Abstrakt
I et to-trins strategi, en intraperitoneal (IP) injektion af poly (ethylenglycol) –
blokere
poly (ε-caprolacton) (PEG
b
-PCL) miceller indeholdende paclitaxel (PTX), cyclopamin (CYP), og gossypol (GSP) ved 30, 30 og 30 mg /kg, debulked tumorvæv med 1,3-fold, baseret på tab af bioluminescens med 10% kropsvægt forandring, og induceret apoptose i peritoneale tumorer, når de anvendes som neoadjuverende kemoterapi (NACT) i en ES-2-luc-bærende xenograft model for kræft i æggestokkene. I et andet trin, en enkelt intravenøs (IV) injektion af apoptose-targeting GFNFRLKAGAKIRFGS-PEG
b
-PCL miceller indeholder en nær-infrarødt (NIR) fluorescens sonde, dir (1,1′-dioctadecyltetramethyl indotricarbocyanine iodid), resulterede i øget peritoneal dir akkumulation i apoptose-induceret ES-2-Luc tumorvæv (
ex vivo
) med 1,5 gange sammenlignet med DIR molekyler leveret af methoxy PEG
b
-PCL miceller (ikke-målrettede) ved 48 timer efter intravenøs injektion i et andet trin. Som et resultat, en tandem af PEG
b
-PCL miceller aktiveret høj opløsning påvisning af
ca
. 1 mm diameter tumorer, hvilket resulterer i resektion af ca. 90% af tumorer og en lav peritoneal cancer indeks (PCI) på
CA
. 7. Således er en tandem af PEG
b
-PCL miceller anvendes til NCAT og NIR fluorescens billeddannelse af terapi-induceret apoptose til intraoperativ kirurgisk vejledning kan være en lovende behandling strategi for metastatisk kræft i æggestokkene.
Henvisning: Cho H, Cho CS, Indig GL, Lavasanifar A, Vakili MR, Kwon GS (2014) polymermiceller for apoptose-Målrettet Optical Imaging af kræft og intraoperativ Kirurgisk vejledning. PLoS ONE 9 (2): e89968. doi: 10,1371 /journal.pone.0089968
Redaktør: Sung Wan Kim, University of Utah, USA
Modtaget: November 7, 2013; Accepteret: 23 Januar 2014; Publiceret: 26 feb 2014
Copyright: © 2014 Cho et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (R21 CA-161.537) og Carbone Cancer center på University of Wisconsin-Madison. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
kræft i æggestokkene er portrætteret som den sygdom, der hvisker skyldes de indolente symptomer på tidlige stadier [1]. Desværre er der ingen effektive screeningstest: generel screening af serum cancer antigen 125 (CA 125) eller transvaginal sonografi ikke tillader tidlig påvisning af kræft i æggestokkene. Delvis på grund af vanskelighederne ved diagnose, ovariecancer er den mest dødbringende gynækologiske malignitet [2]. Den konventionelle strategi behandling for kræft i æggestokkene involverer en kombineret tilgang udnytter aggressiv cytoreduktive kirurgi og intravenøs (IV) kemoterapi (platin og taxan analoger) [3].
I det sidste årti, en potentiel fordel af kemoterapi givet gennem intraperitoneal (IP) vej til æggestokkræft er set i flere kliniske undersøgelser, og det er blevet fremhævet, at IP-kemoterapi kan give høje svarprocenter i maven på grund af den peritoneal plasma barriere begrænse eksponering af kemoterapi for peritoneale overflader, hvilket resulterer i højere narkotika koncentration i peritonealhulen [3].
