PLoS ONE: Sammenlignende Proteomics Analyse af mavekræft Stem Cells

Abstrakt

Kræft stamceller (CSCS) har ansvaret for kræft progression, metastase, og gentagelse. Til dato, de specifikke markører for CSCS forbliver uopdagede. Formålet med denne undersøgelse var at identificere nye biomarkører for gastrisk CSCS for klinisk diagnose ved hjælp proteomics teknologi. CSC-lignende SP-celler, OCUM-12 /SP-celler, OCUM-2MD3 /SP-celler og deres overordnede OCUM-12-celler og OCUM-2MD3 celler blev anvendt i denne undersøgelse. Proteinlysater fra hver cellelinje blev analyseret ved anvendelse QSTAR Elite væskekromatografi med Tandem-massespektrometri, kombineret med isobare tags for relativ og absolut kvantificering teknologi. Kandidat proteiner påvises ved proteomics-teknologi blev valideret af immunhistokemisk analyse af 300 gastrisk kræft. På baggrund af resultaterne af LC-MS /MS, otte proteiner, herunder RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA, og KRT18, var opreguleret i begge OCUM-12 /SP celler og OCUM-2MD3 /SP celler sammenlignet med deres tilsvarende moderceller. RT-PCR-analyse viste, at ekspressionsniveauet af

RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1

, og

CK18

var høj i OCUM-12 /SP og OCUM-2MD3 /SP, i sammenligning med kontrollen af ​​forælder OCUM-12 og OCUM-2MD3. Disse proteiner blev signifikant associeret med avanceret invasion dybde, lymfeknude metastaser, fjernmetastaser, eller avanceret klinisk fase. RBBP6, DCTPP1, HSPA4, og ALDOA udtryk især var signifikant associeret med en dårlig prognose i de 300 mavecancerpatienter. RBBP6 blev bestemt til at være en selvstændig prognostisk faktor. Den motilitetstimulerende evne OCUM-12 /SP-celler og OCUM-2MD3 /SP-celler blev inhiberet af

RBBP6

siRNA. Disse resultater kunne tyde på, at de otte proteiner, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA, og KRT18, udnytte komparative proteomics analyse blev opfattet som potentielle CSC markører for mavekræft. Af de otte ansøgerlande proteiner, blev RBBP6 foreslået at være en lovende prognostisk biomarkør og et terapeutisk mål for mavekræft

Henvisning:. Morisaki T, Yashiro M, Kakehashi A, Inagaki A, Kinoshita H, Fukuoka T, et al. (2014) Sammenlignende Proteomics analyse af gastrisk cancer stamceller. PLoS ONE 9 (11): e110736. doi: 10,1371 /journal.pone.0110736

Redaktør: Anita B. Hjelmeland, University of Alabama i Birmingham, USA

Modtaget: 3 maj 2014; Accepteret: September 16, 2014; Udgivet: November 7, 2014

Copyright: © 2014 Morisaki et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer. Tiltrædelsespartnerskaber numre for protein data indgår som UniProt /Swiss-Prot i tabel 2.

