PLoS ONE: stromacellers positivt og negativt modulerer væksten af ​​kræftceller: Stimulering via PGE2-TNF-IL-6 Pathway og Hæmning via Udskilt GAPDH-E-Cadherin Interaktion

Abstrakte

fibroblast-lignende stromaceller modulere kræftceller gennem udskilles faktorer og vedhæftning, men disse faktorer er ikke fuldt forstået. Her har vi identificeret kritiske stromale faktorer, der modulerer kræft vækst positivt og negativt. Ved hjælp af en celle co-kultursystem, fandt vi, at gastriske stromale celler secernerede IL-6 som vækstfremmende og overlevelsesfaktor for gastriske cancerceller. Desuden gastriske cancerceller secerneret PGE2 og TNFa, der stimulerede IL-6-sekretion af stromacellerne. Endvidere fandt vi, at stromale celler udskilte glyceraldehyd 3-phosphatdehydrogenase (GAPDH). Ekstracellulær GAPDH, eller dets N-terminale domæne, inhiberede gastrisk cancercellevækst, en konstatering bekræftes i andre cellesystemer. GAPDH bundet til E-cadherin og nedreguleret mTOR-p70S6 kinase pathway. Disse resultater viser, at stromale celler kan regulere cancercellevækst gennem balancen mellem disse udskilte faktorer. Vi foreslår, at negativ regulering af cancervækst hjælp GAPDH kunne være en ny anti-cancer strategi

Henvisning:. Kawada M, Inoue H, Ohba S-i, Yoshida J., Masuda T, Yamasaki M, et al. (2015) stromacellers positivt og negativt modulerer væksten af ​​kræftceller: Stimulering via PGE2-TNF-IL-6 Pathway og Hæmning via Udskilt GAPDH-E-Cadherin Interaction. PLoS ONE 10 (3): e0119415. doi: 10,1371 /journal.pone.0119415

Academic Redaktør: Hiroshi Shiku, Mie University Graduate School of Medicine, JAPAN

Modtaget 2 oktober, 2014 Accepteret: 13 januar 2015; Udgivet: 18 Marts 2015

Copyright: © 2015 Kawada et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af MEXT KAKENHI Grant Number 23112522. den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller tilberedning af manuskriptet

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

tumorvæv er sammensat af kræftceller og omgivende stroma. Stroma indeholder forskellige typer af celler indlejret i en matrix, såsom makrofager, endotelceller immunceller og fibroblastlignende stromaceller [1, 2]. Stromacellerne udviser fænotypisk plasticitet skiftende mellem fibroblastiske og myofibroblastisk egenskaber [3, 4]. Myofibroblaster udtrykker vimentin og glatmuskel α-actin (SM-α-actin) [1] har en høj evne til at secernere vækstfaktorer, ECM-proteiner, og proteinaser [1, 5] og kaldes reaktiv stroma eller cancerassocierede fibroblaster (cafeer ) [5, 6]. Da myofibroblastdifferentiering indholdet af tumorvæv korrelerer godt med dårlig prognose for visse kræftformer [7], stromaceller, især myofibroblaster, er signifikant involveret i udviklingen af ​​cancer. De seneste rapporter har afklaret rolle stromale celler i opretholdelsen af ​​cancer stamceller [8], metastatisk nicher [9, 10], og kemoresistens [11, 12]. På grund af sådanne voksende beviser, er stromaceller blive et attraktivt mål for anti-cancer-strategier.

Stromaceller regulere væksten af ​​kræftceller positivt og negativt gennem udskilles faktorer og vedhæftning [1, 5, 6, 13- 17]. Forskellige vækstfaktorer, såsom hepatocytvækstfaktor (HGF) [18], insulin-lignende vækstfaktor-I (IGF-I) [19], og fibroblastvækstfaktor-7 (FGF-7) [20] secerneres fra stromaceller . På den anden side, cancerceller også secernerer forskellige faktorer for at ændre eller “uddanne” stromaceller at forbedre deres mikromiljø. Transformerende vækstfaktor-β1 (TGF-β1) er en af ​​sådanne faktorer og stimulerer fibroblaster til at differentiere til myofibroblasts [1, 3]. Afhandlinger faktorer og interaktioner mellem cancerceller og stromaceller forskellige i hvert cancer og er således ikke helt forstået [21].

