PLoS ONE: Cell Cycle- og cancerassocieret Gene Networks Aktiveret af Dsg2: Beviser for Cystatin En Deregulering og en potentiel rolle i celle-celle Adhesion

Abstrakt

Cell-celle-adhæsion er altafgørende i at tilvejebringe og opretholde flercellede struktur og signaltransmission mellem celler. I huden, til afbrydelse desmosom reguleret intercellulær tilslutning kan føre til forstyrrelser i keratinisering og hyperproliferativ sygdom, herunder cancer. For nylig viste vi transgene mus overekspression desmoglein 2 (Dsg2) i overhuden udvikler hyperplasi. Efter microarray og gen-netværk analyse, viser vi, at Dsg2 forårsagede en dybtgående ændring i transkriptomet af keratinocytter

in vivo

og ændret en række gener vigtige i epitelial dysplasi herunder: calcium-bindende proteiner (S100A8 og S100A9), medlemmer af cyclin-proteinfamilien, og cysteinproteaseinhibitor cystatin A (CSTA). CSTA er dereguleret i flere hudkræft, herunder planocellulært karcinom (SCC) og tab af funktion mutationer fører til recessive huden skrøbelighed lidelser. Mikroarrayet resultater blev bekræftet af qPCR, immunoblotting, og immunhistokemi. CSTA blev fundet på højt niveau i hele nyfødte museepidermis men dramatisk faldt med udvikling og blev opdaget overvejende de differentierede lag. I humane keratinocytter, knockdown af Dsg2 af siRNA eller shRNA reduceret CSTA ekspression. Endvidere siRNA knockdown af CSTA resulterede i cytoplasmatisk lokalisering af Dsg2, perturbed cytokeratin 14-farvning og reducerede niveauer af desmoplakin i respons på mekanisk strækning. Begge knockdown af enten Dsg2 eller CSTA induceret tab af celleadhæsion i et dispase-baseret assay og effekten var synergistisk. Vores resultater her tilbyde en ny vej for CSTA regulering involverer Dsg2 og et potentielt krydstale mellem Dsg2 og CSTA der modulerer celleadhæsion. Disse resultater understøtter yderligere den seneste menneskelige genetiske fund, at tab af funktion mutationer i CSTA genet resultat i huden skrøbelighed pga svækket celle-celle adhæsion: autosomal-recessive exfoliativ ichthyosis eller acral skællende hud syndrom

Henvisning:. Gupta A, Nitoiu D, Brennan-Crispi D, Addya S, Riobo NA, Kelsell DP, et al. (2015) Cell Cycle- og cancerassocieret Gene Networks Aktiveret af Dsg2: Beviser for Cystatin En Deregulering og en potentiel rolle i celle-celle-vedhæftning. PLoS ONE 10 (3): e0120091. doi: 10,1371 /journal.pone.0120091

Academic Redaktør: Johanna M. Brandner, University Hospital Hamburg-Eppendorf, Tyskland

Modtaget: September 5, 2014 Accepteret: 2 februar 2015; Udgivet: 18 Marts 2015

Copyright: © 2015 Gupta et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer. Microarray data blev forelagt Gene Expression Omnibus (Accessionsnummer: GSE62814)

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (Mahoney, R01AR056067, Riobo, RO1 GM088256).. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

