende for tumorinvasion og metastase [2]. Matrixmetalloproteinaser (MMP’er), en familie af zink-afhængige endopeptidaser, er forbundet med tumorcelleinvasion og metastase [3], [4]. Tumor-udskilte MMP’er kan hydrolysere ECM komponenter i væv, der omgiver tumoren, hvilket letter invasion af tumorceller gennem basalmembranen til fjerne organer og resulterer i metastase [5]. Blandt de MMP’er, MMP-2 (gelatinase A, 72 kDa) og MMP-9 (gelatinase B, 92 kDa) spiller afgørende roller i ECM-nedbrydning [6]. Følgelig er de rigeligt udtrykt i forskellige ondartede tumorer [7]. Derfor MMP og deres regulerende veje betragtes som lovende mål for anti-cancer medicin og kemoterapeutiske stoffer [8].

Det er generelt vist, at phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /AKT og mitogen- aktiveret protein kinase (MAPK) signalveje regulere metastase i en række forskellige cancerceller [9], [10]. Aktiveringen af ​​downstream transkriptionsfaktorer herunder aktivator protein-1 (AP-1), STAT3, og nuklear faktor-KB (NF-KB) rapporteres at stimulere ekspressionen af ​​MMP’er på transkriptionelle niveau [11]. Især, NF-KB, den yderst vigtige transkriptionsfaktor i cancerceller, har været impliceret i mange kendetegnende for udvikling af cancer, herunder vækstfaktor-uafhængig proliferation, forebygge apoptose, ubegrænset replikativ potentiale og væv invasion og metastase [12], [13] . NF-KB-proteiner omfatter en familie af strukturelt beslægtede transkriptionsfaktorer, herunder p50 (NF-κB1), p65 (RelA), c-Rel, p52, og RelB. Blandt disse faktorer, kun p65, RelB, og c-Rel indeholder kraftige transaktiveringsassays domæner i sekvenser C-terminalt for Rel homologi domæne (RHD), som indeholder de DNA-bindende og dimerisering regioner. Aktiveret NF-KB er til stede i kernen, hvor det binder til specifikke DNA-sekvenser kaldet responselementer og regulerer transskriptionen af ​​målgener. Mens i cytoplasmaet, er NF-KB holdt i en inaktiv tilstand, der danner komplekser med de inhibitoriske IKB-proteiner. NF-KB kan aktiveres via den klassiske IKK-afhængige vej, der fører til nuklear translokation af p50 /p65-heterodimerer [14].

Flavonoider er en gruppe af forbindelser rige på frø, citrusfrugter, olivenolie, te, og rødvin. I de senere år har antitumorvirkninger af flavonoider blevet bredt anerkendt og undersøgt, især deres kraftige anti-metastase-aktivitet [15], [16]. Ifølge tidligere undersøgelser, kunne flavonoider inhibere invadopodia dannelse og MMP-sekretion [17] og forhindre cell migration ved opregulering af ekspressionen af ​​transgelin [18]. De mange tiltag kan tilskrives deres poly-phenol struktur. Men flavonoider har meget lav oral biotilgængelighed på grund af sin omfattende first-pass metabolisme, hvilket ville sandsynligvis ske på deres hydroxylgrupper. Derfor baseret på strukturen af ​​flavonoider, LFG-500 (C

30H

32N

2O

5, fig. 1A) er designet til at forbedre oral biotilgængelighed og forhindre metabolismen af ​​flavonoider ved dens hydroxyl grupper ved at indføre en piperazin og en benzylgrupper. Disse udskiftninger gav også LFG-500 bedre lipid opløselighed, hvilket gør det lettere at komme ind i intracellulære rum. Vores tidligere undersøgelse viste at LFG-500 apoptose gennem en reaktive oxygenarter (ROS) -mitochondrial-medieret vej i HepG2-celler [19]. Da metastase er yderst vigtigt i udviklingen af ​​kræft, er det vigtigt at undersøge virkningen af ​​LFG-500 på cancermetastase og den involverede mekanisme. De deraf følgende resultater kan give nye beviser af anti-cancer aktivitet af LFG-500 samt flavonoider.