Vi har studeret tumor-stromale celle-interaktioner under anvendelse af co-kultursystemer af begge celler [22] . Mens prostata stromale celler øger væksten af ​​prostata kræftceller ved samtidig injiceret i nøgne mus [19], vores

in vitro

co-dyrkningsmetode efterligner

in vivo

resultater [22]. Under anvendelse af denne model har vi fundet, at IGF-I secerneres fra prostata stromaceller og spiller en kritisk rolle ved prostatacancer udvikling [19]. Endvidere har vi brugt den

in vitro

co-dyrkningssystem som et screeningsassay til identifikation af forbindelser, som udøver anti-cancer aktivitet gennem modulering af tumor-stromale celle-interaktioner. Som følge heraf har vi opdaget mange forbindelser fra naturlige kilder, såsom dyrkede bouillon af bakterier og svampe [23-26]. Blandt dem, phthoxazolin A og leucinostatin A findes at inhibere sekretion af IGF-I fra prostata stromaceller og undertrykke væksten af ​​prostatacancerceller i nærvær af stromaceller [23, 24]. På den anden side, NBRI16716A hæmmer væksten af ​​prostata cancerceller i en xenograft model [26], men det påvirker ikke sekretionen af ​​IGF-I fra prostata stromaceller. Vores foreløbige eksperimenter antyder, at NBRI16716A kunne stimulere stromaceller til at udskille uidentificerede tumor undertrykkende faktorer. Således er disse resultater tyder stærkt på, at vi kan styre cancerudvikling ved modulering af tumor-stromale celle-interaktioner.

I denne undersøgelse undersøgte vi interaktionerne under anvendelse gastrisk cancer som model. Vi har identificeret kritiske faktorer, der modulerer væksten af ​​kræftceller positivt og negativt. Disse resultater tyder på nye anti-cancer-strategier.

Materialer og metoder

Cellelinjer og reagenser

Menneskelig prostatakræft DU-145 celler, human tyktarmskræft DLD-1 celler, humane pancreatiske cancercellelinier MiaPaCa2, BxPC-3, Capan-1 og Panc-1 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). Human prostatacancer PC-3-celler og humane embryonale nyre 293-celler blev opnået fra DS Pharma. LNCaP-CR-cellelinje [27] blev etableret i vores laboratorium fra human prostatacancer LNCaP-celler (DS Pharma). Andre cancer cellelinjer blev beskrevet andetsteds [28, 29]. Alle cancercellelinier blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) (Nissui) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, Sigma), 100 enheder /ml penicillin G (Invitrogen), og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen) ved 37 ° C med 5% CO

2. Hs738 humane gastriske stromale celler (CRL-7869), CCD-18Co human colon fibroblaster (CRL-1459) og Hs371 brystkirtel fibroblaster (CRL-7256) blev opnået fra ATCC. NHLF normale humane lungefibroblaster og PRSC humane prostata stromale celler blev opnået fra BioWhittaker. PS humane pancreas stromale celler blev opnået fra DS pharma. Alle stromaceller blev opretholdt i DMEM suppleret med 10% FBS, 100 enheder /ml penicillin G, 100 ug /ml streptomycin, ITH (5 ug /ml insulin, 5 ug /ml transferrin, og 1,4 uM hydrocortison), og 5 ng /ml basisk FGF (PeproTech) ved 37 ° C med 5% CO

2 som beskrevet [22].

