PLoS ONE: Discovery og Validering af Molekylær Biomarkører for ende- og tyktarm og kræft med Ansøgning til Blood Testing

Abstrakt

Baggrund Mål

Tyktarmskræft forekomst og dødsfald reduceres med påvisning og fjernelse af den tidlige fase, behandles neoplasi, men vi mangler bevist biomarkører følsomme for både kræft og præ-invasive adenomer. Formålene med denne undersøgelse var at bestemme, om adenomer og cancere udviser karakteristiske mønstre af biomarkør ekspression og til at undersøge, om et væv-opdaget (og valideret) biomarkør udtrykkes differentielt i plasmaet hos patienter med kolorektale adenomer eller cancer.

Metoder

Kandidat RNA biomarkører blev identificeret ved oligonukleotid microarray analyse af kolorektale prøver (222 normal, 29 adenom, 161 adenocarcinom og 50 colitis) og valideret i et tidligere uprøvet kohorte af 68 kolorektal prøver ved hjælp af en specialdesignet oligonukleotid microarray. En valideret biomarkør,

KIAA1199

, blev analyseret ved hjælp af QRT-PCR på plasma udvundet RNA fra 20 koloskopi-bekræftet raske kontrolpersoner, 20 patienter med adenom, og 20 med kræft.

Resultater

genom-dækkende analyse afdækket reproducerbare genekspression signaturer til både adenomer og kræft sammenlignet med kontroller. 386/489 (79%) af adenom og 439/529 (83%) af adenocarcinom biomarkører blev valideret i uafhængige væv. Vi identificerede også gener udtrykkes forskelligt i adenomer i forhold til kræft.

KIAA1199

blev udvalgt til videre analyse baseret på konsekvent opregulering i neoplasi, tidligere undersøgelser og sin interesse som karakteriseret gen. Plasma

KIAA1199

RNA-niveauer var signifikant højere hos patienter med enten kræft eller adenomer (31/40) sammenlignet med neoplasi-fri kontroller (6/20).

Konklusioner

colorektal neoplasi udviser karakteristiske mønstre af genekspression.

KIAA1199

udtrykkes differentielt i neoplastiske væv og

KIAA1199

udskrifter er mere rigelige i plasma hos patienter med enten kræft eller adenom i forhold til kontrolgruppen

Henvisning:. LaPointe LC, Pedersen SK, Dunne R, Brown GS, Pimlott L, Gaur S, et al. (2012) Discovery og Validering af Molecular Biomarkører for ende- og tyktarm og kræft med Ansøgning til Blood Testing. PLoS ONE 7 (1): e29059. doi: 10,1371 /journal.pone.0029059

Redaktør: Libing Song, Sun Yat-sen University Cancer Center, Kina

Modtaget: 30. maj 2011; Accepteret: 20. november 2011; Udgivet: januar 19, 2012 |

Copyright: © 2012 LaPointe et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev co-finansieret af Flinders University of South Australia og Commonwealth videnskabelig og industriel forskning Organisation (CSIRO) i Australien. Drs. Dunne, Molloy og Brown er ansat af CSIRO. Disse finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Finansieringen blev også leveret af Clinical Genomics Pty Ltd, et selskab er involveret i opdagelsen og kommercialisering af biomarkører for tarmkræft. Drs. LaPointe, Pedersen, Gaur, McEvoy og Thomas er ansat af Clinical Genomics Pty Ltd og Prof. Young er en betalt konsulent for Klinisk Genomics Pty Ltd. bidragyder således spillet roller i undersøgelsesdesign, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, og forberedelse af manuskriptet. Fru Pimlott og Dr. Wattchow har intet at afsløre