(A) Kemisk struktur af LFG-500. (B) Inhiberende virkning af LFG-500 på væksten af ​​MDA-MB-231-celler i 24 timer. MTT-assayet blev anvendt. (C) trypanblå farveeksklusion assay af LFG-500 på væksten af ​​MDA-MB-231-celler. Celler blev behandlet med angivne koncentrationer af LFG-500 i 24 timer. (D) LFG-500 (8 uM) ikke har nogen indflydelse på den normale størrelse og form af celler (x 200, skalalinjen repræsenterer 30 um). (E) Inhiberende virkning af LFG-500 på adhæsion af MDA-MB-231-celler til fibronectin. Cellesuspension (100 ul, 2 × 10

5 celler /ml) blev tilsat til fibronectin præ-coatede plader og inkuberet ved 37 ° C i 1 time. Derefter dyrkningsmedier blev omhyggeligt suget ud. Hver brønd blev vasket tre gange med PBS. MTT assay blev vedtaget for at bestemme antallet af adhærente celler. (F) LFG-500 hæmmer celle migration. Cellemonolaget blev såret af en 200 pi gul pipettespids efterfulgt af behandling med forskellige koncentrationer (2, 4 og 8 uM) af LFG-500 i 24 timer. Antallet af cellerne i det blottede område blev kvantificeret under et omvendt mikroskop. Hvide linjer angiver sårkanten. De migrerede celler på tværs af de hvide linjer blev talt i seks tilfældige felter fra hver behandling. Fotografier af såret af celler behandlet med LFG-500, × 100 (til venstre). Kvantificering af de migrerede celler (højre). (G) LFG-500 inhiberer celleinvasion. Fotografier af invaderede celle plettet af hematoxylin og eosin, × 200 (til venstre). Kvantificering af den invaderede celler (højre).

* P

0,05 eller

** P

. 0,01 repræsenterer signifikant forskel fra kontrolgruppen

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske af dyreforsøg i Kina Farmaceutiske Universitet. Alle operation blev udført under natrium pentobarbital anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Materialer

LFG-500 (99,1% renhed), leveret af professor Zhiyu Li (Kina Farmaceutiske Universitet, Kina), blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) til en koncentration på 10 mM som den primære stamopløsning. Opløsningen blev opbevaret ved -20 ° C og fortyndet med medium før hvert eksperiment. Kontrollerne blev behandlet med den samme mængde af DMSO (0,1%) som anvendt i tilsvarende eksperimenter. For

in vivo

studie, LFG-500 opløsning fremstilles ved School of Pharmacy i Kina Farmaceutiske Universitet. Dacarbazin (DTTC, Nanjing medicinalselskab, Kina) blev vedtaget som den positive kontrol, som blev opløst i 0,9% NaCl før brug. Fibronectin og matrigel blev indkøbt fra BD Biosciences (Bedford, MA, USA) [20]. Antistoffer mod MMP-9 (H-129) (sc-10737), MMP-2 (H-76) (sc-10736), c-Jun (D) (sc-44), c-Fos (4) (sc -52), NF-KB p65 (C-20) (sc-372), Lamin A (133A2) (sc-56.137), IKKα /β (H-470) (sc-7607), IgG (H-270) (sc-66.913), GFP (FL) (sc-8334), p-ERK1 /2 (Thr 177 /Thr 160) -R (sc23759-R), JNK (D-2) (sc-7345), p- JNK (G-7) (sc-6254), p38 (H-147) (sc-7149), p-p38 (Thr 180) (sc-101.758), Akt1 /2/3 (H-136) (sC- 8312), blev β-actin (SC-130.301), og protein A-agarose (SC-2001) opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Antistoffer mod STAT3 (T721) (BS-1336), p-STAT3 (S727) (BS-4180), p-STAT3 (Y705) (BS-4181), ERK1 /2 (L352) (BS1112), PI3K p85α /γ (Y463) (BS-3006), og p-AKT (S246) (BS-4286) blev købt hos Bioworld (St. Louis Park.nneapoli, MN, USA). Antistoffer mod p-IKKα /β (Ser176 /180) (16A6) (# 2697), kBa (44D4) (# 4812), og p-kBa (Ser32) (14D4) (# 2859) var fra Cell Signaling Technology, Inc. . (Beverly, MA, USA). MTT, trypanblåt, gelatine, paraformaldehyd, formaldehyd, glycin, Triton X-100, DAPI, Tris, NaCl, Hepes, KOH, KCI, EDTA, NP-40, PMSF, NaF, SDS, DTT og NaHCO