Kirurgi er kritisk for patienter med kolorektale og ovariecancere, der har spredt bredt til bughulen. Der er tre typer af kirurgisk debulking, der er blevet forsøgt at behandle kræft i æggestokkene patienter: (1) primær debulking kirurgi (indledende kirurgi), som i vid udstrækning har været standard tilgang; (2) interval debulking operation efter neoadjuverende kemoterapi (NACT), forbeholdt patienter, der er medicinsk uegnede til øjeblikkelig operation, eller hvis omfattende metastaser kan ikke oprindeligt resektion; og (3) sekundær debulking kirurgi (yderligere kirurgi), for patienter, der udvikler tilbagevendende kemoterapi kræft i æggestokkene [1]. Selv om den optimale kirurgiske tilgang forbliver kontroversiel, er det meget tydeligt, at forbedrede intraoperative kræft billeddannende systemer vil give betydelige fordele for en vellykket kirurgisk debulking af kræft i æggestokkene. Selvom radiologiske metoder såsom computertomografi (CT) og magnetisk resonans imaging (MRI) har været til stor hjælp i at karakterisere maligniteter indenfor bughulen, er de ikke nyttige for intraoperativ vurdering. I modsætning hertil er fluorescens billeddannelse vist sig at være en succes i prækliniske og kliniske undersøgelser som en optisk teknik, der tilbyder real-time billeder af kirurgiske mål (peritoneal carcinomatose og brystkræft) med tilstrækkelig billedbehandling opløsning og høj intraoperativ følsomhed [4] – [8] . Coll og kolleger rapporterede, at intraoperativ nær-infrarøde (NIR) fluorescensbillede-guidet kirurgi ved anvendelse af en tumor-målrettende peptid, RAFT-c (RGDfK)
4-Alex Fluor 700 (IV route) i en TSA-pGL3-bærende musemodel for peritoneal adenocarcinom kunne forbedre kvaliteten af kirurgiske debulking ved at fordoble antallet af detekterede tumorknuder og afkorte driftstid [5]. Ntziachristos og kolleger succes gennemført den første menneskelige forsøg med intraoperativ tumor-specifik fluorescens billeddannelse i iscenesættelse og debulking operation for kræft i æggestokkene ved hjælp IV folat-FITC, og beviste, at antallet af tumorer opdaget af kirurger under vejledning af tumor-specifikke fluorescens billeder øget med 5,3-fold (34
vs.
7) sammenlignet med hvidt lys visuel observation alene [7]. Frangioni og medarbejdere viste også anvendeligheden af FLARE (Fluorescens-Assisted Resektion og Exploration) enhed til billedet-guidede onkologisk kirurgi i første humane kliniske forsøg med brystkræft skildvagtslymfekirtel (SLN) kortlægning efter intratumoral /subkutan injektion af en :1 blanding af indocyaningrøn og humant serumalbumin (ICG: HAS) [6]. I dette forsøg SLNs identificeret ved lymphoscintigraphy og NIR fluorescens billeddannelse var identiske i 4 af 6 brystkræftpatienter
Anvendelse af nanomaterialer som optisk fluorescens billeddannelse midler ved anvendelse quantum dots, guld nanopartikler og fluorescens probe-holdige eller. – konjugerede nanopartikler har henledt opmærksomheden til diagnostiske formål i prækliniske undersøgelser [9] – [13]. Polymere miceller tilhører en større klasse af nanomaterialer, der har indgået en række kliniske forsøg til levering af narkotika,
f.eks
. SP-1049C (doxorubicin, fase II), Genexol-PM (paclitaxel, fase II), og NC-6004 (cisplatin, fase I) [14]. Polymere miceller tilbyde flere fordele, ikke blot som lægemiddelbærere men også som optisk billeddannelse agenter i onkologi: lille størrelse-partikler med smal størrelsesfordeling, strukturel stabilitet, høj vandopløselighed, lav toksiske bivirkning i forhold til konventionelle tensider (
f.eks
. Cremophor EL), præferentielle ophobning ved solide tumorer gennem øget permeabilitet og fastholdelse (EPR) effekt, unddrage renal filtration, og multifunktionalitet ved overfladen dekoration.
Det er blevet diskuteret, at apoptose målrettet drug delivery og kræft imaging ( specielt til billeddannelse tumor respons på kemoterapi) [15], [16] kunne være overlegen end cancer-associeret antigen eller protein-targeting strategi i en bred vifte af maligne lidelser, fordi en betydelig heterogenitet i kræft celle populationer ikke garanterer den eksklusive tilstedeværelse af antigen og protein biomarkører i målvæv [17]. Kirurgiske onkologer kunne drage fordel af apoptose målrettet tumor imaging (uafhængigt af celletype og celledød-fremkaldende triggere) efter NACT med større præcision og nøjagtighed [18]. Således kirurgisk tumor debulking hjælp intraoperativ visuel vejledning med realtid NIR fluorescens billeder kan resultere i forbedret kirurgisk præcision og resultat. En af de mest fremtrædende kendetegn ved programmeret celledød, apoptose, er eksternalisering af phosphatidylserin (PS), som normalt er bosat overvejende indre folder af plasmamembranen [18].