desmosomes er store vedhæftning strukturer lokaliseret til celle-celle grænser epitelceller hvor cytoplasmatiske plak komponenter, herunder plakin (desmoplakin) og keratin familier, samler med bæltedyr (plakoglobin og plakophilins) og cadherin (desmogleins og desmocollins) protein familier [1,2]. Disse vedhæftning strukturer er afgørende ikke blot for at opretholde cellestruktur og integritet, men også for vævsudvikling og morfogenese. Mutationer i desmosom er den underliggende årsag til mange hud skrøbelighed lidelser med eller uden hjerte abnormiteter [3]. Derudover desmosomes også tjene som “signaling centre” spiller en aktiv rolle i modulering flere vigtige veje, herunder Wnt /β-catenin og T-celle-faktor /lymfoid enhancer faktor [4]. Montering beviser understøtter deres deltagelse i modulering celle skæbne og overlevelse. Desmosom proteiner kan aktivere intracellulær signalering gennem modulering af ekspressionsniveauer og mønstre, som begge kan dramatisk ændre adhæsion og celleproliferation [5,6]. I de interfollicular epidermis, er Dsg2 udtrykkes normalt ved meget lavt niveau og begrænset til den proliferative basale cellelag. For nylig har vi udviklet en transgen musemodel overudtrykker desmoglein 2 (Dsg2) i [5] huden. Vi bestemt, at ektopisk udtryk for Dsg2 aktiverer flere vækst- og overlevelse veje, der kan fremme udviklingen af ​​kræft og progression. Selvom Inv-Dsg2 transgene mus udviklede præcancerøse papillomer og var mere modtagelige for kemisk induceret carcinogenese, den mekanisme, hvormed Dsg2 inducerer disse ændringer fortsat uklar. Vi har for nylig vist, at Dsg2 associerer med caveolin-1 tilvejebringer en mekanisme til regulering af mitogenisk signalering og modulering celleoverfladen præsentation, som begge kan bidrage til malign transformation og tumorprogression [7]. I denne rapport, søgte vi at identificere gener associeret med den hyperproliferative fænotype ved sammenligning af ekspressionen profilen af ​​Inv-Dsg2 transgene mus med cDNA fra vildtypemus som en kontrol via microarray analyse.

Specifikt fandt vi Dsg2 var forbundet med reguleringen af ​​cystatin a (CSTA, mus Csta1-3), også kaldet Stefin a, syre cystein protease-hæmmer, keratolinin eller “epidermal SH-protease inhibitor”, et medlem af type 1 cystein proteasehæmmere [ ,,,0],8-11]. CSTA udtrykkes primært i epitel og lymfoide væv, hvor det beskytter den proteolytiske behandling af cytoplasmatiske og cytoskeletale proteiner ved hæmmende cathepsiner, de papain-lignende, lysozomal cysteinproteaser [12-14]. det er derfor ingen overraskelse, at CSTA besidder en række biologiske funktioner, herunder en bakteriostatisk rolle at beskytte væv mod cysteinproteaser der er produceret af invaderende patogener [15]. i huden blev CSTA oprindeligt identificeret i forhornede celle kuvert og foreslås at spille en rolle i barrierefunktion målretning støv mide proteaser [16]. For nylig opdagede vi, at mutationer i

CSTA

gen er den underliggende genetiske årsag af huden skrøbelighed tilstand kendt som exfoliativ ichthyosis med nedsat celle-celle-adhæsion i de lavere lag af epidermis [17]. Derudover kan recessive CSTA mutationer være forbundet med en acral peeling hudlidelse [18,19]. Her beskriver vi en række studier, der undersøger Dsg2 og CSTA i keratinocyt vedhæftning.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Alle eksperimenter dyr blev godkendt af den etiske komité, der driver under Thomas Jefferson University Intern Animal Care og brug Udvalg (IACUC) godkendte protokoller (642B og 642D).

Generation of Inv-Dsg2 transgene mus

Vi har tidligere etablerede transgene mus, der udtrykker Dsg2 i differentierende lag af epidermis, der kontrolleres af den involucrin (Inv) promotoren (Inv-Dsg2) [5]. Kort beskrevet musen

Dsg2

.

Flag

cDNA blev subklonet i pH3700-PL2 parental vektor epitop på

Ikke

I restriktionssite nedstrøms for involucrin promotoren. Genotypebestemmelse og karakterisering af de transgene mus er tidligere beskrevet detaljeret [5]. Vild type kontrol og Inv-Dsg2 transgene kuldsøskende på ca. 6 uger gamle, blev anvendt til disse undersøgelser.