Konkurrerende interesser:. Dette arbejde var medfinansieret af Clinical Genomics Pty Ltd, et selskab er involveret i opdagelsen og kommercialisering af biomarkører for tarmkræft. Drs. LaPointe, Pedersen, Gaur, McEvoy og Thomas er ansat af Clinical Genomics Pty Ltd Prof. Young er en betalt konsulent for Klinisk Genomics Pty Ltd. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Tyktarmskræft kan behandles hvis de opdages og fjernes på et tidligt tidspunkt med 95% af patienterne overlever mere end fem år [1]. Der er stigende tegn på, at fjernelse af præ-invasive kolorektale læsioner, dvs. adenomer ved polypektomi sænker forekomsten af, og dødelighed fra, kolorektal cancer [2] – [4]. Derfor forhindrer tyktarmskræft ved at fjerne screen-opdaget adenomer bliver mere og mere fremhævet som et vigtigt mål for kolorektal cancer screening. Simple screeningstest øjeblikket er til rådighed, men er suboptimal for adenom detektion, selvom fækal immunkemiske test for globin er meget forbedret i forhold til tidligere forsøg [5] – [7]. Befolkning screeningsprogrammer kan forbedres, hvis en bekvem blodprøve var til rådighed, der er følsom og specifik for både de tidligste, mest behandlelige stadier af kolorektal cancer og også følsomme for pre-invasive adenomer. En sådan test vil lette en rationel screening tilgang ved at lade os dirigere koloskopi ressourcer til de personer, som er tilbøjelige til at få mest gavn af den invasive procedure [8].

Gene ekspressionsmønstre i stigende grad viser lovende for identifikation af kandidat biomarkører for kolorektal cancer, men disse kandidater mangler ofte passende validering og lidt data er tilgængelige for biomarkører, der er også følsomme for adenomer. Formodede biomarkører som følge af opdagelsen-baserede forskning skal strengt valideret, hvis de skal være klinisk anvendelige [9] – [12]. Validering, dvs. teste den hypotese, at kandidat- biomarkører er ægte indikatorer for en fænotype, ideelt gør brug af en patient kohorte, der er klinisk uafhængig af opdagelsen kohorte. Endvidere korrelation mellem genekspression mønstre i væv og biomarkør opdagelse i blod er ikke veldefineret.

Formålet med denne undersøgelse var at bestemme, om adenomer og kræft udviser karakteristiske mønstre af biomarkør udtryk og at undersøge, om et væv -discovered (og valideret) biomarkør udtrykkes differentielt i plasmaet hos patienter med kolorektale adenomer eller cancer. Særlig opmærksomhed er givet til adenom ekspressionsmønstre som adenom biomarkører stort set er blevet ignoreret i litteraturen.

Vi forfulgt vores mål at afdække følsomme biomarkører for både kolorektale adenomer og kræft ved at følge en trefaset strategi opdagelse, validering og klinisk assay test. Først blev høj-dimensionelle genekspression microarray data analyseres for at opdage kandidat biomarkører i både kræft og adenomer fra colorectum. For derefter at validere genekspression kandidater blev en specialdesignet oligonukleotid microarray ( “Adenom Biomarkør Gene Chip”), designet og fremstillet til at indeholde et bredt udvalg af hypotetiske markører fundet under opdagelsen fase, såvel som markører udvalgt fra litteraturen. Kandidat biomarkører valideret ved anvendelse adenom Biomarkør Gene Chip i et uafhængigt sæt af neoplastiske prøver. Endelig blev den potentielle kliniske anvendelighed af en lovende væv-valideret kolorektal neoplasi biomarkør målt i RNA udvundet fra plasma af kolorektal adenom og kræftpatienter og koloskopi-bekræftet raske kontrolpersoner. Denne sekventielle proces følger de to første faser af en fem-trins evaluering af biomarkører foreslået af Pepe et al [13].

Resultater

Neoplastisk vs. non-neoplastisk transkriptom

af 44,928 probesets analyseret for genekspression forskel, vi observerede 11,183 (24,9%) probesets der skal udtrykkes differentielt i neoplastiske væv i forhold til ikke-neoplastiske væv, herunder colitic prøver. Til sammenligning vi observeret 2.701 (6,0%) probesets ligeledes udtrykkes forskelligt mellem den normale (n = 222) og colitis (n = 42) vævsekstrakter (tabel 1). Disse udtryk data blev også analyseret efter den fulde genom-niveau ved hjælp principal komponent analyse (PCA) (figur 1). Den største kilde til ekspression observeret ændringer i disse 454 mikroarrays (som det fremgår af både betyde ekspression forandring og PCA plot) korreleret med tilstedeværelsen eller fraværet af neoplasi. Denne fænotypiske effekt var uafhængig af, om de ikke-neoplastiske væv udstillet colitis og også uafhængigt af, om de neoplastiske væv var adenomatøs eller kræft