I vores tidligere arbejde, vi rapporteret at poly (ethylenglycol) –
blokere
poly (ε-caprolacton) (PEG
b
-PCL) miceller indeholder dir (1,1′-dioctadecyltetramethyl indotricarbocyanine iodid) kunne passivt akkumulerer i LS180 humane faste kolon tumorvæv ved EPR og tilvejebringe invasiv afgrænsning af LS180 tumorvæv med en tumor-til-muskel-forhold på 30-43 fra indsamlede væv [19]. Vi observerede også forbedret dir akkumulering i “primede” LS180 tumorvæv efter en IV injektion af multi-drug indeholdende poly (ethylenglycol) –
blokere
-poly (
D, L-mælkesyre) (PEG –
b
-PLA) miceller, hvilket tyder tilgængeligheden af en tandem af polymere miceller, der eventuelt kunne muliggøre forbedret tumor afgrænsning til brug i kirurgisk onkologi [20]. For nylig PEG-
b
-PCL miceller med paclitaxel (PTX), cyclopamin (CYP), og gossypol (GSP) ved 30, 30 og 30 mg /kg (q7d x 3) leveret gennem IP, forhindrede metastatisk spredning af kræft i æggestokkene og omfattende ascites dannelse, hvilket resulterer i forlænget overlevelse i peritonealt metastatisk ES-2-luc (udifferentieret adenocarcinom, aggressiv undertype) og SKOV-3-luc (serøst adenokarcinom, moderat-grade undertype) murine xenograft modeller af ovariecancer [21].
Vi foreslår en ny to-trins strategi for NACT, apoptose målrettet optisk billeddannelse og intraoperativ kirurgisk vejledning (figur 1). I første trin, PEG
b
-PCL miceller indeholder PTX, CYP, og GSP bruges til IP NACT og apoptose induktion i tumorvæv. I et andet trin, kan apoptose målretning PEG
b
-PCL miceller indeholder dir aktivt ophobes i apoptotiske tumorvæv, tillader optisk fluorescens billeddannelse af apoptose i en real-time måde (figur 1). DIR-molekyler, NIR fluorescens prober udsender lys i NIR bølgelængde vinduet, kunne være nyttig som en optisk fluorescensafbildning agent, undgå stærk autofluorescens fra hud og blod og tillader detekterbare signaler, der skal måles gennem flere millimeter væv [22]. I dette arbejde, viser vi, at denne to-trins strategi forbedret tumor afgrænsning i NIR fluorescens optisk billeddannelse og forudsat nyttig rettesnor for interval debulking kirurgi i en IP ES-2-luc-bærende xenograft model af kræft i æggestokkene, kobling to anvendelser af polymere miceller i drug delivery og optisk billeddannelse til kirurgisk onkologisk behandling af kræft i æggestokkene.
Materialer og metoder
Udarbejdelse af PEG
b
-PCL Miceller Regnskabsmæssig PTX, CYP , og GSP
Drug-loaded PEG
b
-PCL miceller fremstilles ved en solvent fordampning metode som tidligere beskrevet [21]. Kort fortalt, 4,0 mg PTX, CYP, og GSP hver og 120 mg PEG-
b
-PCL (M
n af PEG = 5.000 g /mol, M
n af PCL = 10.000 g /mol, og M
w /M
n = 1,26) (Advanced Polymer Materials Inc., Montreal, Canada) blev fuldstændig opløst i 1,0 ml acetone efterfulgt af en hurtig tilsætning af 1,0 ml forvarmet 0,9% saltvand ved 60 ° C med kraftig blanding. Acetone blev afdampet under reduceret tryk ved 60 ° C. Den vandige micelle opløsning blev centrifugeret i 5 minutter ved 10.000 ×
g
og ledes gennem en 0,2 um regenereret cellulose (RC) steril sprøjte filter (Corning, Tewksbury, MA) for at fjerne uopløselige stoffer. Indholdet af PTX, CYP, og GSP i PEG-
b
-PCL miceller blev kvantificeret ved omvendt fase-HPLC (RP-HPLC) under anvendelse af en Shimadzu Prominence HPLC-system (Himadzu, Japan) som tidligere beskrevet [ ,,,0],21]. Adskillelsen af PTX, CYP, og GSP blev gjort i en isokratisk tilstand med mobil fase af 55% acetonitril, 45% destilleret vand, og 0,1% trifluoreddikesyre. PTX, CYP, og GSP blev overvåget ved 227, 204, og 373 nm, og elueres ved 2,7 min, 1,9 min, og 10,6 min.
