PLoS ONE: Androgen-Reguleret transkriptionel kontrol af sialyltransferaser i prostatakræft Cells

Abstrakt

udtryk for gangliosider er ofte forbundet med kræft progression. Sialyltransferaser har fået megen opmærksomhed med hensyn til deres forhold til kræft, fordi de modulerer ekspressionen af ​​gangliosider. Vi har tidligere vist, at GD1a produktion var høj i kastrationsresistent prostatacancer-cellelinier, PC3 og DU145, hovedsagelig på grund af deres høje ekspression af β-galactosid α2,3-sialyltransferase (ST3Gal) II (ikke ST3Gal I), og ekspressionen af både ST3Gals blev reguleret af NF-KB, hovedsagelig ved RelB. Heri viser, at GD1a blev produceret i overflod i cancerøse vævsprøver fra humane patienter med hormon-følsomme prostatacancere samt kastrationsresistent prostatakræft. Ekspressionen af ​​ST3Gal II blev konstitutivt aktiveret i kastrationsresistent prostatacancer-cellelinier, PC3 og DU145, på grund af hypometylering af CpG ø i dets promotor. Men i androgen-udtømte LNCaP-celler, et hormon-sensitive prostatacancer-cellelinie, blev ekspressionen af ​​ST3Gal II tavshed på grund af hypermethyleringen af ​​promotorregionen. Ekspressionen af ​​ST3Gal II i LNCaP-celler steg med testosteron behandling på grund af demethylering af CpG sites. Dette testosteron-afhængig ST3Gal II-ekspression blev undertrykt af RelB siRNA, hvilket indikerer, at RelB aktiveret ST3Gal II transkription i testosteron-inducerede demethyleret promotor. Derfor, i hormon-sensitive prostatakræft, produktion af GD1a kan reguleres ved androgen. Dette er den første rapport indikerer, at ekspressionen af ​​et sialyltransferase transkriptionelt reguleres af androgen-afhængige demethylering af bindingssteder for CpG i sin genpromotor

Henvisning:. Hatano K, Miyamoto Y, Mori M, Nimura K, Nakai Y, Nonomura N, et al. (2012) Androgen-Reguleret transkriptionel kontrol af sialyltransferaser i prostatacancerceller. PLoS ONE 7 (2): e31234. doi: 10,1371 /journal.pone.0031234

Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: August 10, 2011; Accepteret: 4 januar 2012; Publiceret: 8 februar 2012

Copyright: © 2012 Hatano et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Program til fremme af grundlæggende Studier i Health Sciences i National Institute of Biomedical Innovation (Projekt ID: 10-03), og ved den nordlige Osaka (Saito) Biomedicinsk videnbaserede Cluster Creation Project. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mange kræftceller har afvigende sialylerede glykaner på deres overflade. Disse afvigende molekyler kan være involveret i kræft progression [1] – [3], men sialylerede glykaner spiller også mange roller i sunde organismer og ikke-cancerceller, herunder embryogenese, regulering af immunresponset og virus binding, som fører til infektioner [4 ], [5]. Sialylerede glycaner syntetiseres af sialyltransferaser, som tilføjer sialinsyrer til oligosaccharidkæderne af glycoproteiner og glycosphingolipider (GSL’er) [5]. Til dato har 20 sialyltransferase gener blevet klonet, og de respektive enzymer er blevet grupperet i fire familier i henhold til kulhydrat bindinger de katalyserer: p-galactosid a2,3-sialyltransferaser (ST3Gal I-VI), β-galactosid α2,6- sialyltransferaser (ST6Gal I og II), GalNAc a2,6-sialyltransferaser (ST6GalNAc I-VI), og α2,8-sialyltransferaser (ST8Sia I-VI) [6]. Under neoplastisk transformation og cancer progression, er aktiviteten af ​​sialyltransferaser ofte ændres, og følgelig have kræftceller hårdere sialylerede glycaner på deres overflade end ikke-cancerceller [1], [2], [7].