(A) Discovery microarray datasæt:. 222 normal, sort; 42 colitis /IBD, grøn; 29 adenomer, blå; og 161 adenocarcinomer, rød. (B) Validering microarray datasæt: 30 normal, sort; 19 adenomer, blå; og 19 adenocarcinomer, rød.

Ved at indføre et krav om en to-gange ændring i signal intensitet mellem neoplastiske og ikke-neoplastiske væv, antallet af differentielt udtrykte probesets faldet fra 11.183 til 446 (tabel 1). kun 4,0% af de differentielt udtrykte probesets (1,0% af probesets samlet) demonstrerede således mindst dobbelt ekspression forandring. Interessant, mens antallet af probesets udviser en differentiel respons af enhver størrelse blev omtrent ligeligt delt mellem probesets med forøget ekspression i neoplastiske væv (6.227; 55%) og probesets med reduceret ekspression (4,956; 44%), efter påføring af dobbelt kriterium antallet af under-udtrykt probesets med nedsat styrke i neoplastiske væv var meget større end antallet af probesets med forøget intensitet, 338 (76%) versus 108 (24%) hhv. Denne tendens blev observeret i både ikke-neoplastisk versus adenom og ikke-neoplastisk versus cancer sammenligninger. På den anden side, sammenligning af normale og colitis prøver viste omtrent lige mange gener med højere (60) og nedre (73) ekspressionsniveauer mellem fænotyper. Mellem adenom og cancere, der var imidlertid betydeligt flere gener opreguleret (145) i cancer versus nedreguleres (43). Et resumé af differentieret udtryk forandringer ved fænotype er vist i tabel 1, og en liste over validerede gener op- og ned-reguleret i kræft sammenlignet med adenomer er vist i tabel S1 og S2, hhv.

Probesets der afslørede forskellen ekspression mellem neoplastiske (adenomer og cancere) og ikke-neoplastiske væv (normale og colitis) blev kortlagt til formodede gen symboler med de seneste microarray annotationsfiler. 108 probesets forhøjede i neoplastiske væv af mindst to gange blev kortlagt til 97 gen symboler og 338 faldt probesets blev kortlagt til 264 gen symboler (Tabel S3).

fænotype-specifikke gener

sæt af differentielt udtrykte gener blev yderligere analyseret ved anvendelse af en ny analyse metode udviklet af os at forudsige transkripter, der kan udtrykkes i en fænotype (f.eks neoplasi), men ikke i en anden (f.eks raske kontroller). Ved at anvende denne metode, blev 23 probeset mål identificeret som formodede kandidater til neoplastisk-specifik genekspression, dvs. hypotetisk tændt i neoplastiske væv, men slukket i ikke-neoplastiske kontroller. Desuden blev 35 gener identificeret som kandidater til ekspression i kun ikke-neoplastiske væv, dvs. tændte i ikke neoplastiske væv, men slukket i neoplastiske væv. Et eksempel på et probeset udviser en prototypisk neoplastisk-specifikt reaktionsmønster er vist i figur 2A, og den komplette liste af probesets svarende til hypotetisk tændt og slukket gener er vist i tabel S4 og S5, henholdsvis.

(A) Discovery datasæt, 222 normal, sort; 42 IBDS, grøn; 29 adenomer, blå; 161 adenocarcinomer, rød. (B) Validering datasæt: 30 normal, sort; 19 adenomer, blå; 19 adenocarcinomer, rød. Y-akse:. Normaliseret probeset intensitet (log2)

Custom “Adenom Biomarkør” gen-chip

PCA plot af discovery data (Fig 1A) viser en stærk neoplasi vs. ikke-neoplasi adskillelse involverer de to første vigtigste komponent akser, med adenomer og kræft grupperet. For validering data (Fig 1B), den første principale komponent bekræfter, at den største kilde til varians på tværs af disse probesets er tilstedeværelsen eller fraværet af neoplasi. Den anden hovedkomponent, viser imidlertid, at adenomer grupperes separat fra kræft prøver.