Varer af apoptose-targeting PEG
b
-PCL og methoxy-PEG
b
-PCL Miceller Carrying dir
Udarbejdelse af apoptose-targeting PEG
b
-PCL (GFNFRLKAGAKIRFGS-PEG
b
-PCL) miceller bærer dir blev startet med omdannelsen af acetal grupper på overfladen af PEG
b
-PCL miceller til aldehydgrupper (Figur S1). Acetal-PEG
b
-PCL (M
n af PEG = 5.000 g /mol, M
n af PCL = 5.000 g /mol, og M
m /M
n = 1,13) blev venligst stillet til rådighed af Dr. Afsaneh Lavasanifar, University of Alberta (Edmonton, Canada). Konverteringen Metoden var lidt modifikation fra litteraturen [23]. Acetal-PEG-
b
-PCL copolymer blev opløst i acetone ved en koncentration på 20 mg /ml. Destilleret vand blev derefter hurtigt tilsat til polymeropløsningen under kraftig omrøring ved stuetemperatur efterfulgt af afdampning af acetone under reduceret tryk ved stuetemperatur. Micellen opløsning blev centrifugeret i 5 minutter ved 10.000 ×
g
og ledes gennem en 0,2 um RC sterilt sprøjtefilter. Omdannelse af acetalgrupper på acetal-PEG-
b
-PCL miceller blev udført ved pH 2,0 ved tilsætning af 0,5 N HCI. Efter 4 timers moderat omrøring ved stuetemperatur blev reaktionsblandingen neutraliseret med 0,5 N NaOH for at stoppe reaktionen. Den neutraliserede micelle opløsning blev derefter dialyseret mod vand med dialysemembran (MWCO 6.000 g /mol) for at fjerne saltet natten over og lyofiliseres i 48 timer til den fremtidige anvendelse. Lyofiliseret prøve blev opløst i CDC
3 (6 mg /ml) for at estimere den omregningskurs fra acetal til aldehydgruppen på PEG
b
-PCL af
1H NMR. Frit peptid, GFNFRLKAGAKIRFGS (UW Biotechnology Center, Madison, WI) ved Mw = 1.769 g /mol (figur 2A), blev opløst i HEPES buffer (10 mM, pH 6,4) og blandes med det lyofiliserede aldehyd-PEG-
B
-PCL miceller for at opnå 4 mg /ml polymer og 0,35 mg /ml peptidkoncentration på 02:01 molforhold (aldehyd-PEG-
b
-PCL: GFNFRLKAGAKIRFGS). Efter 2 timers moderat omrøring blev NaBH
3CN (10 ækv) tilsat til blandingen for at reducere Schiff-base. Efter 4 dage blev micelleopløsning igen dialyseret mod vand med dialysemembran (MWCO 6.000 g /mol) natten over og derefter GFNFRLKAGAKIRFGS-PEG-
b
-PCL micelle opløsning blev lyofiliseret i 48 timer. Konjugeringen effektivitet peptid på aldehyd-PEG-
b
-PCL blev bestemt ved RP-HPLC-analyse. Kort fortalt blev prøver (10 pi) injiceres i en Zorbax 300SB-C18-søjle (4,6 x 15 mm, 3,5 um, Agilent) holdt ved 40 ° C, og strømningshastigheden var 0,8 ml /min. Gradienteluering blev udført med den mobile fase af 0,1% trifluoreddikesyre i destilleret vand og 0,1% trifluoreddikesyre i 90/10 (vol /vol) acetonitril /destilleret vand. Den mobile fase blev programmeret som følger: 0 min 85% A opløsningsmiddel og 15% opløsningsmiddel B; 35 min, 50% opløsningsmiddel A og 50% opløsningsmiddel B. Frit peptid blev overvåget ved 215 nm og elueres ved 16 minutter. Mængden af peptid konjugeret på PEG
b
-PCL miceller blev beregnet ved at fratrække mængden af fri peptid fra mængden af peptid oprindeligt tilføjet til reaktion. Sideløbende frysetørret peptid konjugeret på PEG
b
-PCL blev opløst i DMSO
d
6 (6 mg /ml) for at beregne konjugation på peptid på PEG
b
-PCL af
1H NMR ved 80 ° C.