microarray analyse

Mus hud væv, der er lagret i RNAlater (Qiagen, Valencia, CA), blev pulveriseret med en dødelig og støder og homogeniseret i en Dounce homogenisator. Totalt RNA blev isoleret under anvendelse af TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) og RNeasy (Qiagen) ifølge producentens protokoller. Komplementær DNA (cDNA) blev syntetiseret fra 2 ug RNA ved anvendelse hexa-tilfældige primere og M-MLV revers transkriptase (SuperScriptIII System, Invitrogen). Første streng cDNA blev syntetiseret ud fra 5 ug totalt RNA (2 vildtype og 2 transgene prøver) ved revers transkription og anvendes til at generere biotin-mærket cRNA af

in vitro

transkription. Mikroarrayene blev derefter bearbejdet under anvendelse Streptavidin-Alexa 647-konjugat. Efter hybridisering vaskes objektglas blev scannet for at erhverve fluorescerende signaler for hver plet med en ScanArray XL-5000 konfokal skanner (PerkinElmer, Boston, MA). For at kvantificere fluorescensintensiteterne for hver plet på array, 16-bit-billeder, blev analyseret af Quant Array 3.0 software (PerkinElmer). Efter billedbehandling blev data analyseret ved GeneSpring 11,5 software (Agilent teknologier, Santa Clara, CA). Baggrund værdier baseret på signalintensiteter omkring hver plet blev trukket, og resultater blev normaliseret ved fraktil normalisering og bruge baseline transformation medianen af ​​alle prøver. Microarray data blev forelagt Gene Expression Omnibus (Accessionsnummer: GSE62814)

Volcano parceller blev brugt til at identificere differentielt udtrykte gener (større end lig med 2 gange og statistisk signifikans p 0,05) ved hjælp af Students

t

-test (uparret), og ingen flere test korrektioner. Den differentielt udtrykte gen Listen blev indlæst i Ingenuity Pathway Analysis (IPA 9,0) software til netværksanalyse.

RT-PCR og kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) analyse af

Dsg2

,

Csta1

,

Csta2

,

Csta2l1

, og

Csta3

cDNA blev syntetiseret fra 1 pg RNA ved hjælp af High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Exon-spænder qPCR primere blev udformet som følger:

Dsg2

, frem 5′-GAG GAA TTG AGT GCA GCA CAT AC-3 ‘, omvendt 5’-CTT GCT TCC ACC GTC AAG G;

Csta1

: frem 5′-TGC TAA CAA GGT CAG ACC TCA G-3 ‘, omvendt 5′-CCA TGG TTT TGT CAG TCT GGT-3’;

Csta2

: fremad 5’TGA ATG TAG GAC GTG GTT GC-3 ‘, omvendt 5′-GGG ATC AGG TCA AGT TGG AA-3’,

Csta2l1

: fremad 5′- TGT CTT AAG TGG TAT TTC CAG TGA AAA CGA C-3 ‘, reverse 5′- CAT CTC TTT ACA ATG GGG GGG GG-3’;

Csta3

: fremad 5’GCC CAT CAA TGA GTC AAG AAA-3 ‘, omvendt 5′-GGC CTC TGA AGA CTT TCA TGT G-3’ og til intern kontrol

GAPDH

: fremadrettet 5′-CCC ATC ACC ATC TTC CAG GAG CGA-3 ‘, revers 5′-TCC ACC CTT CAA GTG GGC CCC-3’. cDNA’er blev amplificeret i PCR-puffer indeholdende 1 enhed Taq-DNA-polymerase (Qiagen), 200 uM dNTP’er, 1 enhed Q opløsning, 0,5 uM primere. Amplifikation af hver af cDNA var et indledende denatureringstrin ved 94

° C i 3 minutter og 35 cyklusser af denaturering ved 94

° C i 30 sek, annealing ved 58

° C i 1 minut og forlængelse ved 72

° C i 1 minut, efterfulgt af den sidste cyklus af forlængelse ved 72

° C i 7 min.

genekspressionsniveauer blev analyseret ved QRT-PCR-analyse ved anvendelse af 1 ul af cDNA’et og SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) ifølge et standard amplifikationsprotokol på en ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems).

GAPDH

udtryk blev brugt til at normalisere data. Primersekvenserne ansat til QRT-PCR for

Dsg2

,

Csta1

,

Csta2

,

Csta2l1

, og

Csta3

er medtaget ovenfor.