Validering af kandidat biomarkører for kolorektal neoplasi

Af de 108 probesets hvis mål blev hypotese at være over- udtrykt ved mindst to gange i neoplastiske opdagelse væv, blev 103 probesets (95%) forhøjet i de neoplastiske validering væv (

P

≤0.05, MHT), og af disse 92 (85%) var forhøjet med på mindst 2-fold. Ligeledes 297 af de 338 (87%) probeset mål hypotese at være under-udtrykkes i neoplastiske væv var også under-udtryk i validerings- eksperimenter (

P

≤0.05, MHT); i neoplastiske prøver, 247 (73%) af disse gener udviste halvdelen eller mindre af udtrykket ses i normale kontrol væv. Validation resultater efter fænotype kontrast er vist i tabel 2. En liste af validerede op- og ned-regulerede probesets er vist i tabel S6 og S7, hhv.

Kvantitativ PCR-assay til måling af RNA biomarkør niveauer i væv eller plasma

en af ​​de mest differentielt opreguleret probesets i både opdagelsen (fig 3A) og validering (fig 3B) detekterede transkripter fra

KIAA1199

, et gen med ukendt funktion. I sættet validering af data, probeset 1008852-HuGene_st (

KIAA1199

) blev udtrykt mere end 25 gange højere i kolorektal neoplasi i forhold til ikke-neoplastiske kontroller (tabel S6). Disse resultater bekræftede tidligere rapporter, som fandt, at

KIAA1199

mRNA kan være en kandidat biomarkør for kolorektal adenom [14]. Baseret på vores gentagne observationer af differentieret udtryk i neoplastiske væv, forudgående dokumentation for opreguleret udtryk i både adenomer og kræft og det interessante faktum, at

KIAA1199

ikke tidligere er blevet karakteriseret med hensyn til struktur eller funktion, vi valgte

KIAA1199

at teste ideen om, at væv ekspressionsmønstre kan afspejles i blodet. For yderligere at undersøge biomarkør potentiale

KIAA1199

vi designet en real-time PCR-analyse til påvisning af RNA-transkripter afledt af denne locus.

(A)

KIAA1199

udtryk målt via probeset 212942_s_at i opdagelsen datasæt af 454 kolorektal vævsprøver (x-aksen indekseret af fænotype); Norm: 222 normale prøver, sort; IBD: 42 ‘colitis’ prøver, grøn; ADE: 29 adenomer, blå; CA: 161 kræft prøver, rød. Y-akse: normaliseret probeset intensitet (log2). (B)

KIAA1199

udtryk målt via probeset 1.008.852-HuGene_st i valideringen datasæt i 68 kolorektale vævsprøver. X-aksen; Norm: 30 normale kolon vævsprøver, sort; ADE: 19 adenomer, blå; CA: 19 kolorektal cancer prøver, rød. Y-akse: normaliseret probeset intensitet (log2). (C) En kvantitativ real-time SYBR-green

KIAA1199

PCR-assay anvendes på RNA ekstrakter anvendes til validering microarray data: 30 normal, sort; 21 adenomer, blå; 20 kolorektal cancer, røde prøver. Dataene er middelværdier af dubletter, normaliserede mod HPRT1 og afbildet som delta-delta-Ct-værdier. Bemærk, at tre yderligere neoplastiske prøver var tilgængelige for de PCR-forsøg, som ikke blev testet af brugerdefinerede microarray.

Først en SYBR-grøn baseret real-time PCR for

KIAA1199

blev brugt at bekræfte vævet validering microarray data; resultaterne var i god overensstemmelse med de microarray data for dette gen (fig 3C). Dernæst blev

KIAA1199

(og

GAPDH

kontrol) transkriptniveauer målt i RNA udvundet fra plasma brøkdel af 40 patienter med kolorektal neoplasi (adenom eller adenocarcinom) og 20 raske kontroller (alle kategorier har blevet bekræftet af kliniske patologiske fund) ved hjælp af kommercielt tilgængelige TaqMan qPCR assays.