Resultaterne er præsenteret som% FLI dir molekyler bundet på plader og% FLI fra dir molekyler bundet på ES-2-luc æggestokkene tumor sfæroider. BLI fra ES-2-Luc celler og FLI fra DIR molekyler blev kvantificeret ved hjælp Xenogen IVIS 200-serien. (A) Kompetitiv binding test af apoptose-targeting PEG-
b
-PCL miceller der bærer dir (1,0 pM peptid og 500 nM dir) til PC- eller PS-coatede 96-brønds plader (i alt 200 pM phospholipid ). (B) Competitive binding test af apoptose-targeting PEG
b
-PCL miceller bærer dir til apoptose-induceret ES-2-Luc æggestokkene tumor sfæroider (** 0,01, *** 0,001) .
methoxy-PEG
b
-PCL og apoptose målretning PEG
b
-PCL miceller bærer dir fremstilles ved en solvent fordampning metode: 4.0 mg af polymerer og 0,1 mg DIR (Invitrogen, Carlsbad, CA) blev opløst i 1,0 ml acetone, efterfulgt af en hurtig tilsætning af PBS (10 mM, pH 7,4) under kraftig blanding. Acetone blev afdampet under reduceret tryk ved stuetemperatur. Den vandige micelle opløsning indeholdende DIR blev centrifugeret i 5 minutter ved 10.000 ×
g
og ledes gennem en 0,2 um RC steril sprøjte filter for at fjerne ikke-inkorporeret dir. Indholdet af dir i miceller blev kvantificeret ved RP-HPLC som tidligere beskrevet [20]. Elueringen af dir blev gjort i en gradient måde med mobil fase af 70% destilleret vand og 0,07% trifluoreddikesyre som opløsningsmiddel A og 30% acetonitril og 0,03% trifluoreddikesyre som opløsningsmiddel B. dir blev monitoreret ved 745 nm og elueret ved 16 min.
Fysisk karakterisering af methoxy-PEG
b
-PCL og apoptose-targeting PEG
b
-PCL Miceller Carrying dir
Z -Gennemsnitlig diametre af methoxy-PEG
b
-PCL miceller og apoptose-targeting PEG
b
-PCL miceller bærer dir blev bestemt ved dynamisk lysspredning (DLS) målinger ved hjælp Zetasizer Nano- ZS (Malvern Instruments, Storbritannien) ved 25 ° C med en påvisning vinkel på 173 ° og en He-Ne-ion laser (4 mW, λ = 633 nm) for den indfaldende stråle. Autokorrelationsfunktioner blev skabt på grundlag af cumulant analyse, beregning af den hydrodynamiske diameter af miceller fra Stokes-Einstein-ligningen og polydispersitetsindekset (PDI). Før målingerne blev micelle opløsninger fortyndet med PBS (10 mM, pH 7,4) for at give en polymerkoncentration på ~ 0,4 mg /ml, der repræsenterer koncentrationen polymer over den kritiske micellekoncentration. Dir belastningseffektivitet blev vist som% vægt dir /vægt polymer.
in vitro
dir release kinetik methoxy-PEG
b
-PCL og apoptose målretning PEG
b
-PCL miceller bærer dir blev undersøgt for at estimere den tid til 50% medikamentfrigivelse (t
1/2) baseret på en en-faset henfald model ved hjælp af GraphPad Prism-version 5.00 til Mac OS X (La Jolla, CA). DIR-loaded miceller, repræsenterer 100 ug /ml DIR, blev tilsat i dialyse-kassetter (MWCO 20.000 g /mol) og kassetter blev placeret i 2,0 I PBS (10 mM, pH 7,4) ved 37 ° C under moderat omrøring. Prøver (20 μΛ blev udtaget fra kassetter på forskellige tidspunkter, 0, 0,5, 1, 2, 3, 8, 12 og 24 timer og efter hver prøvetagning blev kassetter genopfyldes med 20 μΛ frisk PBS (10 mM, pH 7,4 ). indholdet af dir i miceller tilbage i kassetter blev analyseret ved RP-HPLC som beskrevet ovenfor.