GSL’er, der indeholder sialinsyrer er kendt som gangliosider og udtrykkes i høje niveauer i forskellige cancerceller [3]. Gangliosiderne stede på cancerceller anvendes som biomarkører eller behandlingscentre mål, og de berigede gangliosider forskellige for kræft celletyper [8] – [10]. Vi har fokuseret på GD1a syntese i kræftceller, fordi GD1a har flere biologiske tiltag, der fremmer udviklingen af ​​kræft. For eksempel, stærkt metastatiske cancerceller har rigeligt GD1a, og GD1a er involveret i cancer celleadhæsion til endotelceller under metastase [11]. Den GD1a spredes fra tumorceller i tumoren mikromiljø fremmer angiogenese og forstærker vækstfaktorsignalering ved at øge dimerisering af vækstfaktorreceptorer [12] – [15]. Derfor kan GD1a være involveret i cancer celleproliferation og metastase. Desuden er dette gangliosidet er en receptor for Sendai-virus [16], og inaktiveret Sendai viruspartikler [hæmagglutinerende virus of Japan kappe (HVJ-E)] inducere apoptose i flere humane cancerceller med beriget GD1a på deres overflade [17]. Derfor kan GD1a være et attraktivt molekyle fra et synspunkt om cancerbehandling

GD1a er blevet rapporteret at være rigeligt produceret i kastrationsresistent prostatacancerceller [17] -. [20], og vi tidligere vist, at kastration resistente prostatacancerceller blev effektivt udryddet af HVJ-E [17]. GD1a syntetiseres ud fra GM1 ved ST3Gal I og II. Km-værdien af ​​ST3Gal II for GM1 er mindre end den for ST3Gal I; således, ST3Gal II bidrager fortrinsvis til GD1a syntese [6], [21] – [24]. Vi har for nylig påvist, at rigelig produktion af GD1a i kastrationsresistent prostatacancerceller er korreleret med høje niveauer af ST3Gal II-ekspression [20], og at ST3Gal II-ekspression reguleres af NF-KB, hovedsagelig ved RelB, i kastrationsresistent prostatacancer celler [20]. Selvom RelB niveauer var ens i en hormon-sensitiv prostatacancer-cellelinie (LNCaP) og kastrationsresistent prostatacancerceller, og selvom ST3Gal I blev udtrykt i LNCaP-celler [20], ekspressionen af ​​ST3Gal II blev bragt til tavshed i LNCaP-celler, og GD1a var meget mindre rigelige i LNCaP-celler [17], [20]

Der har hidtil ikke været nogen offentliggjorte analyse af gangliosid niveauer i cancerøse vævsprøver fra humane patienter med prostatacancer.; imidlertid blev et endogent immunrespons på GD1a observeret hos patienter med hormon-følsomme prostatacancer, men ikke hos raske kontroller [19], hvilket antyder, at GD1a rigeligt produceres i hormon-følsomme prostatakræft. Prostatacancer udviser androgen-afhængige vækst og progression [25]; derfor kan androgener også regulere GD1a produktion, der er relateret til cancer progression. Der har imidlertid også været ingen publicerede undersøgelser, der har undersøgt den hormonale kontrol af sialylerede glycan syntese,.

Formålet med denne undersøgelse var at bestemme, om GD1a produceres i overflod i hormon-følsomme prostatakræft hos patienter og til analysere transkriptionel kontrol af sialyltransferaser, især ST3Gal II, der kræves til syntesen af ​​GD1a i hormon-følsomme prostatakræft.

Materialer og metoder Salg

etiske erklæring

skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter for brug af deres vævsprøver, og brugen af ​​sådanne enheder blev godkendt af Osaka University Hospital Institutional Review Board (Osaka, Japan).

Cell kultur

Kastration -resistente human prostatacancer-cellelinier, PC3 og DU145, og et hormon-sensitiv human prostatacancer-cellelinie, LNCaP klon FGC, blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Rockville, MD). En normal human prostata epitelcelle, PNT2, blev købt fra den europæiske Collection of Animal Cell Cultures (Porton Down, UK). PC3 celler blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagle F12-medium (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan), og DU145, LNCap, og PNT2 celler blev opretholdt i RPMI 1640 medium (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan). Alle medier blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 95% luft og 5% CO

2.