GAPDH

RNA-transkripter var påviselige i alle 60 plasmaprøver testet (Fig 4A) og moderat højere

GAPDH

RNA niveauer blev observeret i plasmaprøver fra patienter diagnosticeret med kolorektale adenomer eller kræft sammenlignet med raske donorer (ikke signifikant, p-værdier 0,05). Højere koncentrationer af

KIAA1199

RNA-transkripter blev påvist i plasma fra patienter med colorektal neoplasi end i plasma fra raske kontroller (Fig 4B).

KIAA1199

RNA blev påvist i plasma fra 31 ud af de 40 (77,5%) patienter med kolorektal neoplasi og i 6 af de 20 (30%) neoplasi-fri patienter.

(A )

GAPDH

og (B)

KIAA1199

RNA-niveauer i plasma fra 20 raske forsøgspersoner (sort) og fra 20 patienter med colon adenomer (blå) og 20 CRC patienter (rød). Dataene er middelværdier Ct-værdier (tre eksemplarer) normaliseret til udvinding udbytte forskelle og afbildet som fold-change forskelle i forhold til medianen udtryk målt i de 20 normale forsøgspersoner. P-værdier blev beregnet under anvendelse tosidede Mann-Whitney t-test.

Diskussion

Denne undersøgelse bekræfter, at kolorektale mRNA-transkripter differentielt udtrykkes i både adenom og cancervæv i forhold til kontroller , med nogle udskrifter bliver opreguleret i neoplasi mens andre er nedreguleret. Vi bekræftede, at 103 af 108 (95%) probesets opdaget at være opreguleret i neoplasi blev ligeledes forskelligt udtrykt under validering test. 87% (297/338) af de ned-regulerede probesets blev også bekræftet under validering test. Genom-dækkende kovarianskomponenter mønstre viste, at tilstedeværelsen eller fraværet af neoplasi korreleret med den største kilde til varians på tværs af alle probesests og alle arrays i udtrykket data (Fig 1A). Ca. 25% af de 44,928 opdagelse probeset mål blev differentielt udtrykt mellem neoplastisk væv og ikke neoplastiske kontroller. Alle andre fænotype kontraster resulterede i færre probesets viser en differentiel respons. Disse resultater viser, at neoplastisk status har en større indflydelse på genekspression end fx colitis eller endda forskellen mellem før-invasiv adenom væv og malign cancer.

Vores resultater enig med en almindeligt forekommende tendens i kolorektal cancer genekspression forskning, der viser et større antal gener nedreguleres i adenom og cancervæv sammenlignet med ikke-neoplastiske kontroller [15]. Dette udtryk mønster kan afspejle øgede niveauer af hypermethylering forbundet med onkogenese [16].

På den anden side, denne undersøgelse viser, at flere gener synes at være opreguleret i overgangen fra adenom til adenocarcinom (tabel S1) . Denne observation kan afspejle underliggende øget histologisk kompleksitet af cancer sammenlignet med adenom væv eller, mere interessant, kan påvise en relation mellem et forøget antal udtrykte gener og progressionen til en invasiv fænotype og metastase. Den største gruppe (14%) af gener opreguleret i cancer sammenlignet med adenomer er fra kollagen familien, men listen omfatter også fire forskellige arter af matrix metaloproteinases tyder øget aktivitet af gener med invasion potentiale (tabel S1).

Desuden er denne undersøgelse omfattede udformningen af ​​en tilpasset microarray, der indeholdt et sæt gener, der viser, at adenomer kan separeres fra cancerpatienter prøver baseret på genekspressionsmønstre (fig 1B). Disse resultater understøtter det koncept, at ikke blot er den neoplastiske genekspression signatur konserveret mellem opdagelsen og validering af data, men også adenom vs. cancer ekspressionssignatur ligeledes bevaret. Vi er ikke bekendt med nogen tidligere genekspression undersøgelse, der har vist evne til at skelne mellem ikke-neoplasi, præ-invasiv neoplasi og invasive fænotyper. Denne udvælgelse af gener åbner vejen til identifikation af biomarkører for brug i følsomme og specifik påvisning af adenomer.