3 blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

Dyr

Male C57BL /6-mus (6-8 uger gamle), der vejer 20-25 g, blev opnået fra Shanghai Laboratory Animal center (Shanghai, Kina). Dyrene blev holdt i en temperatur og fugtighed kontrolleret miljø med en 12: 12-timers lys /mørke-cyklus. Foder og vand var til rådighed

ad libitum

. Alle dyr eksperimentelle og kirurgiske procedurer blev nøje udføres i overensstemmelse med vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr.

Cell kultur

MDA-MB-231 (en human bryst carcinom cellelinje) og B16F10 (en meget metastatisk murine melanom cellelinje) blev købt fra Cell Bank of Shanghai Institute of Cell Biology (Shanghai, Kina). MDA-MB-231 celler og B16F10 celler blev dyrket i Leibovitzs L15 og DMEM-medium (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), henholdsvis begge indeholder 10% føtalt bovint serum (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ), 100 U /ml penicillin (Beyotime, Nantong, Kina), og 100 mikrogram /ml streptomycin (Beyotime, Nantong, Kina). Cellerne blev holdt i en fugtig atmosfære af 95% luft /5% CO

2 ved 37 ° C.

Kolorimetrisk MTT-assay Salg

Celler (10

4 /brønd) blev podet på Falcon 96-brøndsplader (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) i 24 timer og derefter udsat for forskellige koncentrationer af LFG-500. Efter inkubation i 24 timer, 20 pi 5 mg /ml MTT blev tilsat til mediet, og cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i yderligere 4 timer. Derefter blev dyrkningsmediet bortkastet og 100 pi DMSO blev tilsat til hver brønd for at opløse bundfaldet. Absorbansen (A) blev målt ved 570 nm med en automatiseret Microplated Reader ELx800 (BioTek Instruments, Inc. Winooski, VT, USA). Cellevækstinhiberende rate (I%) blev beregnet ved følgende ligning: hvor A

behandlet og A

kontrol var den gennemsnitlige absorbans af tre parallelle forsøg fra behandlede og kontrolgrupper, hhv. IC

50 blev taget som den koncentration, der forårsagede 50% inhibering af cellevækst og blev beregnet ved Logit metode.

trypanblåt -eksklusionsassay

Efter udsat for LFG-500 ved angivne koncentrationer i 24 timer blev cellerne høstet og blandet med 0,4% trypanblåt. Derefter både ufarvede (levedygtige) og farves (ikke-levedygtige) celler blev talt separat med en celle tællekammer (Qiujing, Shanghai, Kina) under mikroskop. (CX21, Olympus, Tokyo, Japan)

Cell morfologiske vurdering

Celler blev podet i 6 brønds cellekulturplader (Corning, New York, NY, USA) og behandlet med LFG-500 (8 uM) i 24 timer. Ved slutningen af ​​inkubationen blev cellemorfologi monitoreret under anvendelse af et inverteret lysmikroskop (IX51, Olympus Corp., Tokyo, Japan).

celleadhæsionsassay

celleadhæsionsassay blev udført som beskrevet [ ,,,0],20] med modifikationer. Plader med 96 brønde blev overtrukket med fibronectin (5 pg /ml) ved 4 ° C natten over og derefter blokeret i BSA (1%) i 1 time. Serum-udsultede celler blev eksponeret for LFG-500 (2, 4 eller 8 uM) i 24 timer før såning. Målceller blev høstet og suspenderet i serum-frit medium. Cellerne (2 x 10