Reagenser og antistoffer

Trichostatin A (TSA) og 5-aza 2′-deoxycytidin (5-azadC) blev købt hos Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japan). Testosteron blev indkøbt fra Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Japan). Bicalutamid blev købt fra Enzo Life Sciences (Plymouth Meeting, PA). Restriktionsenzymer,

Msp

I og

Hpa

II, blev købt fra New England Biolabs (Ipswich, MA). Anti-humant RelB (C1E4) blev købt hos Cell Signaling (Danvers, MA). Anti-humant β-actin (AC-15) blev indkøbt fra Abcam (Cambridge, UK).

Real-time kvantitativ RT-PCR

Totalt RNA blev isoleret under anvendelse af et RNeasy RNA-isolering kit (Qiagen, Valencia, CA). CDNA’et blev syntetiseret ved anvendelse af en høj kapacitet cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Real-time kvantitativ PCR blev udført med et Applied Biosystems 7900 HT Hurtig Real-Time PCR-system under de følgende betingelser: 95 ° C i 10 minutter efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Blandinger af prober og primerpar specifikke for humant ST3Gal I (Hs00161688_m1), ST3Gal II (Hs00199480_m1), ST3Gal VI (Hs00196086_m1), RelB (Hs00232399_m1), og glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) (Hs99999905_m1) blev erhvervet fra Applied Biosystems . De relative ekspressionsniveauer blev beregnet ud fra en standardkurve opnået under anvendelse log fortyndinger af cDNA indeholdende genet af interesse, og værdier blev normaliseret til GAPDH, en intern kontrol.

Evaluering hjælp et reportergen

gener blev transficeret ind i celler sammen med en luciferase-reporterkonstruktion drevet af en NF-KB-bindingssted, RelA, og RelB (NF-KB luciferasereportergen; BD Bioscience Clontech, Palo Alto, CA) ved anvendelse af Fugene HD reagens (Roche, Basel, Schweiz). Luciferaseaktiviteten blev målt med dual-luciferase assaysystem (Promega, Madison, WI).

Western blot-analyse

Cellerne blev høstet og lyseret med RIPA-lysepuffer. Proteinprøver blev adskilt ved natriumdodecylsulfat polyacrylamid gelelektroforese. De separerede proteiner blev overført til polyvinyliden fluorid membraner, derefter blev membranerne blokeret med 5% skummetmælk og inkuberes natten over ved 4 ° C med anti-RelB (1:500) eller anti-β-actin (1:2000) antistoffer. Membranerne blev vasket og mærket med en 1:2000 fortynding af peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) ved stuetemperatur i ca. 1 time. Detektion af kemiluminiscens blev udført i overensstemmelse med ECL brugervejledningen (Amersham, Buckinghamshire, UK). Billeder blev taget med ImageQuant LAS 4000mini (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK), og kvantificering af Western blot-signaler blev udført ved densitometri med ImageQuant TL software (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK).

RNA-interferens eksperimenter

følgende dobbeltstrenget stealth lille interfererende RNA (siRNA) oligonukleotider og krypterede RNA blev indkøbt fra Invitrogen (Tokyo, Japan): siRNA oligonukleotider mod RelB var (sense) 5′-UCUUCAGGGACCCAGCGUUGUAGGG-3 ‘og (antisense) 5 ‘-CCCUACAACGCUGGGUCCCUGAAGA-3’. Transfektioner blev udført med lipofectamin RNAiMAX (Invitrogen, Tokyo, Japan), ifølge producentens instruktioner.