Det andet formål med denne undersøgelse var at undersøge, om udvalgte kandidat biomarkører opdaget i væv var påviselige og differentielt udtrykt i plasmaet hos patienter med adenomer eller colorectal cancer sammenlignet med ikke-neoplastisk kontrol plasma. Dette trin er afgørende for oversættelse af resultater væv i klinisk anvendelige endepunkter. Ellers skal markør opdagelse starte i diagnostiske kliniske prøver (fx blod), der udgør større udfordringer end at starte med relativt RNA-rige frisk frosset væv. Denne rapport beskriver en proof-of-concept plasma-baserede qPCR forsøg, der måler mRNA-transkripter af

KIAA1199

, et gen af ​​ukendt funktion, som vi bekræfter at være udtrykkes forskelligt i både væv og plasma af kræft og adenom patienter.

Biomarkører for kolorektal neoplasi

Der er et stort og voksende litteratur af kolorektal genekspression-relaterede eksperimenter [17], [18]. Undersøgelsen præsenteres her udvider og forbedrer dette organ af arbejde. En forholdsvis stor meta-analyse af Chan et al. 25 gen-ekspression opdagelse undersøgelser i forbindelse med kolorektal cancer identificeret fem gener at være opreguleret i syv eller flere uafhængige analyser, herunder

TGFBI

,

IFITM1

,

MYC

,

SPARC

,

GDF15

[17]. Alle fem af disse gener blev bekræftet at være opreguleret i vores undersøgelse.

Kun få studier fat udtryk forskelle mellem kolorektale adenomer og normal kolorektal væv. Galamb et al. brugte mikroarrays at identificere et sæt af tre gener (

KIAA1199

,

FOXQ1

, og

CA7

), der blev udtrykkes forskelligt i adenomer i forhold til normale kontroller, samt en sæt af fem gener (

VWF

,

IL8

,

CHI3L1

,

S100A8

, og

GREM1

), som kunne skelne kræft væv fra normale kontroller [19]. Af disse gener, vores undersøgelse viste, at

KIAA1199

,

FOXQ1

IL8

blev udtrykkes forskelligt i adenomer (og i kræft) i forhold til normale kontroller.

KIAA1199

Den foreliggende undersøgelse bekræfter tidligere rapporter, som

KIAA1199

udviser en forhøjet niveau af mRNA-ekspression i præcancerøse adenomer, en opregulering, der varer ved i kræft væv [14]. Dette gen var også en af ​​de øverste markører identificeret af Marra laboratorium som en hidtil ukendt mål for Wnt-induceret udtryk og en mulig ny biomarkør for kolorektal neoplasi. Sabates-Bellver et al. viste, at

KIAA1199

udtryk i normal slimhinde var begrænset til celler i den nederste del af intestinale krypter, mens forhøjet

KIAA1199

udtryk blev observeret i alle de adenomer, de studerede.

rolle

KIAA1199

er ikke kendt, men beviset for Wnt-inducibilitet antyder dette gen kan være en del af den nedstrøms kaskade af Tcf /LEF transkriptionelt aktiverede gener, som er almindeligt forstyrret i mave-neoplasi [14] . Gastric adenokarcinomer udtrykker høje niveauer af

KIAA1199

er korreleret med dårligere fem års overlevelse resultater i forhold til de patienter med lav

KIAA1199

udtryk [20]. Colon cancer celler behandlet med selektive cyclooxygenase-2-hæmmere viser sænket

KIAA1199

udtryk [21], mens høje niveauer af

KIAA1199

mRNA er positivt korreleret med celle dødelighed i humane fibroblaster [22].