5 /ml) blev podet til fibronectincoatede plader og derefter inkuberet ved 37 ° C i 1 time. Ikke-adhærente celler blev fjernet ved forsigtig vask med PBS. Derefter blev kolorimetrisk MTT-assay anvendes til at analysere adhæsion cellernes evne.

sårheling assay

Celler blev podet i 6-brønds plade og får lov at vokse til 80% konfluens. Efterfølgende blev cellemonolaget ridset med en pipettespids (Axygen, Union City, CA, USA) for at skabe et smalt sår-lignende hul. Kort efter sårdannelse blev cellerne vasket med PBS to gange og inkuberet med LFG-500 (2, 4 eller 8 uM). Pladerne blev fotograferet ved 0, 12 og 24 timer under anvendelse af et inverteret lysmikroskop. Antallet af migrerede celler blev kvantificeret ved manuel tælling og seks tilfældigt valgte felter blev analyseret for hver brønd [21].

Cell invasion assay

Transwell kammer-system (10 mm diameter, 8 um pore størrelse med polycarbonat membran, Corning Costar, Cambridge, MA) belagt med matrigel blev ansat til at undersøge den invasive evne kræftceller

in vitro

som tidligere beskrevet [22]. Kort beskrevet blev transwell kamre indledningsvist overtrukket med matrigel (40 ug /100 pi /kammer) ved 37 ° C i 1 time. Cellerne behandlet med eller uden LFG-500 (2, 4 eller 8 uM, 24 timer) blev suspenderet i Leibovitz ‘s L15 medium (5 x 10

5 celler /ml) og podet i det øvre rum, mens mediet indeholdende 10% føtalt bovint serum blev tilsat i det nedre rum. Efter inkubering i en fugtig atmosfære af 95% luft /5% CO

2 ved 37 ° C i 24 timer, ikke-besatte celler på den øvre side af membranen blev fjernet med en vatpind. De invaderede celler på bundfladen blev fikseret med 100% methanol og farvet med hematoxylin og eosin (Nanjing Sunshine Biotechnology Ltd., Nanjing, Kina). De invaderede celler blev kvantificeret ved manuel tælling og seks tilfældigt valgte felter blev analyseret for hver gruppe.

gelatinezymografi assay

Celler blev behandlet med eller uden LFG-500 (2, 4 eller 8 uM) i serum-frit medium i 24 timer og derefter supernatanterne blev indsamlet til prøverne. Gelatinezymografi assay blev udført ifølge tidligere metode [16]. Efter behandling blev enzym-fordøjet regioner observeret som hvide bånd mod blå baggrund. Zonerne af enzymatisk aktivitet blev betragtet som negativt farvede bånd.

Real-time PCR-analyse

Celler blev behandlet med LFG-500 (2, 4 eller 8 uM) i 12 timer, og derefter niveauerne af MMP-9 og MMP-2-mRNA blev bestemt. Primersekvenserne syntetiseret af Sangon Biotech Co., Ltd (Shanghai, Kina) blev opført som følger: MMP-9: 5′-GCA GAG GAA TAC CTG TAC CGC-3 ‘(fremad) og 5’-AGG TTT GGA ATC TGC CCA GGT-3 ‘(tilbage); MMP-2: 5’-CAG GCT CTT CTC CTT TCA CAA C-3 ‘(fremad) og 5′-AAG CCA CGG CTT GGT TTT CCT C-3′ (revers); p-actin: 5’-CTG TCC CTG TAT GCC TCT G-3 ‘(fremad) og 5′-ATG TCA CGC ACG ATT TCC-3’ (revers). Reaktionerne blev udført som beskrevet [23]. Prøver blev kørt på ABI 7500 Real-Time PCR-system (ABI, Foster City, CA, USA) på følgende måde: 30 s ved 95 ° C efterfulgt af 40 cykler af 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 34 s . Hver reaktion blev udført tre gange. Tærskelværdierne (CS) for hver mRNA blev trukket fra den for β-actin mRNA, gennemsnit, og konverteret fra log-lineær for lineære udtryk. Data blev analyseret med SDS 2.1 program.