Methylering-specifik PCR (MSP) analyse

DNA methylering blev behandlet på CpG øer ved en MSP-analyse som tidligere beskrevet [26]. På MSP-analyse blev genomisk DNA ekstraheret fra celler og oprenset ved anvendelse af QIAamp DNA (Qiagen, Valencia, CA). Genomisk DNA blev underkastet omdannelse med bisulfit under anvendelse af en EZ DNA-methylering Kit (Zymo Research, Irvine, CA). Baseret på sekvensen af ​​ST3Gal II p1 promotor og ST3Gal I p1 promotor-, methylerede-specifikke primere og umethyleret-specifikke primere blev udformet under anvendelse af Methyl Primer Express software program version 1.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA). ST3Gal II-methyleret-specifikke primere var sense, 5′-TAGGGCGTAGCGGTTTTATC-3 ‘, antisense, 5′-ACTAACCGAAAACGCCTCTC-3′, og ST3Gal II-methyleret-specifikke primere var sense, 5’-GGTTAGGGTGTAGTGGTTTTATT-3 ‘, og antisense, 5’-CACACTAACCAAAAACACCTCTC-3 ‘. ST3Gal II 5′-utranslaterede område fra -659 til -495 blev valgt til MSP-analyse. ST3Gal I-methyleret-specifikke primere var sense, 5’-TAGGGTCGGTCGTAGTGTTC-3 ‘, antisense, 5′-ACCGATCCCCTACTAACGAC-3′, og ST3Gal I-methyleret-specifikke primere var sense, 5’-TTAGGGTTGGTTGTAGTGTTT-3 ‘, og antisense, 5’-AACCAATCCCCTACTAACAAC-3 ‘. ST3Gal I 5′-utranslaterede område fra -697 til -535 blev valgt til MSP-analyse. Glutathion S-transferase-π-genet (GSTP1) -methylated-specifikke primere var sense, 5’-AGTTGCGCGGCGATTTC-3 ‘, antisense, 5′-GCCCCAATACTAAATCACGACG-3′, og GSTP1-methyleret-specifikke primere var sense, 5’ -GATGTTTGGGGTGTAGTGGTTGTT-3 ‘, og antisense, 5′-CCACCCCAATACTAAATCACAACA-3’, som tidligere beskrevet [27]. Oprenset genomisk DNA behandlet med natriumbisulfit blev amplificeret ved PCR som følger: 2 minutter ved 95 ° C til denaturering, 35 amplifikationscykler (95 ° C i 30 s, 56 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s) . Humant genomisk DNA eller enzymatisk methyleret humant genomisk DNA (Chemicon International, Temecula, CA) blev bisulfit omdannede og anvendt som en positiv kontrol for de ikke-methylerede eller methylerede gener. Fraværet af en DNA-skabelon tjente som en negativ kontrol. Produkterne blev analyseret i 2% agarosegeler farvet med ethidiumbromid.

Isolering af sure GSL’er fra prostatakræft væv

Patienter diagnosticeret med prostatakræft havde gennemgået prostata biopsi eller resektion af tumorer på Osaka University Hospital (Osaka, Japan). Primære cancrøse vævsprøver blev nedfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Størstedelen af ​​de eksperimentelle procedurer har tidligere [28] blevet rapporteret. I korte træk blev prøverne homogeniseret i chloroform /methanol (02:01, v /v) og inkuberet ved stuetemperatur i 2 timer med 30 s lydbehandling hver 30 min. Methanol blev derefter tilsat til prøverne, som blev centrifugeret ved 1800 x g i 15 minutter. Pelleterne blev homogeniseret i chloroform /methanol /vand (1:2:0.8, vol /vol /vol), inkuberes ved stuetemperatur i 2 timer, og derefter centrifugeret ved 1800 x g i 15 minutter. Begge ekstrakter blev kombineret og inddampet til tørhed i et vakuum koncentrator. Resten blev opløst i chloroform /methanol /vand (30:60:8) og fraktioneret ved DEAE-Sephadex A25 søjlekromatografi for at adskille neutrale GSL’er fra sure GSL’er.

Analyse af sure GSL’er

strukturerne af de sure GSL’er blev analyseret ved enzymatisk frigivelse af kulhydratdele, fluorescerende mærkning med aminopyridin, og todimensionale kortlægning efterfulgt af massespektrometri. Størstedelen af ​​eksperimentelle procedurer har tidligere [28] blevet rapporteret. Kort fortalt blev de sure GSL’er udvundet fra primær cancer vævsprøver eller dyrkede kræftceller og fordøjet med rekombinant endoglycoceramidase II fra