Vurdering af PS-selektiv binding af apoptose-targeting PEG-
b
-PCL miceller Carrying DIR
Binding af apoptose-targeting PEG
b
-PCL miceller bærer dir til PS blev vurderet ved hjælp af phospholipid-belagt brønde [24] og 3-D tumor sphæroider dannet af luciferase-udtrykkende ES-2-Luc celler. PC eller PS solubiliseres i ethanol blev immobiliseret på klar-bottom 96-brønds plader ved en koncentration på ca. 200 pM i hver brønd, og ethanol blev afdampet ved stuetemperatur natten over. Nogle af PC eller PS-overtrukne brønde blev inkuberet med 1,0 uM frit peptid i 3 timer for at mætte PS på phospholipid brønde. Apoptose-targeting PEG
b
-PCL miceller bærer dir, der repræsenterer 1,0 uM peptid og 500 nM på Dir, blev tilsat til brøndene og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur i mørke. Hver brønd blev vasket med PBS (10 mM, pH 7,4) og apoptose-målretning PEG-
b
-PCL miceller der bærer dir bundet på brønde blev påvist ved Xenogen IVIS 200 Series (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) . ES-2-Luc 3-D tumor sfæroider blev dannet ved at udplade 5.000 ES-2-luc celler /brønd i agarose-coatede 96-brønds plader og inkuberet i 4 dage. ES-2 humane ovariecancerceller blev stabilt transficeret med luciferase–udtrykkende plasmid pGL4.51 indeholdende neomycinresistensgen (Promega, Madison, WI) under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) som tidligere beskrevet [21]. ES-2-Luc celler blev dyrket i McCoys 5a medium suppleret med 1% L-glutamin, 10% føtalt bovint serum, 1% penicillin /streptomycin, og 750 ug /ml G418 antibiotika og holdt ved 37 ° C under en atmosfære af 5 % CO
2 i en fugtig inkubator. PEG-
b Salg -PCL miceller indeholdende PTX, CYP, og GSP (3,3, 3,3, og 3,3 nM) blev tilsat til ES-2-Luc tumor sfæroider og inkuberet i 3 dage. Nogle af behandlede ES-2-Luc sfæroider blev inkuberet 3 timer med 200 nM af frit peptid at mætte PS eksponeret på tumor sfæroider. Apoptose-targeting PEG-
b
-PCL miceller der bærer dir blev derefter tilsat til ES-2-Luc tumor sfæroider ved en slutkoncentration på 200 nM peptid og 100 nM DIR og inkuberet i 30 minutter ved 37 ° C i 5% CO
2 befugtet inkubator. Som en kontrol, bioluminescens intensiteten af ES-2-Luc celler blev også overvåget for at sikre, at ES-2-Luc tumor sfæroider blev konsekvent dannet i hver brønd under anvendelse Xenogen IVIS 200 Series.
Intraperitoneal human ovariecancer xenograft og Micelle Behandlinger
Kvinde 6-8 uger gamle athymiske nøgne Foxnl
nu-mus blev erhvervet fra Harlan Laboratories (Madison, WI). Alle eksperimenter dyr blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health (NIH). Den etiske og human brug af dyr er blevet rådgivet af All Campus Animal Planlægning og rådgivende udvalg (ACAPAC) og protokollen blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved University of Wisconsin-Madison (Permit nummer: M02472) . Generel anæstesi blev induceret med 1,5% isofluran /oxygen og opretholdt med 1% isofluran /oxygen. ES-2-Luc celler blev trypsinbehandlet, indsamlet fra sub-konfluente kulturer, og 1 x 10
6 celler /dyr af ES-2-Luc celler blev injiceret i peritonealhulen af bedøvede mus. IP-injektion af PEG-
b
-PCL miceller transporterer 30, 30, og 30 mg /kg af PTX, CYP, og GSP blev udført 7 dage efter IP inokulering af ES-2-Luc celler efter observation af bioluminescens signal i hele kroppen billeder af dyr ved Xenogen IVIS 200-serien. En dag efter IP injektion af PEG
b
-PCL miceller indeholder PTX, CYP, og GSP, methoxy eller apoptose-targeting PEG
b
-PCL miceller transporterer 250 ug /kg dir blev injiceret gennem halevenen af bedøvede dyr. Body dyrs vægt blev målt ved en bærbar skala, og generelle udseende og dødelighed hos dyrene blev omhyggeligt overvåges under alle sæt dyreforsøg. blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse af dyr. Dyr blev aflivet ved medicinsk kvalitet carbondioxid med strømningshastigheden for 10-30% af eutanasi kammerets volumen pr minut.