Western blot-analyse

Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af LFG-500 (2, 4 eller 8 uM) i 24 timer, derefter opsamlet og lyseres. Western blotting-analyse blev udført i overensstemmelse med tidligere metoder [24]. Detektion blev udført med Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Inc., Lincoln, NE, USA). Alle blots blev strippet og testet igen med polyklonalt anti-β-actin at verificere lig protein loading.

Fremstilling af cytosolisk og kerneekstrakter

Samlede celler blev lyseret med puffer A (10 mM Hepes-KOH (pH 7,9), 10 mM KCI, 0,1 mM EDTA, 0,5% NP-40, 1 mM DTT og 0,5 mM PMSF) på is i 15 minutter for at tillade celler at svulme op, og derefter centrifugeret ved 14 000 x

g

ved 4 ° C i 15 min. Supernatanterne blev gemt som de cytosoliske fraktioner. De nukleare pellets blev inkuberet med høj salt buffer (20 mM Hepes, 0,5 M KCI, 1 mM EDTA, 1 mM DTT og 1 mM PMSF, pH 7,9) på is i 30 minutter, og derefter centrifugeret ved 12 000 rpm ved 4 ° C i 15 minutter til opnåelse af nukleare fraktioner.

immunfluorescenspåvisningen

Celler blev podet på dækglas og inkuberet med eller uden 8 uM LFG-500 i 24 timer. blev udført følgende trin som beskrevet [24] med modifikationer. Celler blev fikseret med 4% paraformaldehyd i PBS ved 1-timers intervaller, permeabiliseret med 0,5% Triton X-100, og blokeret med 2% BSA i 30 min. Inkubation med primært antistof mod NF-KB p65 (fortyndet 1:50) blev udført natten over ved 4 ° C. Efter vask blev cellerne sekventielt udsat for FITC-konjugerede sekundære antistoffer (1:1000, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA, L42001) og DAPI. Billeder blev observeret og taget med en konfokal laser scanning mikroskop (FV1000, Olympus, Tokyo, Japan)

Elektroforetisk mobilitet (EMSA)

Cellerne blev behandlet med 2, 4 og 8. pM LFG-500 i 24 timer. De DNA-bindende aktiviteter NF-KB i kerneekstrakter blev vurderet ved EMSA [25] ved hjælp af EMSA kit (Beyotime, Nantong, Kina) med biotinmærkede dobbelt-strenget NF-KB-oligonukleotider (Beyotime, Nantong, Kina). Sekvenserne af oligonukleotiderne vedtagne var som følger: 5′-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3 ‘og 3′-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5’. Kort fortalt blev kerneekstrakter (6 ug /prøve) inkuberes med oligonukleotiderne i reaktionen buffere til 30 min. Protein-DNA-komplekser blev separeret på en 6% denaturerende acrylamidgel, overført til positivt ladet nylonmembraner, og tværbundet i en Stratagene krydsbinder. Band skift blev detekteret ved kemiluminescens-metoden med Chemidoc XRS + System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

chromatin immunoprecipitation (chip) assay

Celler blev inkuberet med LFG-500 ( 2, 4 eller 8 uM) i 24 timer, og derefter chip assay blev udført som beskrevet [26] med nogle modifikationer. Kort fortalt blev cellerne tværbundet med formaldehyd, standset med glycin, sonikeret på is og centrifugeret ved 4 ° C. Portioner af lysater indeholdende 200 ug protein blev anvendt til hver immunfældning reaktion med anti-NF-KB p65 eller præ-immunt IgG. Blandingerne blev roteret ved 4 ° C natten over og derefter inkuberet med protein A-agarose i 6 timer. Endelig blev de tilfangetagne immunkomplekser elueret med elueringsbuffer (1% SDS og 0,1 M NaHCO

3) ved 37 ° C i 30 minutter. Protein-DNA-tværbindinger blev tilbageført ved 65 ° C i 4 timer i en buffer med højt saltindhold (0,2 M NaCl, 50 mM Tris, pH 6,5, 10 mM EDTA og 0,2 mg /ml proteinase K). Ekstraheret og opløst immunopræcipiteret DNA blev kvantificeret ved realtids-PCR-analyse med primere omfatter de NF-KB-bindingssteder. Primerne for MMP-9 promotor kvantificering var 5′-CAG TGG AAT TCC CCA GCC TTG FTT-3 ‘og 5′-CCA CAC TCC AGG CTC TGT CCT C-3’.