Rhodococcus

sp. (Takara Bio Inc., Shiga, Japan). De frigivne oligosaccharider blev mærket med 2-aminopyridin (2-AP) og separeret på et Shimadzu LC-20A HPLC-system (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) forsynet med en Waters 2475 fluorescensdetektor. Normal-fase-HPLC blev udført på en TSK gel amid-80-søjle (0,2 x 25 cm, Tosoh, Tokyo, Japan). Den molekylære størrelse af hver pyridylaminated (PA) -oligosaccharide er givet i glucoseenheder (Gu) baseret på elueringstider af PA isomaltooligosaccharides. Omvendt fase HPLC blev udført på en TSK gel ODS-80Ts søjle (0,2 x 15 cm, Tosoh). Retentionstiden for hver PA-oligosaccharid er givet i glucoseenheder baseret på elueringstider af PA-isomaltooligosaccharides. Derfor adfærd af en given forbindelse i disse to kolonner giver et unikt sæt Gu (amid) og Gu (ODS) værdier, der svarer til koordinaterne på en 2-D kort. PA-oligosaccharider blev analyseret ved LC /ESI MS /MS. Standard PA-oligosaccharider, PA-GM1 og PA-GD1a, blev indkøbt fra Takara Bio, og PA-LST-a og PA-SPG blev isoleret som i vores tidligere undersøgelse [28].

Statistiske analyser

resultaterne er rapporteret som gennemsnit ± standardafvigelse (SE). Den tosidede uparret Students

t

-test blev anvendt til bestemmelse af den statistiske signifikans af forskellene mellem to grupper. Sandsynlighedsværdier af P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Den statistiske analyse blev udført under anvendelse af StatView 5.0 softwareprogrammet (SAS Institute, Cary, NC).

Resultater

Analyser af gangliosider i cancerøse vævsprøver fra patienter med prostatacancer

Vi har tidligere påvist, at GD1a var rigelige i kastrationsresistent prostatacancer-cellelinier (herunder PC3 og DU145), mens det var næppe påviselig i et hormon-sensitiv prostatacancer-cellelinie (LNCaP) og en normal prostata epitelial cellelinje (PNT2) [17]. Vi undersøgte niveauerne af gangliosider i prøver af cancervæv fra otte patienter med prostatacancer, herunder seks patienter med fremskreden hormon-følsomme prostatacancer og to patienter med kastrationsresistent prostatacancer (tabel 1). De sure GSL’er ekstraheret fra cancerøse vævsprøver fra disse patienter blev undersøgt ved anvendelse af HPLC (fig. 1). Både GM3 og GD3 er almindelige gangliosider udtrykt i begge prostatacancerceller og normale prostataceller epitelceller [18], [19]. GD1a blev produceret i de ondartede vævsprøver fra både patienter med hormon-sensitive prostatakræft og dem med kastrationsresistent prostatakræft (fig. 1A, 1B). I alle patientens prøver (hormon-følsomme og kastrationsresistent), den gennemsnitlige procentdel af de samlede sure GSL’er med GD1a var 8,1%, og ingen statistisk signifikant forskel blev set i forhold til værdien fra kastrationsresistent prostatacancer-cellelinier ( PC3 og DU145) (fig. 1C).

(A) de sure GSL’er fra cancervævet prøver fra otte patienter med prostatakræft, herunder seks patienter med fremskreden hormon-følsomme prostatacancer og to patienter med castration- resistent prostatacancer blev separeret ved molekylstørrelsen af ​​oligosacchariderne anvendelse af normale-fase-HPLC. Prøver fra en patient (betegnet Case 1) blev taget fra både prostata- og knoglemetastaser til evaluering. (B) De sure GSL’er i de primære kankrøse vævsprøver blev separeret ved molekylstørrelsen af ​​oligosacchariderne anvendelse af HPLC. Mængden af ​​GD1a er præsenteret som en procentdel af de samlede sure GSL’er med GD1a. (C) De sure GSL’er i dyrkede prostatacancerceller blev separeret ved molekylstørrelsen af ​​oligosacchariderne anvendelse af HPLC. Assayet blev udført tre gange, og midlerne ± S.E. GD1a niveauer er vist som forholdet til de samlede sure GSL’er i cellelinierne. Middelværdien ± S.E. GD1a niveau blev også præsenteret som forholdet til de samlede sure GSL’er i patienternes prøver (HS + CR), der er angivet i figur 1B. (HS, hormon-følsom, CR, kastrationsresistent, F, gratis glycan)

Androgen-afhængige regulering af ST3Gal II i LNCap celler

Syntesen af. GD1a hovedsageligt reguleret af ST3Gal II, og udtryk for ST3Gal II reguleres af NF-KB, hovedsagelig ved RelB, i kastrationsresistent prostatacancer cellelinjer [20]. Mængderne af nukleare RelB var ens i hormon-følsomme LNCap celler og kastrationsresistent PC3 og DU145 celler [20], men udtryk for ST3Gal II var lavere i LNCap celler end i PC3 og DU145 celler [20].