Finansiering: Denne undersøgelse er delvist finansieret af KAKENHI (Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning, nr 22.390.262, 23.390.329, og 26.293.307. ), af National Research and Development Fund Cancer center (23-A-9), og ved Priority Research Fund af Osaka City University. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft stamceller (CSCS) defineres som en unik subpopulation i tumorer, der besidder evnen til at initiere tumorvækst og opretholde selvfornyelse [1]. Det er blevet foreslået, at de kan forårsage den heterogene afstamning af cancerceller, som udgør tumoren samt spiller en vigtig rolle i ondartet udvikling af carcinom, såsom fjernmetastaser, gentagelse, og kemoresistens [2] – [4]. CSCS blev indledningsvis identificeret ved akut myeloid leukæmi [5], men er for nylig blevet rapporteret at eksistere i en lang række forskellige cancere, herunder mavecancer [6]. Identifikationen af ​​CSC markører kan åbne en ny terapeutisk perspektiv på grundlag af selektiv målretning denne lille population af celler [7], [8]. For nylig er det blevet rapporteret, at CSCS eventuelt gøre udtrykke deres egne unikke markører, såsom aldehyd dehydrogenase 1 (ALDH1) [9], CD44 [10], [11], og CD133 [12]. Men mange af de offentliggjorte markører er ikke unikke for CSCS. Kvantitativ proteinekspression profilering muliggør effektiv identifikation af nøjagtige og reproducerbare differentiale udtryk værdier for proteiner [13]. Isobarisk tags for relativ og absolut kvantificering (iTRAQ) kombineret med multidimensionel væskekromatografi (LC) og tandem massespektrometri (LC-MS /MS) analyse fremstår som en stærk metode i søgningen efter tumor biomarkører [14]. Vi har tidligere rapporteret, at den side befolkning (SP) celler er i stand til selv at forny og fremstille ikke-SP-celler, og at cancerceller i SP fraktioner besidder stort potentiale for tumorgenicitet, fjernmetastase [3], og kemoresistens [2]. Dette antyder, at SP celler af gastrisk cancer besidder cancer stamcellelignende egenskaber. Derfor er målet med denne undersøgelse var at påvise en hidtil ukendt CSC markør (er) af gastrisk cancer ved at sammenligne proteomer blandt moderceller og stamcelle-lignende SP-celler der har været kendt for at besidde en rig CSC population [15].

Materialer og metoder

cellekulturer

To gastrisk cancer cellelinjer, OCUM-2MD3 [16] og OCUM-12 [17], blev anvendt i denne undersøgelse. Disse cellelinier blev afledt fra diffuse type mavekræft. Kulturen betingelse blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM; Nikken, Kyoto, Japan) med 10% varmeinaktiveret føtalt kalveserum (FCS; Life Technologies, Grand Island, NY), penicillin og streptomycin og 0,5 mM natriumpyruvat, og inkuberet ved 37 ° C. OCUM-12 /SP og OCUM-2MD3 /SP cellelinier var SP-celler, der blev evalueret ved en flowcytometrisk analyse ved anvendelse Hoechst 33342 fra deres forældre cellelinjer, OCUM-2MD3 og OCUM-12, hhv. Sortering blev udført tre gange for at etablere en stabil population af SP-berigede celler. Efter en tre måneders inkubationsperiode efter sortering, OCUM-12 /SP-celler (6,5%) og OCUM-2MD3 /SP-celler (12,2%) udgjorde stadig en høj procentdel af SP fraktionen sammenlignet med forælder OCUM-12 (3,2% ) og OCUM-2MD3 (6,3%) celler (Figur S1). Efterfølgende disse SP-berigede celler med en stabil befolkning var de cellelinier anvendt til analysen, som tidligere rapporteret [18].

Menneskelige vævsprøver og Patientinformation

Vævsprøver blev opnået fra 300 patienter diagnosticeret med mavekræft tilladte operationer på Osaka City University. Tabel 1 viser de clinicopathologic karakteristika for de 300 mavecancerpatienter. Der var 208 mandlige og 92 kvindelige patienter, med median alder på 64 år (interval, 28-85 år) på tidspunktet for operationen. De diagnoser blev bekræftet af mindst to personer. Iscenesættelse blev bestemt i overensstemmelse med den japanske klassifikation af gastrisk karcinom (14

th udgave) [19]. Denne undersøgelse blev godkendt af Osaka City University Etiske Komité (Osaka, Japan). Skriftligt informeret samtykke fra donor blev opnået for brug af denne prøve i forskningen.