anti-pan-cytokeratin (sc-8018), anti-STAT3 (sc-8019), anti-GAPDH (sc-47.724), anti-PAI-1 (sc-8979), anti-p70S6 kinase (sc-230), anti-14-3-3 epsilon (sc-1020), og anti-phospho-MAPK (sc-7383) antistoffer blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology. Anti-vimentin (V2258), anti SM-α-actin (A2547), anti-α-tubulin (T9026), anti-fos- (tyr705) -STAT3 (SAB4300033), anti-RPL-18A (HPA055259), og anti-FLAG M2 (F3165) antistoffer, kanin muskel GAPDH (G2267) og human erythrocyt GAPDH (G6019) blev indkøbt fra Sigma. Anti-phospho-Ser /Thr-kinase substrat (9614 og 9624), anti-ribosomale protein S6 (RPS6) (2217), anti-phospho- (Ser235 /236) -RPS6 (2211), anti-phospho- (Ser240 /244 ) -RPS6 (2215), anti-phospho- (Ser473) -Akt (9271), anti-phospho- (Thr389) -p70 S6 kinase (9234), anti-phospho- (Tyr416) ​​-Src familie (2102), anti -phospho- (Thr172) -AMPKα (2535), anti-Myc (2278), anti-caveolin-1 (3267), og anti-β-catenin (9562) antistoffer blev indkøbt fra Cell Signaling Technology. Anti-phospho-14-3-3-antistof blev købt fra Abgent. Anti-phospho- (Tyr705) -STAT3 (612.356) antistof blev købt hos BD Biosciences. Anti-RPL-18A antistof blev købt fra Abcam. Anti-humant IL-6 neutraliserende antistof (MAB206), rekombinant humant IL-6 (206-IL), og rekombinant human CXCL1 (275-CR /CF) blev indkøbt fra R Sigma) som beskrevet [32] eller måling GFP-fluorescens intensitet (excitation ved 485 nm og emission ved 538 nm) ved lysis af celler i 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,9 mM CaCI

2, og 1% Triton X-100. Til co-kultur eksperimenter blev Hs738 celler først podet i plader med 96 brønde ved 5 x 10

3 celler per brønd i 0,1 ml DMEM suppleret med 1% D-FBS og ITH. Testprøver blev tilsat til brøndene, og cellerne blev dyrket i 2 dage. Derefter blev 10 pi af en gastrisk cancer cellesuspension (5 x 10

3) i serumfrit DMEM tilsat til monolaget af Hs738 celler og cellerne blev yderligere dyrket i 3 dage. For monokultur af gastriske cancerceller, blev assaymediet alene med en testprøve først inkuberet i 2 dage, og derefter gastriske cancerceller blev tilsat som beskrevet ovenfor og yderligere dyrket i 3 dage. Væksten af ​​gastriske cancerceller blev bestemt måling GFP-fluorescens intensitet. For suspensionskultur blev celler podet i en 96-brønds suspensionskultur plade (MS-8096R, Sumilon) til sammenligning med en standard dyrkningsplade (MS-8096F; Sumilon). For Transwell eksperimenter, 0,6 ml Hs738 celler (5 x 10

4 celler /ml) i DMEM suppleret med 1% D-FBS og ITH var først tilsat til ydre brønde i Transwell-plader med 0,4 um porestørrelse membraner (3470; Corning) og 0,1 ml af assaymedium sættes til de indre brønde. Efter 2 dages dyrkning, 10 pi af en gastrisk cancer cellesuspension (5 x 10

3) i serumfrit DMEM blev tilsat til de indre brønde og pladerne blev yderligere dyrket i 3 dage.