LNCaP celledyrkningsmedium rutinemæssigt suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). En nylig rapport viste, at medier suppleret med 10% FBS indeholder kun kastratkoncentrationer af testosteron [29]; i modsætning hertil hormon-sensitive prostatakræft af ubehandlede patienter vokser sædvanligvis i et miljø, der indeholder testosteron

in vivo

. For at analysere transkriptionel kontrol af ST3Gal II i hormon-sensitive prostatakræft, vi undersøgt, om ekspressionen af ​​ST3Gal II blev kontrolleret af testosteron i LNCaP-celler. LNCaP-celler blev behandlet med testosteron (0-1000 nM), og blev inkuberet i 120 timer. Den kvantitative real-time PCR-analyser viste, at ekspressionen af ​​ST3Gal II var højere i LNCaP-celler behandlet med testosteron end i LNCaP-celler, der ikke var (fig. 2A). Endvidere blev induktionen af ​​ST3Gal II efter testosteron behandling undertrykt af et anti-androgen, bicalutamid, i LNCaP-celler (fig. 2B). For at sikre at der ikke var nogen androgener stede i medierne, blev LNCaP-celler inkuberet i kul-strippet serum i 48 timer. Det basale niveau af ST3Gal II var ikke signifikant forskellig mellem de 10% FBS- og kul strippet serum-suppleret LNCaP-celler (fig. 2C). LNCaP-celler blev efterfølgende behandlet med 100 nM testosteron, og tidsforløbet for ekspression efter testosteron behandling blev evalueret. Ekspressionen af ​​ST3Gal II blev øget 48 timer efter testosteron behandling, og forblev forhøjede i mere end 120 timer i LNCaP-celler (fig. 2C). Til evaluering af NF-KB-aktivitet efter testosteron-behandling blev LNCaP-celler transficeret med en NF-KB luciferase-reporterkonstruktion og inkuberet i 120 timer med eller uden testosteron. NF-KB-aktivitet var ikke signifikant forskellig i de testosteron-behandlede LNCaP-celler sammenlignet med celler dyrket uden testosteron (figur S1). I PC3 og PNT2 celler, blev ingen signifikant stigning i ekspressionen af ​​ST3Gal II detekteres uanset om cellerne dyrket med eller uden testosteron (fig. 2A). Ekspressionen af ​​ST3Gal II steg ikke efter testosteron behandling i PC3-celler på noget tidspunkt op til 120 timer (figur S2). Baseret på disse resultater, vi den hypotese, at medierne med kastrationsniveauer af testosteron førte til epigenetisk inaktivering af ST3Gal, et gen påkrævet til syntesen af ​​GD1a, i LNCaP-celler.

(A) LNCaP, PC3, og PNT2 celler blev behandlet med eller uden testosteron (0-1000 nM) i 120 timer, ved refeeding med frisk medium med eller uden testosteron ved 72 timer. Den kvantitative real-time PCR-analyser af ST3Gal II mRNA blev udført, og ekspressionsniveauerne rapporteres som middelværdier ± S.E. (N = 3) af folden forskel i mRNA efter normalisering af værdier til ekspressionsniveauet af ubehandlede celler. ** P 0,001. (B) LNCaP-celler blev behandlet med eller uden testosteron (0-100 nM) og samtidig med eller uden 10 pM bicalutamid i 120 timer, ved refeeding med frisk medium med eller uden testosteron og /eller bicalutamid ved 72 timer. Den kvantitative real-time PCR-analyser for ST3Gal II blev udført, og ekspressionsniveauerne rapporteres som middelværdier ± S.E. (N = 3) af folden forskel i mRNA efter normalisering af værdier til ekspressionsniveauet af ubehandlede celler. ** P 0,001. (C) LNCaP-celler blev inkuberet i kul-strippet serum (CSS) i 48 timer og derefter behandlet med 100 nM testosteron i de angivne tidsrum. Den kvantitative real-time PCR-analyser for ST3Gal II blev udført, og ekspressionsniveauerne rapporteres som middelværdier ± S.E. (N = 3) af folden forskel i mRNA efter normalisering af værdier til ekspressionsniveauet af ubehandlede celler. * P 0,05, ** P. 0,001