TUNEL Assay
ES-2-luc-bærende xenograft blev doseret gennem IP rute med PEG-
b
-PCL miceller transporterer PTX, CYP, og GSP på dag 7 efter ES-2-Luc celler blev inokuleret i bughulen. Bagefter dyr (
n
= 4) blev aflivet ved 0, 12, 24, 48, og 72 timer efter micelle behandling. Tumor, milt, nyre og levervæv blev dissekeret. DNA-fragmentering induceret af apoptose blev påvist i væv af TdT-medieret dUTP nick-endemærkning (TUNEL) fremgangsmåde under anvendelse deadend fluorometrisk TUNEL-assay kit (Promega, Madison, WI). Væv blev fastfrosset opdelt i 10 um skiver, permeabiliseret ved proteinase K, og fikseret med 4% formaldehyd. Reaktionsblandingen består af TdT og fluoresceinmærket dUTP blev tilsat til faste afsnit af væv og inkuberet i 1 time ved 37 ° C i et fugtigt kammer i mørke. Fluorescein-mærkede DNA-fragmenter og kerner af celler couterstained af DAPI blev visualiseret ved 520 nm og 460 nm under anvendelse af et konfokalt mikroskop (Olympus FV1000 FluoView, Minneapolis, MN). Apoptotiske celler og kerner af celler blev vist i grøn og blå, henholdsvis.
bioluminescens og fluorescens Imagings
Xenogen IVIS 200-serien blev brugt til billedet både bioluminescens og fluorescens fra objekter
in vitro
,
in vivo
, og
ex vivo
. Xenogen IVIS 200-serien var udstyret med en 150 W halogenkvartslampe og en 1 mW power scanning laser. Billeder blev vist på skærmen, med den rumlige opløsning af 60 um /pixel. Bioluminescens billeder blev erhvervet af en ladet par anordning (CCD) kamera med følgende parametre: eksponeringstid = 1 s, binning = medium, og f /stop-= 2.
In vitro
, D-luciferin (Caliper Life Science, Hopinton, MA) ved 10 ug /brønd blev tilsat til ES-2-luc tumor sfæroider 5 min før bioluminescens billeddannelse, og
in vivo
, D-luciferin til 113 mg /kg blev injiceret IP i ES-2-luc-bærende xenograftmodel 5 minutter før hele kroppen bioluminescens billeddannelse. Den dynamiske af ES-2-luc tumorvækst blev opsamlet og vist som farvekodede billeder ved hjælp af Live-Imaging software til kvantitativ analyse og BLI af ES-2-Luc tumorer blev skaleret med totale tællinger.
Fluorescens billederne var også erhvervet af en ladet par anordning (CCD) kamera med følgende parametre: eksponeringstid = 1 s, binning = medium, og f /stop-= 2. et filter indstilling for dir detektion blev fastsat til 745 nm for excitation og ved 800 nm for emission. Alle farvekodede billeder blev indsamlet ved hjælp Levende Imaging software til indsamling og analyse image. FLI på Dir blev påvist ved gennemsnitlig strålende effektivitet, samlede fotoner per sekund per kvadratcentimeter per steradian i irradiansen område (microwatts per kvadratcentimeter): [ps
-1cm
-2sr
-1] /[ ,,,0],uW cm
-2]. Fluorescensen af dir i tumorvæv blev bestemt ud fra den gennemsnitlige strålende effektivitet ved ROI tegnet omkring tumorvæv forudindstillet af bioluminescens billeddannelse af et identisk dyr.
Whole-body bioluminescens og fluorescens billeder blev registreret ved 6, 12, 24 , og 48 h skrive en IV injektion af PEG
b
-PCL miceller bærer dir. Musene blev placeret i abdominale positioner for at opnå hel-body farvekodede bioluminescens og fluorescens billeder. Alle indstillinger udstyr til bioluminescens og fluorescens imagings var identiske i tidsforløbet eksperimentet.
Real-tid Fluorescens Imaging Acquisition i Animals
Fluobeam 800 er en 2-D NIR fluorescens imaging system bestående af CCD kamera og en integreret NIR lyskilde (100 mW) med en excitationsbølgelængde på 780 nm og en emissionsbølgelængde på 820 nm. Dette system 7,5 × 10 cm homogene lettet felt og håndbårne system bestående af kamera og laser var placeret ca. 20 cm over objektet. Fluorescens billeder var vist på skærmen med den rumlige opløsning på 110 um /pixel og registreres som enten sort-hvid statiske billeder (9 billeder /sek) eller realtid videoer (25 billeder /sek).