En blodprøve for adenomer

på trods af den hastigt voksende database af formodede kræft biomarkører proof-of-concept, få lovende kandidater under indledende opdagelse forskning overlever efterfølgende validering testning med uafhængige væv. En endnu mindre del af ansøgerne fortsat lovende, når disse gener er udvalgt til assay udvikling og klinisk afprøvning. Vi har identificeret flere hundrede biomarkører for kolorektal neoplasi, der har overlevet validering i uafhængige kliniske prøver. For én overbevisende neoplastisk væv biomarkør,

KIAA1199

, vi har også testet en enkelt gen qPCR assay, der viser lovende i at skelne mellem plasmaprøver fra med patienter med colorectal neoplasi og fra raske individer. Dette gen, som var en af ​​mange “valideret” gener, blev valgt til yderligere undersøgelse på grundlag af biomarkør præstation rapporterede her, tidligere rapporter, der viste

KIAA1199

at være forhøjet i kolorektal neoplasi, og fordi den biologiske funktion af denne gen er ukendt. Plasma

KIAA1199

niveauer blev forhøjet i patienter, som havde koloskopi-bekræftet adenomer eller kræft i forhold til at styre plasma fra neoplasi-fri individer, selvom den tilsyneladende følsomhed enkelt markør var højere for kræft end for adenomer.

Som en biomarkør med potentiale til diagnosticering i ikke-invasive patientprøver,

KIAA1199

bør nu overvejes til indbygning i mRNA (og muligvis protein) analyser og undersøgt i større kliniske og screening studier. Af særlig interesse vil være forholdet mellem

KIAA1199

udtryk til de forskellige genetiske veje for kolorektal onkogenese, såsom

Wnt

signalvejen, som er almindeligt forstyrres i tyktarms- og endetarmskræft og adenomer.

kolorektal neoplasi udviser karakteristiske mønstre af genekspression.

KIAA1199

udtrykkes differentielt i neoplastiske væv og

KIAA1199

udskrifter er mere rigelige i plasma hos patienter med enten kræft eller adenom sammenlignet med kontrolgruppen.

KIAA1199

andre validerede biomarkører, der er beskrevet her, garanterer yderligere evaluering som blod-baserede screeningstest for kolorektal neoplasi. En central udfordring for denne yderligere vurdering vil være at også løse en test relative følsomheder for adenomer og kræftsygdomme givet den meget højere forekomst af godartede neoplastiske kolorektale adenomer i forhold til maligne neoplastiske kolorektal carcinom.

Materialer og Metoder

Alle microarray data, der anvendes i denne undersøgelse blev dokumenteret i overensstemmelse med de MIAME standarder for microarray eksperimenter.

Discovery data

tyktarms vævsprøver anvendes til biomarkør opdagelse blev indsamlet ved Genelogic Inc (Gaithersburg, MD, USA) fra patienter, som gav skriftlige samtykke i henhold til etiske standarder fastsat af en uafhængig gennemgang bestyrelse bestående af forskere og bioetikere, der ikke var ansatte i Gene Logic. Hver institution, der har leveret vævsprøver til GeneLogic indhentet informeret samtykke fra hver donor eller, hvis det er relevant, deres bemyndigede repræsentant, og opfylder kravene i den relevante Institutional Review Board og alle gældende love, genekspressionsprofilering data målt i 548 kolorektale vævsprøver bruger Affymetrix HGU133A HGU133B gen chips (44,928 probesets kombineret) (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) og ledsagende kliniske data blev købt fra GeneLogic Inc. forsøg og kliniske deskriptorer blev til alle chip datafiler udover digitalt arkiveret mikroskopi billeder af histologiske præparater. Forud for udførelse af discovery forskning ved hjælp af disse data blev kvalitetskontrol streng anvendes på disse data. I alt 454 mikroarrays mødte krav til kvalitetskontrol og blev bedømt egnet til denne opdagelse forskning. Yderligere oplysninger om de kontrolprocedurer kvalitet anvendes til disse data re leveres i Støtte Information S1 Kvalitetskontrol Analysis. Beskrivelse af væv fænotyper for disse opdagelse data er vist i tabel 3 med kræft fænotype fordelingen i tabel 4.