Cell transfektion og NF KB-afhængigt reportergen-ekspression assay

virkningen af ​​LFG-500 på NF-KB-afhængigt reportergen transkription blev analyseret ved luciferasereportergen assays [27]. Celler (5 x 10

5 celler /brønd) blev podet på plader med 6 brønde. Derefter pnf-KB-luc (Beyotime, Nantong, Kina) indeholdende fire NF-KB-bindende motiver (GGGAATTTCC) blev transient transficeret i cellerne under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen Inc., Grand Island, NY, USA), i henhold til producentens instruktion. Den pCDNA3.2 plasmid blev tilsat for at gøre den totale mængde DNA svarende (4 ug /brønd i en 6-brønds plade) med GFP tjente som normalisering kontrol. Efter LFG-500 (2, 4 eller 8 uM) behandling i 24 timer blev luciferaseassays udført med luciferasereportergenet Assay kit (Promega, Madison, WI, USA) under anvendelse Luminoskan opstigning (Thermo, Waltham, MA, USA) .

In vivo tumormetastase assay

B16F10 melanom celler blev opsamlet til en passende koncentration i PBS og injiceret via halevenen i syngene C57BL /6-mus. Musene blev ligeledes randomiseret i fem grupper (10 mus /gruppe): 0,9% normalt saltvand kontrolgruppen, DTTC 100 mg /kg /2 dage positive kontrolgruppe, LFG-500 12,5 mg /kg /dag gruppe, LFG-500 25 mg /kg /dag gruppe, og LFG-500 50 mg /kg /dag gruppe. Efter inokulering i 24 timer blev musene injiceret intraperitonealt med testforbindelser i 21 dage. Derefter blev musene vejet og aflivet. Hvide blodlegemer (WBC) blev analyseret af Sysmex K-4500 hæmatologianalysator (Sysmex Inc., Kobe, Japan). Lungerne blev fjernet og vasket med PBS. Antallet af overfladevand tumor knuder blev talt under et dissektionsmikroskop [20].

Statistisk analyse

Alle data i de forskellige eksperimentelle grupper udtrykkes som middelværdien ± S.E.M. De viste data blev opnået fra mindst tre uafhængige forsøg. Forskelle mellem grupperne blev vurderet ved envejs ANOVA og Dunnetts post hoc test. Signifikante forskelle var repræsenteret

* P

0,05 eller

** P

. 0,01

Resultater

LFG-500 hæmmer vedhæftning, migration og invasion af MDA-MB-231-celler in vitro

MTT assay viste, at cellevækst faldt systematisk med stigende koncentrationer af LFG-500 (fig. 1B). IC

50 værdien af ​​LFG-500 på MDA-MB-231-celler i 24 timer var 15,67 ± 0,82 uM. Imidlertid LFG-500 (op til 8 uM) havde ingen tydelig indflydelse på væksten af ​​MDA-MB-231-celler (fig. 1B), hvilket blev bekræftet ved trypanblåteksklusion farvestof-assay (fig. 1C). Cellemorfologi undersøgelse viste også, at LFG-500 (8 uM) ikke påvirkede den normale størrelse og form af celler (fig. 1D). Derfor 8 uM LFG-500 blev bestemt som den højeste koncentration for de efterfølgende eksperimenter.

tumormetastase sker gennem en kompleks række af begivenheder. Tumorceller udviser en række egenskaber, herunder ændrede klæbeevne, øget motilitet og invasive kapacitet, for at fuldføre den metastatiske proces [28]. Derfor, for at tumorcelleadhæsion ECM og basalmembran betragtes som et grundlæggende skridt for kræft metastaser. Vi undersøgte indflydelsen af ​​LGF-500 på den klæbende evne MDA-MB-231 celler til substraterne forhånd overtrukket med fibronectin, vigtige bestanddele af ECM. LFG-500 behandling (4 og 8 uM) undertrykte MDA-MB-231 celler adhæsion til fibronectin ved 33,6 ± 8,6% (n = 3,