Immunhistokemi og Immunoblotting

Medmindre andet er angivet, alle kemikalier var fra enten Sigma (St. Louis, MO) eller Fisher (Waltham, MA). Til histologi blev hudvævet fikseret ved stuetemperatur natten over i en 10% formalinopløsning. Væv blev indlejret i paraffin, snittet (4 um), monteret på objektglas og farvet med hematoxylin og eosin. For immunfarvning blev formalin-fikserede paraffin-indlejrede væv opvarmet til 60 ° C i 1 time og deparaffinerede i xylen (3 gange), 100% EtOH (2 gange), 95% EtOH (2 gange), 75% EtOH, 50% EtOH, og H

2O [20]. Antigener blev hentet ved mikrobølgeopvarmning i Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris-base, 1 mM EDTA-opløsning, 0,05% Tween 20, pH 9,0). Væv blev derefter blokeret i blokeringsbuffer (5% normalt gedeserum, 1% BSA, 0,1% Ttriton X-100 i PBS) i 1 time ved stuetemperatur (RT) og derefter inkuberet med cystatin A antistof (1:50; AB4065, Millipore , Temecula, CA), Dsg2 AB10 (1: 10.000) og Flag M2 (1: 500, Sigma) i blokerende buffer, natten over ved 4

° C. Væv blev vasket i PBS (2 gange) og inkuberet med Alexa Fluor anti-kanin 488 IgG og anti-Mouse 594 IgG (1: 400; Molecular Probes, Oregon) i 1 time, ved stuetemperatur i mørke. Kerner blev farvet med DAPI (1: 1000, Sigma) i 1 min ved stuetemperatur i mørke efterfulgt af vask i PBS

I Western blots, hudvæv blev lynfrosset i flydende nitrogen, pulveriseres med dødelig og støder. og homogeniseret i RIPA-buffer (50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0,5% deoxycholat, 0,1% SDS, proteasehæmmer (PI) cocktail (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) og phosphatase inhibitor cocktail (Fisher). Proteinkoncentrationen blev bestemt (Pierce BCA kit, Pierce Biotech, Rockford, IL) og immunoblotting blev udført som tidligere beskrevet [21] med ~ 20 ug protein i hver bane . løses over 4-20% SDS-PAGE (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) primære antistoffer anvendt var: Flag M2 (1: 2000, Sigma); Actin (1: 5000; Calbiochem, San Diego, CA); Cystatin A (1: 1000; Millipore, Temecula, CA); human Dsg2 (1: 100; monoklonalt Ab 10D2); DSP I /II (1: 250; klon 5-11F; [22]); vinculin (1: 1000; . ABCAM, Cambridge, UK) Signaler blev påvist ved tilsætning af sekundært antistof HRP-konjugeret (1: 5000; Jackson Labs, Bar Harbor, ME), visualiseret ved kemiluminescens (ECL; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Alternativt blev signaler detekteres via bestemte gede-anti-muse IR-Dye 800 CW (1:. 20.000; LI-COR Cat 926-32.210) eller gede-anti-kanin-IR Dye 800 CW (1:. 20.000; LI-COR Cat 926 -32.211) og yderligere analyseret og kvantificeret ved Odyssey IR imaging system (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE). Western blots analyseret af chemiluminescens blev kvantificeret ved hjælp ImageJ software udviklet på National Institutes of Health (website: https://rsbweb.nig.gov/ij/). Statistisk analyse blev undersøgt ved hjælp af Students

t

test med en

s

værdi 0,05 betragtet som signifikant (*

s

0,05; **

p

0,01; ***

s

. 0,001), hvorved kvantificerede målinger fra tre uafhængige forsøg blev normaliseret til Actin lastning kontrol

Cell kultur og siRNA knockdown af

Dsg2

og

CSTA

A431 (epidermoid carcinom fra American Type Culture Collection, Bethesda, MD) celler blev holdt i DMEM suppleret med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin (P /S). A431-celler blev dyrket til ~ 60% sammenflydning på 6-brønds dyrkningsskåle, serum-udsultet i 4 timer med 0,5% FBS og 1% P /S før inkubering med 100 nM scrambled siRNA kontrol (D-001.810-10, Dharmacon, Thermo Scientific, Lafayette, CO) eller samles siRNA til