fænotype-specifikke ekspressionsmønstre

Ud over standard differetialen udtryk analyse, vi introducerede en analytisk teknik udviklet til at filtrere differentielt udtrykte probeset kandidater til udskrifter, som vi hypoteserne blev kvalitativt “slået-on” i en fænotype klasse og kvalitativt “slået-off” i en komparator fænotype. Til denne fremgangsmåde blev identifikationen af ​​”off” gener baseret på den relativt simple antagelse, at de fleste gener i et givet væv var

ikke

udtrykkes konstitutivt over et nominelt relativt lavt baggrundsniveau. Følgelig et mikroarray designet til at hybridisere til den fulde humane transkriptom bør derfor ikke udvise transkript-specifik binding til de fleste probesets i et givet eksperiment. Omvendt bør den fluorescerende intensitet probesets som hybridiserede til saldoen af ​​ikke-udtrykte transkripter afspejle “ikke-specifik” probeset-transkript hybridisering. Den antagelse, at en stor del af de probesets for en given eksperiment ikke var udskrift-specifikke signaler forudsat midler til at estimere en teoretisk on /off tærskel for gener i fuld genom eksperimenter såsom anvendt her for opdagelse. Det betyder udtrykket niveau for alle 44,928 probesets i 454 discovery mikroarrays blev rangeret og probeset værdi svarende til 30

percentil værdi på tværs af data blev valgt som grænsen for transkriptionel tavshed. Denne tærskel er en konservativ øverste bundet skøn over ikke-specifik eller baggrund udtryk

Validering Data:. Vævsprøver

For alle validering (dvs. hypotese afprøvning) eksperimenter, uafhængigt indsamlet frisk frosne vævsprøver blev opnået fra en tertiær henvisning hospital vævsbank (Flinders Medical Centre, Adelaide, SA Australien). En beskrivelse af de tilfælde, der bruges til validering test er vist i tabel 3. Denne undersøgelse blev godkendt af udvalget for repatriering General Hospital Forskning og etik og den etiske komité i Flinders Medical Centre. Skriftligt informeret patient samtykke blev modtaget for hver væv undersøgt. Kirurgiske prøver blev indsamlet og behandlet som beskrevet tidligere [23]

Validering Data:. Brugerdefineret microarray design

For at teste de mange hypotetiske gen biomarkører identificeret ved opdagelsen analyser, en specialdesignet microarray, den “Adenom Biomarkør Gene Chip”, blev fremstillet (Affymetrix). Adenom Biomarkør Gene Chip vifte omfattede alle HGU133-A /B-probesets identificeret under opdagelsen samt exon-level probesets der ikke var tilgængelige på tidspunktet for den oprindelige opdagelse øvelse. Hver HGU133 opdagelse probeset på adenom Biomarkør Gene Chip blev kommenteret til en eller flere menneskelige gener symboler baseret på NCBI annoteringsværktøjer (NCBI36 /hg18) og disse gen-symboler blev derefter reverse kortlagt tilbage til exon niveau probesets designet af Affymetrix for HuGene ST 1.0 GeneChip. Den brugerdefinerede microarray inkluderet “perfekt match” probesets kun

Validering Data:. RNA Extraction

En fænotypisk nedbrydning af væv, der anvendes til validering test er vist i tabel 3. RNA blev ekstraheret fra frosne væv prøver under anvendelse af Trizol (Invitrogen, San Diego USA) som anbefalet af fabrikanten. Kort fortalt blev frosne væv homogeniseret i 300 pi Trizol-reagens ved anvendelse af en modificeret Dremel boremaskine og sterile engangs pestles. 200 pi af Trizol-reagens blev tilsat til homogenatet og prøver blev inkuberet ved stuetemperatur (RT: 25C) i 10 minutter. 100 pi (% v /v) chloroform blev derefter tilsat, blev prøver rystet i 15 sekunder, og inkuberet ved stuetemperatur i 3 minutter. Den vandige fase indeholdende totalt RNA blev opnået ved centrifugering ved 12.000 x g i 15 minutter, 4 ° C. RNA blev derefter præcipiteret ved inkubering prøver ved stuetemperatur i 10 min med 250 pi isopropanol.