kirurgisk procedure
Dyrene modtog en IP-injektion af D-Luciferin (113 mg /kg) 5 minutter før hele legemet bioluminescens billeddannelse på dag 9 efter ES-2-luc celleinokulering (24 timer efter IV injektion af PEG
b
-PCL miceller bærer dir). Efter hele kroppen bioluminescens imaging blev udført, blev dyrene aflivet straks. Alle ofrede dyr undergik en midtlinie laparotomi og bioluminescens hele kroppen billeder af indridset dyr blev opnået igen. Alle kirurgiske fremgangsmåder blev udført på aflivede dyr, og af en kirurgisk onkolog med erfaring i murine kirurgi. I et sæt af eksperimenter (
n
= 4), til sammenligning, blev den traditionelle kirurgiske tumor resektion udføres under normale hvidt lys. Når kirurgisk tumor resektion blev anset for tilfredsstillende, blev dissekeret tumor-lignende væv og slagtekroppen scannet af Xenogen IVIS 200-serien til opnåelse bioluminescens billeder. I en anden gruppe af dyr (
n
= 4), NIR imaging system, Fluobeam 800 NIR imaging system blev tændt og den kirurgiske tumor resektion blev bistået af realtid fluorescens billeder, der vises på skærmen. Når tumor-lignende FLU
+ væv blev udskåret så fuldstændigt som muligt, dissekeret tumor-lignende væv og kadaveret blev scannet under anvendelse af Xenogen IVIS 200-serien til opnåelse bioluminescens og fluorescens billeder. Varigheden af kirurgi blev registreret fra tidspunktet for indsnit til færdiggørelse af tumor debulking. Kirurgisk nøjagtighed blev vurderet ved hjælp af to beregninger: (1)% summen af BLU
+ tumor-lignende væv til summen af de samlede tumor-lignende væv skåret hele den kirurgiske procedure, og (2) totale tællinger af BLI af [ROI i midten -line indridset dyr minus ROI i dissekeret dyr] i forhold til dem af ROI i midten line indridset dyr. Kirurgisk nøjagtighed blev også målt ved at beregne en post-resektion peritoneal cancer indeks (PCI) som beskrevet af Sugarbaker [3]. PCI afhængig af fordelingen og størrelsen af læsioner i maven af dyret. I denne undersøgelse blev PCI tilpasset tumor størrelser i mus med følgende scoringer: Underlivet blev opdelt i 13 regioner, og læsionen størrelse (LS) blev scoret (0 til 3) i hver region som følger: ingen visuelle tumorer (LS = 0), 0 til 0,5 mm tumor (LS = 1), 0,6 til 2,0 mm tumor (LS = 2), 2,0 mm tumor (LS = 3). Total LS score per dyr blev summeres som en numerisk score som kan varierede fra 0 (ingen tumorer observeret) til 39 (13 områder x 3).
Statistical Analysis
Statistisk analyse blev udført under anvendelse envejs ANOVA på 5% signifikansniveau kombineret med Tukeys flere sammenligning test af GraphPad Prism ver 5,00 til Mac OS X (La Jolla, CA).
Resultater
Karakterisering af apoptose-targeting PEG –
b
-PCL Miceller Carrying dir
tabel 1 viser størrelser og belastningseffektiviteter (% vægt dir /vægt polymer) af apoptose-targeting PEG
b
-PCL ( GFNFRLKAGAKIRFGS-PEG
b
-PCL) og methoxy-PEG
b
-PCL miceller opnået efter dannelse DIR-indarbejdet miceller ved en solvent fordampning teknik. Apoptose målretning PEG
b
-PCL miceller havde en z-gennemsnitlig diameter på 83 ± 2 nm (polydispersitetsindeks, PDI 0,1) og methoxy-PEG
b
-PCL miceller havde en z-gennemsnitlige diameter på 45 ± 2 nm (PDI 0.1). Lastning effektivitet DIR for begge miceller var omtrent 2%. Peptid (GFNFRLKAGAKIRFGS) blev konjugeret på PEG-
b
-PCL miceller med det molære konjugering ratio på 30%
via
en Schiff-base-reaktion, baseret på resultater fra både HPLC (subtraktiv kvantificering af ikke -konjugeret peptid fra peptid oprindeligt tilsat til reaktionen) og
1H NMR (kvantificering af konjugeret peptid) analyser (data ikke vist). I
1H NMR-analyse, den relative intensitet forholdet mellem spidsværdien af benzyl protoner i phenylalanin ved δ = 7,2 ppm i peptidet til methylen proton top af PEG protoner ved δ = 3,7 ppm bestemmes niveauet af peptid på PEG-
b
-PCL. Dataene for peptid kvantificering fra HPLC og
1H NMR billede sammenlignelige værdier.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.