Fremstilling af Hs738 konditioneret medium (CM) Salg

Hs738 celler blev dyrket på 5 x 10

4 celler /ml i DMEM suppleret med de angivne koncentrationer af D-FBS og ITH for de angivne dage. De dyrkede supernatanter blev opsamlet ved centrifugering. At koncentrere mediet blev Amicon Ultra-15-3K centrifugalfilter enheder (Millipore) eller 2-D clean-up kit (Amersham Biosciences), der anvendes. Gastriske cancerceller (3 x 10

5) blev inokuleret i 1 ml CM af Hs738 celler eller assaymedium alene i 35 mm skåle og dyrket i 1 dag. Cellerne blev vasket med PBS og cellelysaterne blev fremstillet til Western blotting.

Proteomanalyse af CM

Til identificering af phosphorylerede proteiner fra gastriske cancerceller, MKN-7 cellelysater blev anvendt på en HiTrap Q FF kolonne (GE Healthcare) præinstalleret med 50 mM Tris-HCI pH 7,3. Proteiner blev elueret ved trinvise stigninger af NaCI-koncentrationer. Efter eluering blev proteasehæmmere og pyrophosphat hvormed de eluerede fraktioner. De eluerede fraktioner blev separeret ved SDS-PAGE, og gelerne blev farvet med Coomassie brilliant blå (CBB), og bånd svarende til båndene af Western blots opnået med anti-phospho-Ser /Thr-antistof blev udskåret. Det udskårne bånd blev spaltet med trypsin, og de spaltede peptider blev derefter underkastet LC-MS /MS-analyse (LTQ-Orbitrap; Thermo Scientific). Til identifikation af vækstinhiberende proteiner i Hs738 CM, CM (50 ml) blev opkoncentreret ved anvendelse af Amicon Ultra-15-3K centrifugal filteranordninger og påført på en Superdex 200 10/300 GL-søjle (GE Healthcare) for gelfiltrering. Proteiner blev elueret af PBS og effekten af ​​de fraktioneres proteiner på væksten af ​​MKN-7-celler blev bestemt. Fraktionerne med vækstinhiberende aktivitet blev samlet og yderligere adskilt ved 2D-gelelektroforese. Steder af interesse blev fjernet, fordøjet med trypsin, og derefter udsat for LC-MS /MS eller MALDI-TOF-MS-analyse (APRO Life Science Institute).

Cytokine analyse

Celler blev dyrket ved 5 x 10

4 celler /ml i DMEM suppleret med 1% D-FBS og ITH i 2 dage. CMS blev opsamlet ved centrifugering og mængderne af IL-6, IL-6SR, og CXCL1 blev bestemt ved anvendelse af et humant IL-6-ELISA-kit (Thermo Scientific), et humant IL-6SR Quantikine (R RayBio). Mængderne af PGE2, 6-keto PG blev thromboxian B

2, og leukotrien B4 bestemmes ved hjælp af kvantitative kits fra Cayman.

Immunhistokemi

væv arrays blev afparaffiniseret i xylen og rehydreret i faldende alkoholer i vand. Derefter blev vævsarrays dyppet i 3% H

2O

2 for 13 min og kogt i 10 mM citronsyre (pH 6,0) i 15 min. Immunhistokemisk farvning blev udført med anti-phospho- (Tyr705) -STAT3 (SAB43000033) under anvendelse ImmPRESS anti-kanin Ig-peroxidase (Vector Laboratories) og IMMPACT DAB-substrat (Vector Laboratories). Den anslåede visuelle intensitet phospho-STAT3 immunfarvning blev gradueret på en vilkårlig tre points skala:. Negativ, svagt positive, og positiv

GAPDH aktivitet

GAPDH aktivitet blev målt som beskrevet [33]. Alle reagenser blev købt fra Sigma.

Konstruktion af rekombinant GAPDH

Human rekombinant vildtype GAPDH og mutant GAPDH blev konstrueret som beskrevet [34], med modifikationer, som følger. Totalt RNA blev isoleret fra Hs738 celler under anvendelse af RNeasy Minikit (Qiagen). CDNA’et blev syntetiseret under anvendelse af AMV-revers transkriptase (Promega) og fuldlængde humant GAPDH cDNA-fragment, der indeholder

Nhe

I og

Xho

jeg sites blev genereret ved PCR under anvendelse PfxDNA polymerase (Invitrogen) og sense primer 1 (5′-TATGCTAGCGACTACAAGGACGACGACGACAAGATGGGGAAGGTGAAGGTCGGAG-3 ‘) og antisense-primer 2 (5′-TATCTCGAGTTACTCCTTGGAGGCCATGTGGG-3’).