Dsg2

(L-011.645-00, Dharmacon) og

CSTA

(L-010.020-00, Dharmacon) ved hjælp af lipofectamin RNAiMax (Invitrogen, Carlsbad, CA) og Opti-MEM-medium (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Celler blev returneret til normalt medium efter 18 timer og inkuberet i 72 timer. Celler blev lyseret i 9 M urinstof derefter forberedt til Western blot-analyse som beskrevet ovenfor. HaCaT-celler blev behandlet med siRNA ved omvendt transfektion i henhold til producentens instruktioner ved anvendelse af Lipofectamine RNAiMAX. For immunfluorescens blev dyrkede celler fikseret i MeOH -20 ° C i 10 minutter og permeabiliseret i 1% TX-100 i 5 min. Efter ikke-specifikke steder blev blokeret, blev celler inkuberet med antistof 10D2 for Dsg2 eller CSTA-antistof (se ovenfor).

I nogle eksperimenter celler behandlet med scrRNA eller

CSTA

siRNA blev podet på BioFlex 6-brønds plader indeholdende en fleksibel gummimembran belagt med pronectin (Flexplates, Flexcell International, Hillsborough, NC, USA). Cellerne blev dyrket til ~ 80% konfluens, og monolagene blev understreget mekanisk med en Flexcell FX-4000 Tension System (Flexcell International, Hillsborough, NC, USA) som tidligere beskrevet detaljeret [17] (Blaydon et al., 2011). Celler blev strakt til 0-4 timer, og derefter fikseret og farvet for Dsg2 (1: 500; Kanin AB10 [23]) og keratin 14 (1: 100; klon LL001, Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Cellerne blev også lyseret i Laemmli buffer til Western blotting.

Knockdown af Dsg2 af shRNA

A431-celler stabilt transfekteret med pSUPER Retro-puro vektor, der bærer specifikke nukleotider shRNA rettet til GFP (shGFP) eller Dsg2 (shDsg2) blev etableret som tidligere beskrevet i detaljer [24]. Kort fortalt to oligoer ( »5-GAT CCC CGA GAG GAT CTG TCC AAG AAT TCA AGA GAT TCT TGG ACA GAT FTT CTC TTT TT-3″ og “5-AGC TTA AAA AGA GAG GAT CTG TCC AAG AAT CTC TTG AAT TCT TGG ACA GAT CCT CTC GGG-3 ‘) blev syntetiseret, udglødet og ligeret i pSUPER Retro-puro (Oligo-motor, Seattle, WA). Retrovirus produktion og infektion blev udført i Phoenix celler. Transficerede A431 celler blev holdt i DMEM suppleret med 10% FBS og puromycin (2 pg /ml).

Dispase-baserede celle dissociation assay

For at vurdere virkningerne af cystatin A og Dsg2 på celle adhæsion, blev Mock og shDsg2 A431-celler udpladet på seks brønde dyrkningsskåle ved en densitet på 2 X 10

5 celler /brønd og derefter behandlet med 50 nM scrambled siRNA kontrol eller siRNA til

CSTA

som beskrevet over. Efter 72 timer blev cellerne vasket med Hanks balancerede saltopløsning og inkuberet med dispase (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) i 5 minutter. De løftede cellelag blev underkastet dispase-baserede dissociation assay ved pipettering fem gange ved anvendelse af en 1-ml pipette. Cellefragmenter blev fikseret i 3% formalinopløsning og farvet med krystalviolet. Forsøg blev gentaget mindst 3 gange. Vi bemærker her, at disse forsøg blev udført uden at tilføje ekstra calcium.

Resultater

microarray analyse sammenligner vildtype og Inv-Dsg2 transgene mus hud

Vi viste for nylig, at overekspression af Dsg2 under kontrol af den involucrin promotoren i huden af ​​transgene mus (Inv-Dsg2) resulterede i hyperplasi af epidermis og øget følsomhed over for tumor induktion [5]. Desuden Inv-Dsg2 transgene mus udviklede også godartede papillomer og var mere modtagelige for kemisk induceret totrins hudkræft. Disse resultater fik os til at udføre en sammenligning af genekspressionsprofilerne mellem Inv-Dsg2 transgene mus og kontrolmus. For at undgå udsving og variationer baggrund, blev vores Dsg2 transgene mus krydsede tilbage mindst 5 generationer C57BL6 baggrund. Vi har valgt at bruge fuld tykkelse hud for at observere eventuelle ændringer i genekspression i dermis, der kan have været indført af de overliggende epidermis. Således tilbage hud fra samme kuld på 6 uger efter fødslen blev anvendt