Epigenetisk regulering af ST3Gal II i LNCap celler

Dernæst vi undersøgt, om ST3Gal II epigenetisk blev reguleret i LNCap celler. LNCaP-celler blev behandlet med en DNA-methyltransferase inhibitor, 5-azadC, og inkuberet i 120 timer (fig. 3A). Den kvantitative real-time PCR-analyser viste, at ekspressionen af ​​ST3Gal II blev opreguleret efter 5-azadC behandling. Efter dette forsøg blev LNCaP-celler behandlet med en histondeacetylaseinhibitor, TSA, og inkuberet i 48 timer (fig. 3B). Den kvantitative real-time PCR-analyser viste, at ekspressionen af ​​ST3Gal II blev opreguleret efter TSA behandling. Disse resultater antyder, at epigenetisk regulering, herunder DNA methylering og histon modifikationer, kan være involveret i undertrykkelsen af ​​ST3Gal II-genet i LNCaP-celler. I yderligere eksperimenter, vi fokuseret på DNA-methylering på CpG ø i ST3Gal II promotoren.

(A) LNCaP-celler blev behandlet med 5-aza-2′-deoxycytidin (5-azadC) (0-50 uM) i 120 timer, ved refeeding med frisk medium med eller uden 5-azadC ved 72 timer. Den kvantitative real-time PCR-analyser for ST3Gal II blev udført, og ekspressionsniveauerne rapporteres som middelværdier ± S.E. (N = 3) af folden forskel i mRNA efter normalisering af værdier til ekspressionsniveauet af ubehandlede celler. * P 0,05. (B) LNCaP-celler blev behandlet med 5 pM Trichostatin A (TSA) i 48 timer. Den kvantitative real-time PCR-analyser for ST3Gal II blev udført, og ekspressionsniveauerne rapporteres som middelværdier ± S.E. (N = 3) af folden forskel i mRNA efter normalisering af værdier til ekspressionsniveauet af ubehandlede celler. * P. 0,05

Kontrol af DNA methylering på CpG ø i ST3Gal II-genet promotor i prostatacancerceller

Genet for human ST3Gal II er blevet klonet, og p1 promotor er sigende nødvendig for aktiv transkription af dette gen i prostatacancerceller [30]. ST3Gal II promotorsekvenser er frit tilgængelige, og vi identificeret et CpG ø i ST3Gal II p1-promotoren under anvendelse af Methyl Primer Express software program, version 1.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA) (fig. 4A). Vi undersøgte methylering ved CpG i ST3Gal II-promotoren under anvendelse af MSP-analyse. Genomisk DNA blev isoleret fra LNCaP-celler behandlet med eller uden 5-azadC i 120 timer, der blev derefter behandlet med natriumbisulfit, og DNA’et blev amplificeret med primere specifikke for umethylerede eller den methylerede ST3Gal II-promotoren (fig. 4B). I LNCaP-celler, CpG ø i ST3Gal II-promotoren, som oprindeligt blev hypermethyleret, blev demethyleret ved 5-azadC behandling. Dernæst undersøgte vi effekten af ​​testosteron på methylering ved CpG i ST3Gal II promotoren i LNCaP-celler ved anvendelse af et MSP-analyse (fig. 4C). I PC3 og DU145 celler, den CpG ø i ST3Gal II promotor var konstitutivt hypomethylated. I LNCaP-celler, blev CpG ø i ST3Gal II promotoren hypermethyleret i fravær af testosteron og demethyleres i nærvær af testosteron. Endvidere blev demethylering ved CpG ø i ST3Gal II promotoren efter testosteron behandling undertrykt af et anti-androgen, bicalutamid, i LNCaP-celler (Fig. 4D).