Nhe

I /

Xho

Jeg fragment af GAPDH blev indsat i pET-17b vektor (Novagen). For mutant GAPDH (C152S) blev fragment 1 dannet ved PCR under anvendelse af sense-primer 1 og antisense-primer 3 (5′-AGGGGTGCTAAGCAGTTGGTGGTGGAGGAGGCATTGCTGATGATCTTGA-3 ‘) og fragment 2 blev genereret ved PCR under anvendelse af sense-primer 4 (5′-TCAAGATCATCAGCAATGCCTCCTCCACCACCAACTGCTTAGCACCCCT-3’) og antisense-primer 2. Den fuldlængde mutant GAPDH-fragment blev genereret ved PCR under anvendelse af sense-primer 1, antisense-primer 2 og fragmenter 1 og 2 som skabeloner.

Nhe

I /

Xho

Jeg fragment af mutant GAPDH blev også indsat i pET-17b vektor. Deletionsmutanter af GAPDH blev konstrueret ved omvendt PCR under anvendelse af en KOD-Plus-mutagenese kit (Toyobo) og primersæt for DEL1, 5′-gcagttggtggtgcaggaggcatt-3 ‘og 5′-gacaacgaatttggctacagcaac-3′, for DEL2, 5’-ATCAAGTGGGGCGATGCTGGCGCTGAGTA- 3 ‘og 5′-CTTCCCCATCTTGTCGTCGTCGTCCTT-3′, og for del3, 5’-CTCCACGACGTACTCAGCGCCAG-3 ‘og 5′-accaccaactgcttagcacccctg-3’. Vektorerne blev transficeret ind BL21 (DE3)

E

.

coli

(Promega) eller ClearColiBL21 (Lucigen) og N-terminal FLAG-mærket human vildtype og mutant GAPDH blev oprenset under anvendelse af anti-FLAG M2 agarose (Sigma). Det delvist oprensede GAPDH blev yderligere renset ved gelfiltrering (GE Healthcare) og endotoksin fjernelse harpiks (Thermo Scientific).

Binding af GAPDH til cellemembraner Salg

Cellemembraner blev fremstillet ved anvendelse ProteoExtract kit (Calbiochem ). Cellemembranerne blev inkuberet med human erythrocyt GAPDH ved 5 U /ml eller FLAG-mærket humant rekombinant wt GAPDH ved 5 ug /ml i 2 timer ved stuetemperatur (RT) og immunpræcipiteret med anti-GAPDH-protein G agarose kompleks eller anti- FLAG M2 agarose hhv. Immunopræcipitaterne blev analyseret ved Western blotting.

Binding af GAPDH til rekombinant E-cadherin

En plade med 96 brønde blev overtrukket med 100 pi humant rekombinant E-cadherin Fc-kimæren (648-EF- 100, R Thermo Scientific). Eller Western blotting

Real time RT-PCR

Hs738 celler blev dyrket i 2 dage ved 5 x 10

4 celler /ml i DMEM suppleret med 1% D-FBS og ITH i nærvær af MEK-inhibitor I. Samlet RNA blev isoleret under anvendelse af RNeasy Minikit ( Qiagen). cDNA’er blev syntetiseret under anvendelse af AMV-revers transkriptase og tilfældige primere (Promega) fra 1 ug RNA. Real time RT-PCR blev udført på en termisk cykliseringsapparat Dice Real Time System (Takara) ved hjælp af SYBR Premix Ex TaqII (Takara). Specifikke primere blev indkøbt fra Takara.

exosome forberedelse

Exosomer blev fremstillet ud fra den dyrkede supernatant af Hs738 celler som beskrevet [38].