H 0,05, vist med rødt, fig 1B.). Disse 492 gener moduleret som svar på Dsg2 blev yderligere analyseret af Ingenuity Analysis Program (Qiagen), som beskriver de top 5 gen netværk efter deres grad af relevans for Network Støtteberettigede molekyler i vores datasæt (S2 tabel). Denne analyse viste stærk sammenhæng med Cell Cycle (S2A Fig.) Og Cancer forordning veje (S2B Fig.). Et betydeligt antal af gener involveret i forskellige faser af cellecyklus regulering blev opreguleret (rød) som reaktion på Dsg2 (og yderligere opsummeret i S3 tabel). Tilsvarende blev mange gener involveret i tumorigenese også opreguleret i respons på Dsg2 herunder, det mitotiske checkpoint proteinkinase (

BUB1

) (S1 Table) og den distale-mindre 4-homeobox (

DLX4

) og kræft modtagelighed protein (

BRCA1

) (S2B fig.). Interessant dog to medlemmer af forkhead familie af transkriptionsfaktorer,

FOXC1

(-9,0 gange) og

FOXC2

(-11,7 gange), blev nedreguleret i Inv-Dsg2 transgene mus. FOXC2 især inducerer epitel-mesenkymale overgang og spiller en rolle i øjenlåg lukning [26,27]. Knockdown af FOXC2 udtryk i brystkræftceller ophæver deres metastatiske potentiale [28], implicerer sin rolle i udviklingen af ​​kræft. Rolle FOXC2 i huden homeostase og udviklingen af ​​kræft er ikke kendt.

(A) Totalt RNA blev isoleret fra huden af ​​2 vildtype- og 2 Inv-Dsg2 transgene mus, revers transkriberet, biotinmærket og påført en muse cDNA microarray. Den dendogram (zonekort) viser, at 492 gener var enten opreguleret (rød /orange) eller nedreguleret (blå /grøn) i transgene (T1 og T2) og kontrol (W1 og W2) mus. (B) vulkan plot viser log2 (fold ændring) i x-aksen versus-log10 (p-værdi) i y-aksen. De spidser med en fold-change mindre end 2 (log2 = 1) er vist i gråt. De lodrette grønne linjer afgrænse hvor fold ændring er lig med 2 (højre linje) eller lig-2 (venstre linje). Den vandrette grønne linie afgrænser hvor p-værdi er 0,05, med point over den linje, der har p 0,05 og punkter under stregen har p 0,05. Afbildet i rødt er de gener, der udviser en større end 2 gange ændring med en p 0,05 i transgene epidermis sammenlignet med kontrol. Pilene angiver gener af interesse. (C) Kvantitativ real-time RT-PCR-analyse afslører et gennemsnit på 34,33 ± 1,32 gange stigning i Dsg2 RNA-ekspression i Inv-Dsg2 transgene (Tg) sammenlignet med den for vildtype (WT). Desuden RNA udtryk for transgen i forhold til kontrol var:

Csta1

, 113,24 ± 2,23;

Csta2

, 1227,04 ± 1,26;

Csta2l1

, 1,11 ± 0,47;

Csta3

, 26,97 ± 0,44 (Bar = middel ± SD (* p 0,05; ** p 0,01; *** p 0,001;. Student s

t

test)

Tabel 2 viser de ti bedste gener, der blev moduleret som svar på Dsg2. Denne liste består af koder for proteiner, der er impliceret i tumorigenese herunder L-threonin dehydrogenase (

TDH

, 39,2 gange ) og cystein-rige sekretorisk protein (

CRISP3

, 8,8 gange) det mest overraskende resultat var den forøgede udtryk for CSTA (

Csta1

, 18,4 fold;.