P

0,05) og 42,7 ± 9,1% (n = 3 ,

P

. 0,05), (fig 1E). Desuden detekteres effekterne af LFG-500 på cellemigration og invasion. Som vist i fig. 1F, de migrerede celler på tværs af sårede rum blev reduceret med 41,2 ± 8,4% (n = 3,

P

0,05), 64,9 ± 9,2% (n = 3,

P

0,01), henholdsvis når cellerne blev behandlet med 2, 4 og 8 uM LFG-500 i 24 timer. Desuden LFG-500 (4 og 8 uM) reducerede invasionen evne MDA-MB-231 celler ved 51,9 ± 9,3% (n = 3,

P

0,05) og 74,7 ± 10,2% ( n = 3,

P

. . 0,01), (fig 1G)

LFG-500 undertrykker aktiviteten og ekspressionen af ​​MMP-2/9 i MDA-MB-231 celler

MMP-2/9, secerneres og aktiveres af cancerceller, hydrolyserer basalmembranen og ECM, hvilket letter invasion af maligne celler og resulterer i metastase [29]. At udforske den mulige anti-metastaser mekanisme LFG-500, den gelatinolytiske aktivitet af MMP-2/9 udskilt fra MDA-MB-231 celler blev påvist efter LFG-500 behandling. Som vist i fig. 2A, LFG-500 (8 uM) tydeligvis undertrykt aktiviteten af ​​MMP-2 og MMP-9, med hæmning satser af 62 ± 8,2% (n = 3,

P

0,01) og 81 ± 7,9 % (n = 3,

P

0,01), hhv. Desuden er den inhiberende virkning på aktiviteten af ​​MMP-9 blev mere markant.

(A) LFG-500 inhiberer aktiviteten af ​​MMP-2/9 i MDA-MB-231-celler. Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer (2, 4 og 8 uM) af LFG-500 i 24 timer. De konditionerede medier blev opsamlet, og derefter MMP-2/9-aktivitet blev bestemt ved gelatinezymografi assay. (B) LFG-500 sænker niveauerne af MMP-2/9 mRNA. Celler blev inkuberet med angivne koncentrationer af LFG-500 i 12 timer. MRNA-niveauer blev detekteret ved real-time PCR-analyse. (C) LFG-500 undertrykker protein ekspression af MMP-2/9. MDA-MB-231-cellelysater blev underkastet immunblotting med antistoffer mod MMP-2 (1:400) og MMP-9 (1:400).

* P

0,05 eller

** P

. 0,01 repræsenterer signifikant forskel fra kontrolgruppen

For yderligere at forstå ned-regulering virkninger af LFG-500 på MMP-2 og MMP-9, blev udført realtids-PCR-analyse. Som vist i fig. 2B, inhibering af genekspression blev iagttaget naturligvis, med niveauet af MMP-2 mRNA reduceret med 47,5 ± 9,5% (n = 3,

P

0,05) og MMP-9 mRNA faldt med 68,1 ± 7,1% (n = 3,

P

0,01), henholdsvis efter behandlingen af ​​8 uM LFG-500 i 12 timer. De LFG-500-medierede ændringer i niveauerne af MMP-2 og MMP-9 mRNA var i overensstemmelse godt med deres proteinekspression, som påvist ved Western blot-analyse (fig. 2C). Disse resultater indikerede, at LFG-500 kan regulere MMP-2/9 på det transskriptionelle niveau. Endnu vigtigere er, de hæmmende virkninger på MMP-9 var mere mærkbar.