Statistisk analyse

Alle data er repræsentative for mindst 3 uafhængige forsøg med lignende resultater. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Students

t

-test.

Resultater

Gastric stromaceller modulere væksten af ​​gastriske kræftceller

Vi etablerede menneskelig gastrisk cancercellelinier som udtrykte grønt fluorescerende protein (GFP) (S1A fig.). Indstilling samme organ, vi anvendte humane gastriske stromale celler (Hs738 celler), der var en blanding af myofibroblaster (vimentin (+) og SM-α-actin (+)) og fibroblaster (vimentin (+) og SM-α-actin ( -)) (S1B fig), der lignede andre stromale celler [4, 24].. Alle 5 gastrisk cancer cellelinjer dannet tumorer, når de injiceres subkutant i nøgne mus (fig. 1A), men co-injektion af Hs738 celler undertrykte signifikant tumorerne af MKN-1, MKN-7-celler, og MKN-28-celler (fig. 1A ). I modsætning hertil blev væksten af ​​tumorer dannet af MKN-45 og MKN-74-celler forøges ved nærvær af Hs738 celler (Fig. 1A). Vi kunne ikke detektere metastaser af kræftcellerne efter subkutan inokulation, men alle cancercellelinier udviste metastaser i bughulen, når det injiceres ind i maven orthotopisk (S2 Fig.). Størrelserne af de primære tumorer initieret af kræft cellelinjer injiceret alene i maven afveg ikke signifikant. Men tallene og hyppighed for metastatiske foci tendens til at være højere med MKN-45 og MKN-74 celler (dårligt eller moderat differentierede celler) og lavere i MKN-1, MKN-7 og MKN-28 celler (godt-opdelte cellelinjer [39]) (S2 fig.). Disse resultater viste, at væksten af ​​godt differentierede gastrisk cancer cellelinjer blev undertrykt af gastriske stromaceller og væksten af ​​ikke-differentierede gastriske cancer cellelinjer med høje metastatiske evner blev forøget med gastriske stromaceller. Da det foreslås der forskellige mekanismer i tumoren-stromale celle interaktioner af gastrisk cancer, har vi forsøgt at belyse dem i denne undersøgelse.

(A) mavekræft celler blev injiceret subkutant med eller uden Hs738 gastrisk stromale celler i nøgne hunmus. Musene blev aflivet 37, 35, 34, 22, og 33 dage efter injektion af MKN-1, 7, 28, 45 og 74 gastriske cancerceller henholdsvis og tumorerne blev udskåret. Værdierne er middelværdier ± s.d. (N = 6). (B) MKN-7 og MKN-74 gastriske cancerceller blev dyrket alene (Mono) eller co-dyrket med Hs738 celler ved forhold (gastrisk cancer: Hs738) 1: 1 og 1: 2 under de angivne koncentrationer af D-FBS. Væksten af ​​kræftceller blev bestemt måling GFP-fluorescens intensitet. Værdierne er middelværdier ± s.d. (N = 3). Repræsentative mikrofotografier i 1% D-FBS under fluorescensmikroskopi. Grøn; GFP. Scale bar er 200 um.

For at studere tumor-stromale celle-interaktioner, vi først udviklet en

in vitro

co-kultur-system af gastrisk cancer cellelinjer og Hs738 celler som beskrevet før [22]. For at måle væksten af ​​cancerceller selektivt i co-kultur med stromale celler anvendte vi GFP-transficerede gastriske cancercellelinier (S1A Fig.). GFP fluorescensintensiteter i lyserede celler korrelerede godt med celletal samt MTT-assays (S1c Fig.). For at reducere indflydelsen af ​​vækstfaktorer i FBS anvendte vi dialyseret FBS (D-FBS). Når de gastriske cancercellelinier blev co-dyrket med Hs738 celler, vækst af MKN-1, MKN-7 og MKN-28-celler blev undertrykt ved tilstedeværelsen af ​​Hs738 celler (Fig. 1B og S3 Fig.). Mens væksten af ​​MKN-45-celler ikke blev ændret ved samtidig dyrkning blev den af ​​MKN-74-celler forøges ved co-dyrkning med Hs738 celler især ved lavere koncentrationer af D-FBS (fig. 1B og S3A Fig.). Men omfanget af indflydelse afhang af koncentrationen af ​​D-FBS, disse resultater fra