Csta2

, 5.7 fold, og

Csta3

, 12,4 gange) og flere medlemmer af S100 familie af calcium bindende proteiner (

S100A8

, 7,9 fold;

S100A9

, 4,1 fold, og

S100A4

, 2,3 gange) (fig 1B.. tabel 3) De S100A8 og S100A9 proteiner danner et kompleks kaldet calprotectin, som udviser antimikrobielle aktiviteter og er vist at beskytte epitelceller mod invaderende patogener [29]. endvidere blev det gen ekspression af fire medlemmer af cyclin familie af proteiner også steget, herunder cyclin A2 (

Ccna2

, 5,8 gange), cyclin B2 (

Ccnb2

, 5,4 gange), cyclin B1 (

CCNB1

, 4,6 gange), og cyclin E1 (

Ccne1

, 2,6 gange), mens ekspressionen af ​​et medlem, cyklin A1 (

Ccna1

, -2,0 fold ) viste sig at være nedsat (tabel 3). Cyclinfamilien af ​​proteiner regulerer cyclinafhængige kinaser og styrer progressionen af ​​celler gennem cellecyklussen [30]. Dette fund er i overensstemmelse med vores tidligere resultater viser, at Dsg2 forbedrer celleproliferation. CSTA har vist sig at have anti-apoptotisk aktivitet [31], opreguleres i flere epiteliale-afledte maligniteter herunder SCC [32], og er muteret i nedarvede celle-celleadhæsion defekt epidermale sygdomme [17-19]. Endvidere CSTA inhiberer cathepsiner [33,34], som også dereguleret i hudkræft [35-37]. Af disse grunde har vi fokuseret resten af ​​denne undersøgelse om CSTA. Den funktionelle relevans S100 og cyclin proteiner vil blive undersøgt nærmere i en kommende undersøgelse.

Bekræftelse af Dsg2-modulation af CSTA udtryk

De microarray resultater blev bekræftet ved at undersøge ekspressionen af ​​muse CSTA mRNA (1, 2, 2L1 og 3) ved RT-PCR (S3 fig.) og real-time qPCR (fig. 1C). Først blev totalt RNA isoleret fra huden af ​​to individuelle repræsentative vildtype- og Inv-Dsg2 transgene mus, blev cDNA genereret og anvendt som en skabelon til PCR bekræftede opreguleringen af ​​

Dsg2

,

Csta1

,

Csta2

, og

Csta3

i transgen sammenlignet med kontrolmus (S3 fig.). Ingen ændring i RNA-ekspression blev observeret med

Csta2l1

og

GAPDH

. Csta2l1 er kraftigt udtrykt i føtal lever, knoglemarv og milt og blev anvendt her som en negativ kontrol for hud [38]. RT-PCR-data blev yderligere valideret af real-time qPCR hjælp hudbiopsier fra 3 vildtype- og 3 transgene mus (fig. 1C). Igen, opregulering af

Dsg2

(34,33 ± 1,32) blev observeret i huden fra transgene mus i sammenligning med hud fra kontroldyr. Ved real-time qPCR, observerede vi en stigning i

Csta1

(113,24 ± 2,23),

Csta2

(1227,04 ± 1,39), og

Csta3

(26,97 ± 0,44) , men ikke

Csta2l1 Hotel (1,11 ± 0,47). Med undtagelse af

Csta2l1

, alle ændringer fra transgene forhold til kontrolprøver var statistisk signifikante. Interessant nok fold-change forskel opnået ved real-time qPCR var signifikant anderledes end opnået fra microarray analyse. Dette er ikke usædvanligt, og er blevet observeret i andre systemer [39]. Sammenfattende qPCR analyse bekræftede microarray data, som viser, at ektopisk ekspression af Dsg2 i epidermis forårsagede en stigning i RNA-ekspression af muse

CSTA

familie af proteiner, og at denne forøgede ekspression er reguleret af overekspression af Dsg2 i huden.