LFG-500 undertrykker celle invasion gennem hæmme transkriptionelle aktivering af NF-KB og efterfølgende MMP-9-aktivitet

Det er generelt rapporterede, at transkriptionel regulering ved at aktivere transkriptionsfaktorer, herunder AP-1 [30], STAT3 [31], eller NF-KB [32] forekommer under modulationen af ​​MMP-9-genekspression. For yderligere at klarlægge den mekanisme bag LFG-500 undertrykke MDA-MB-231 celle invasion, undersøgte vi effekten af ​​LFG-500 på disse transkriptionsfaktorer. Dataene i fig. 3A viste, at LFG-500 havde nogen væsentlig indvirkning på de nukleare niveauer af c-Jun eller c-Fos (komponenter af AP-1). Desuden var der ingen synlig ændring i phosphorylering af STAT3 når givet den samme behandling (fig. 3A). Imidlertid LFG-500 inhiberede nukleare translokation af NF-KB p65, med en nedsat nuklear plan, men en øget cytoplasmatisk niveau (fig. 3B), hvilket blev bekræftet ved immunofluorescens assay (fig. 3C). Desuden blev den totale mængde af NF-KB p65 faldet efter LFG-500 behandling (fig. 3D). Af den grund, NF-KB-aktivering skyldes hurtig phosphorylering, ubiquitinering, og i sidste ende proteolytisk nedbrydning af IKB [33], samt IKK er påkrævet for phosphorylering af IKB [34], phosphoryleringsniveauerne af IKKα /β og kBa blev påvist . LFG-500 (4 uM og 8 uM) hæmmede effektivt phosphorylering af IKKα /β og kBa, mens de samlede steady state-niveauerne forblev uændret (fig. 3D). Disse resultater indikerede, at NF-KB i stedet for AP-1 eller STAT3 kan være involveret i den anti-invasiv virkning induceret af LFG-500.

(A) LFG-500 har ingen væsentlig indvirkning på AP-1 eller STAT3. Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer (2, 4 og 8 uM) af LFG-500 i 24 timer. De nukleare niveauer af proteinerne blev påvist ved Western blot assay ved anvendelse af specifikke antistoffer. Lamin-A blev anvendt som kontrol nuklear loading. (B) LFG-500 inhiberer nukleare translokation af NF-KB. Cytosoliske og nukleare ekstrakter i cellerne blev fremstillet ifølge “Materialer og metoder”. De nukleare og cytoplasmiske niveauer af NF-KB p65 blev bestemt ved Western blot-assay. (C) Den inhiberende virkning af LFG-500 på den nukleare translokation af NF-KB. MDA-MB-231 celler blev immunfarvet med anti-NF-KB p65 (1:50) og DAPI (× 400, skalalinjen repræsenterer 30 um). (D) Virkningerne af LFG-500 på phosphoryleringsniveauerne af IKKα /β og kBa. Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer (2, 4 og 8 uM) af LFG-500 i 24 timer, og ekspressionen af ​​målproteiner blev detekteret ved Western blotting under anvendelse af specifikke antistoffer, hvor β-actin blev anvendt som ladningskontrol.

* P

0,05 eller

** P

. 0,01 repræsenterer signifikant forskel fra kontrolgruppen

Efterfølgende DNA-bindende aktivitet omplantes NF-KB blev yderligere bedømt.

In vitro

blev kerneekstrakterne inkuberet med DNA-prober specifikke for NF-KB, og deres binding blev vurderet ved mobilitetsskift. Som vist i fig. 4A, LFG-500 bemærkelsesværdigt blokerede DNA-bindende aktivitet af NF-KB. For yderligere at bekræfte dette resultat blev ChIP assay udført for at teste bindingsaktiviteten af ​​NF-KB til promotoren af ​​MMP-9, som er NF-KB målgen. Resultaterne viste, at bindingsaktiviteten signifikant inhiberet efter LFG-500 behandling (fig. 4B). Fordi DNA-binding alene er ikke altid korrelerer med NF-KB-afhængig gentranskription [35], blev virkningerne af LFG-500 på NF-KB-afhængig reporter aktivitet også analyseret. MDA-MB-231-celler blev co-transficeret med GFP og pnf-KB-Luc plasmider. LFG-500 tydeligvis undertrykt luciferaseaktivitet, med omkring en 3 gange formindskelse følgende 8 uM af behandlingen (fig. 4C). Som vist i fig. β-actin blev anvendt som en loading kontrol.