in vitro

co-kultur eksperimenter lignede

in vivo

resultater (fig. 1A og S3 Fig. ).

Secernerede faktorer fra gastriske stromale celler regulerer proteinsyntese i gastriske kræftceller

Et af kendetegnene ved kræftceller er forankringsuafhængig vækst [40]. Fordi gastriske cancerceller blev podet på et monolag af Hs738 celler vil en overgang af væksten i co-kultur kunne tilskrives forankringsuafhængig vækst. Når vi sammenlignet væksten i suspension betingelser med normal klæbende tilstand, vækst af alle gastrisk cancer cellelinjer havde tendens til at blive undertrykt under suspension betingelser (S3B Fig.). På den anden side, afslørede transwell eksperimenter, at væksten af ​​MKN-1, MKN-7, og MKN-28-celler blev reduceret ved samtidig dyrkning med Hs738 celler, hvorimod væksten af ​​MKN-74-celler blev forøget og af MKN- 45 celler var uændret (S3C fig.). Disse resultater var i overensstemmelse med

in vitro

co-kultur eksperimenter (fig. 1B og S3A Fig.), Og anført, at udskilte faktorer fra Hs738 celler i stedet for forankringsuafhængig vækst var involveret i vækstregulering.

Da udskilte faktorer muligvis var involveret i vækstregulering, tilsættes derefter vi konditioneret medium (CM) fra Hs738 celler til gastrisk kræftceller og fandt, at phosphorylering af Ser /Thr rester af proteiner, især ~ 30 kDa proteiner, blev markant ændret (fig. 2A). Phosphoryleringen af ​​~ 30 kDa-proteiner i MKN-1, MKN-7, og MKN-28-celler blev signifikant reduceret af CM, men i MKN-45 og MKN-74-celler ikke blev påvirket (fig. 2A og S4 Fig. ). Proteomisk analyse af de ~ 30 kDa-proteiner viste, at en af ​​kandidaterne var ribosomale protein S6 (RPS6) (s4b Fig.). siRNA’er mod RPS6 nedsatte phosphorylering af de ~ 30 kDa-proteiner samt phosphoryleret RPS6 (S4C Fig.). Endvidere blev immunpræcipitater genereret af anti-RPS6 antistof påvist ved anti-phospho-Ser /Thr-antistof samt anti-phosphoryleret RPS6 antistof (S4C Fig.). Således ~ 30 kDa-protein var faktisk RPS6. Faktisk Hs738 CM nedsatte phosphorylering af RPS6 i MKN-1, MKN-7, og MKN-28-celler, men ikke fra 14-3-3-protein, en anden ansøger af den phosphorylerede protein (fig. 2B og s4b Fig.). Endvidere blev phosphoryleret RPS6 i MKN-7-celler sig at falde, når samdyrket med Hs738 celler (Fig. 2C). Phosphorylering af RPS6 er velkendt for at spille en kritisk rolle i reguleringen af ​​proteinsyntese [41]. Således er vores resultater indikerede, at Hs738 celler mindst nedreguleret proteinsyntesen og undertrykte væksten af ​​MKN-1, MKN-7, og MKN-28-celler gennem udskilte faktorer.

(A) mavekræft celler blev dyrket M, markør; hexafluorophosphate.

doi:10.1371/journal.pone.0119415.s026

(PDF)

Acknowledgments

We