Dernæst hud lysater fra nyfødte og voksne kontrol mus (n = 3 hver) blev immunoblottedes for CSTA afsløre højt niveau i nyfødte hud, men faldt dramatisk i voksne hud (fig. 2A), der bekræfter med tidligere observationer [40]. Interessant, observerede vi begge cytoplasmatisk og nuklear farvning for CSTA i nyfødte mus huden ved immunfluorescens (Fig. 2B). Der sås ingen signifikant forskel i CSTA plan mellem vildtype og Inv-Dsg2 transgene nyfødte mus (ikke vist). Men da CSTA var lav i huden af ​​voksne mus, ektopisk ekspression af Dsg2 dramatisk forøget CSTA niveau (fig. 2C). Flag-antistof detekteret Flag-tagget Dsg2 protein i transgene men ikke vildtypemus (fig. 2C). Lignende resultater blev observeret ved anvendelse af Dsg2 specifikke antistof 10D2 påviser, at ektopisk ekspression af Dsg2 i de overfladiske epidermis ændrede ikke det endogene Dsg2 niveau (data ikke vist). På grund af karakteren af ​​antistofferne, vi var ude af stand til at udføre co-immunfarvning for Dsg2 og CSTA. Imidlertid blev betingelser optimeret til immunfarvning for Flag-tagget Dsg2 (anti-FLAG-antistoffer) og CSTA (fig. 2D). I Dsg2 Tg huden, blev CSTA udtrykkes i celler uanset transgenekspression, hvilket antyder en ikke-selvstændige virkning. Farvning for CSTA blev også påvist i de corneocytter af vildtypemus og voksede i de transgene mus (fig. 2D). Selvom CSTA ikke blev registreret af Western blot ved hjælp af samlede hud lysater, kan vi ikke udelukke, at i forhornede kuvert, kan CSTA være yderst tværbundet og dermed modstandsdygtig over for lyse i SDS /DTT lysisbuffer.

(A ) Western blot-analyse af hud lysater fra 3 nyfødte og 3 voksne C57BL6-mus viser høj ekspression af CSTA i nyfødte, men næsten ikke målbart i voksne hud. Actin blev anvendt som en kontrol for lige belastning. (B) immunfluorescensfarvning bekræfter Western blotting-resultater, som viser højt CSTA i nyfødte vildtype mus hud. Forstørret billede i indsatte viser cytoplasmatisk samt nuklear farvning for CSTA. (C) Western analyse for Dsg2 og CSTA i voksne vildtype- og Inv-Dsg2 transgene mus hud. Resultaterne viste ekspression af FLAG-mærket Dsg2 og CSTA i transgene men ikke vildtypemus. Actin viste lige belastning. (D) Immunofluorescens blev udført på voksne hud af vildtype og transgene mus afslører forøgede niveauer CSTA i transgen hud. Kerner blev counter-farvet med DAPI (blå).

I modsætning til i human med kun én

CSTA

gen, der er flere

CSTA

gener i mus [41 ]. Mens microarray analyse opdaget tre

Csta1

,

Csta2

og

Csta3

, er det ukendt hvilke isoform udtrykkes i musen huden. Desuden vides det ikke, hvilken mus CSTA er anerkendt af de kommercielt tilgængelige antistoffer, da epitoper for disse ikke er kortlagt. vi spekulere dog, at antistofferne kan anerkende alle Cstas grund af høj sekvenshomologi mellem menneske og mus og mellem de forskellige mus isoformer.

Dsg2 modulerer CSTA udtryk

For at afgøre, om Dsg2 modulerer human CSTA i keratinocytter blev A431-celler behandlet med siRNA som er specifikt for Dsg2 (siDsg2), CSTA (siCSTA) eller krypteret RNA (scrRNA). Tre dage efter transfektion med scrRNA og siCSTA viste Western blot-analyse, at knockdown af CSTA ikke påvirkede ekspressionen af ​​Dsg2 (S4 Fig.). I modsætning hertil en dramatisk reduktion af Dsg2 af siDsg2 men ikke scrRNA, resulterede i små, men reproducerbar reduktion af CSTA (fig. 3A, B). For yderligere at bekræfte virkningen af ​​Dsg2 på CSTA ekspression blev etableret en stabil A431 cellelinier med knockdown af Dsg2 med korte hårnål RNA (shRNA) [24]. Immunoblotting viste, at Dsg2 signifikant blev nedreguleret i shDsg2 celler, sammenlignet med shGFP celler (Fig. 3C, D).