(A) The CpG ø i ST3Gal II p1-promotoren og placeringen af ​​MSP primere. De lodrette streger repræsenterer CpG sites og TSS repræsenterer det transkriptionelle startsted. (B-D) MSP analyser af CpG øen ST3Gal II. DNA blev isoleret fra LNCaP-celler behandlet med 5-azadC (0-50 pM) i 120 timer (B), kastrationsresistent prostatacancer-cellelinier (PC3 og DU145) eller LNCaP-celler behandlet med eller uden 100 nM testosteron i 120 timer ( C) eller LNCaP-celler behandlet med eller uden 100 nM testosteron samtidigt med eller uden 10 pM bicalutamid i 120 h (D). Derefter blev DNA’et behandlet med natriumbisulfit, og endelig amplificeret med primere specifikke for ikke-methylerede (USP) eller methyleret (MSP) form af CpG ø i ST3Gal II promotoren (M, methyleret kontrol UA, umethyleret kontrol A; UB, umethyleret kontrol B). De MSP analyser blev gentaget 3 gange med de samme resultater, og en repræsentant billede vises i figurerne.

Vi undersøgte også, om den globale DNA demethylering er under androgen-afhængige kontrol i LNCap celler. Vi undersøgte de samlede begrænsning mønstre af

Msp

I- eller

Hpa

II-fordøjet genomisk DNA. Disse enzymer er isoschizomers, som genkender mål-sekvensen 5′-CCGG-3 ‘, men aktiviteten af ​​

Hpa

II inhiberes ved methylering af den indre cytosin af denne sekvens. De genomiske DNA isoleret formular LNCap celler behandlet med eller uden testosteron blev fordøjet med

Msp

I eller

Hpa

II (Figur S3A). Testosteron behandling ikke i høj grad påvirke fordøjelsen mønster af

Hpa

II-behandlede genomisk DNA fra LNCap celler, hvilket indikerer, at den globale DNA demethylering i LNCap cellerne ikke var under androgen-afhængige kontrol. Vi derefter undersøgte CpG øen GSTP1, som er rapporteret til at være hypermethyleret under prostata carcinogenese og også i LNCap celler [27]. Baseret på MSP analyse, havde testosteron behandling ikke påvirke methylering af GSTP1 i LNCaP-celler (figur S3B). Således kan androgen-afhængige kontrol af DNA demethylering induceres fortrinsvis ved CpG ø i ST3Gal II genpromotor i LNCaP-celler.

Androgen-afhængige og epigenetisk regulering af ST3Gal I i LNCaP-celler

Selvom GD1a syntetiseres ud fra GM1 hovedsageligt af ST3Gal II, ST3Gal i kan også bidrage til syntesen af ​​GD1a [6], [21] – [24]. Vi har tidligere rapporteret, at ST3Gal I blev udtrykt i LNCaP-celler, mens ekspressionen af ​​ST3Gal II blev stille [20]. Derfor kan regulering af ST3Gal I transkription være forskellig fra ST3Gal II. Vi derefter undersøgt, om ekspressionen af ​​ST3Gal jeg ligesom ST3Gal II, blev styret af testosteron i LNCap celler. I dette eksperiment blev LNCaP-celler behandlet med testosteron og inkuberes i 120 timer. Den kvantitative real-time PCR-analyser viste, at testosteron behandling resulterede i forøget ekspression af ST3Gal I i LNCaP-celler (fig. 5A), selvom ekspressionen af ​​ST3Gal VI sialyltransferase påkrævet til syntesen af ​​sialyl paraglobosid, ikke blev induceret ved testosteron behandling (Figur S4). Endvidere blev testosteron-medieret induktion af ST3Gal I i LNCaP-celler undertrykt af bicalutamid (fig. 5B). For at sikre at der ikke var nogen androgener stede i celledyrkningsmediet, blev LNCaP-celler inkuberet i kul-strippet serum i 48 timer. Det basale niveau af ST3Gal Jeg var ikke signifikant forskellig mellem de LNCaP-celler dyrket med 10% FBS og kul-strippet serum (fig. 5C). Derefter blev LNCaP-celler behandlet med 100 nM testosteron, og tidsforløbet af ændringerne følgende testosteron behandling blev evalueret. Ekspressionen af ​​ST3Gal I steg 72 timer efter testosteron behandling og forblev forhøjede i mere end 120 timer i LNCaP-celler (fig. 5C). I PC3 og PNT2 celler, ingen signifikant stigning i ekspressionen af ​​ST3Gal I blev påvist efter testosteron behandling (fig S5).

(A) LNCaP-celler blev behandlet med eller uden testosteron (0-1000 nM) i 120