Protein Identifikation og kvantificering af QSTAR Elite LC-MS /MS

De kræftceller (60 pg hver ) blev homogeniseret og derefter lyseret under anvendelse af enten 100 pi T-PER lysepuffer (Thermo Scientific) eller 500 pi 9 M Urea, og 2% CHAPS lysepuffer med en protease-inhibitor. Efterfølgende blev cellelysatet derefter behandlet ved ultralydsbehandling. Efter acetoneudfældning blev proteinkoncentrationer målt ved BCA Protein Assay (Pierce, IL, USA). Reduktion, alkylering, fordøjelse, og efterfølgende peptid etikettering af 50 ug protein for hver prøve blev udført under anvendelse af AB Sciex iTRAQ Reagent Multi-Plex Kit (AB Sciex, Concord, ON, Canada) [20]. De iTRAQ-mærkede prøver blev fyldt på en ICAT kationbytning patron (AB Sciex). Peptiderne blev elueret som seks fraktioner (1 ml KCL opløsning af 10, 50, 70, 100, 200 og 350 mm), og supernatanten af ​​hver blev inddampet under vakuum centrifuge. Prøverne blev derefter afsaltet og koncentreret ved anvendelse af Sep-Pak Light C18 patroner (Waters Corporation, Milford, MA), inddampet i en vakuumcentrifuge, resuspenderet i 20 pi 0,1% (v /v) myresyre, og efterfølgende påføres på QSTAR Elite LC -MS /MS. Hver prøve blev kørt i 150 minutter. MS /MS-data blev søgt mod den schweiziske Protein databasen (HUMAN) ved hjælp ProteinPilot software (version 2.0, AB Sciex) med trypsin indstillet som fordøjelsen enzym og methyl methanethiosulfinate som cystein modifikation. For at fjerne overflødige hits og sammenlignende kvantificering blev søgeresultaterne opnåede viderebehandles af ProteinPilot software ved hjælp af Paragon algoritme. Dette resulterede i den minimale sæt af forsvarlige identificerede proteiner. Alle rapporterede data blev brugt med en 95% sikkerhed cut-off grænse. Relativ kvantificering af peptider blev beregnet som et forhold ved at dividere iTRAQ reporter intensitet. Forholdene mellem peptider, der understøtter eksistensen af ​​ét protein blev midlet til den relative proteinkvantificering. Derefter blev udført ProteinPilot analyse og Opfindsomhed pathway analyse (IPA) (Ingenuity System, Mountain View, CA). Efter at have udført en simpel t-test på en af ​​de beregnede gennemsnit protein-forhold mod en at vurdere gyldigheden af ​​protein udtryk ændringer blev en p-værdi rapporteret. Protein nøgletal med en p-værdi på mindre end 0,05 blev anset for pålidelige. Det bør være kendt, at i 90% af de iTRAQ eksperimentelle kørsler gjort tidligere, de standardafvigelser af de protein-forhold, som stammer fra de tekniske variationer, blev rapporteret til at være mindre end 0,3. Derfor ændrer ekspression større end 1,2 gange eller mindre end 0,8-fold af normaliserede ekspressionsniveauer blev anset for at være uden for området tekniske variabilitet. Vi udførte også en ikke-mærket analyse og påvist tilstedeværelsen af ​​proteiner kun inden OCUM-12 /SP-celler og OCUM-2MD3 /SP-celler, men ikke inden moderceller [21]. Hver prøve blev kørt to gange. Den påførte LC-MS /MS undersøgelse kombineret med iTRAQ teknologi er blevet rapporteret som en pålidelig kvantitativ metode til proteinekspression, er endnu mere følsom end western blot som afhænger af typen af ​​anvendte antistoffer [22].

IPA og Udvælgelse af kandidatlandene proteiner

IPA databasen anvendes primært inden for proprietære ontologi, der indeholder op til 300.000 biologiske artikler, herunder gener, proteiner, molekylære og cellulære processer. Derfor IPA var ansat til analyse af protein molekylære funktioner, lokalisering. Endvidere opnåedes detaljerede oplysninger om de funktioner og cellulære placeringer af de identificerede proteiner. Baseret på resultaterne af LC MS /MS og IPA-analyser, proteiner, der blev observeret at være overudtrykt i SP cellelinier i sammenligning med deres tilsvarende frekvens af ekspression i moder- cellelinier blev udvalgt som kandidat biomarkører for SP-celler af gastrisk cancer. Identifikationen af ​​netværk af interagerende proteiner, såvel som funktionelle grupper og veje blev genereret af IPA, og analysen afhænger af de tidligere karakteriserede foreninger.

kvantitativ real-time Reverse Transcription-polymerase kædereaktion (RT-PCR )

Gastric kræftceller blev dyrket. Og det totale cellulære RNA blev ekstraheret under anvendelse af RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Carlsbad, CA). cDNA blev fremstillet ud fra 2 ug RNA ved anvendelse vilkårlige primere (Invitrogen). For at bestemme fold ændringer i hvert gen, blev RT-PCR udført på ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA), med kommercielt tilgængelige genekspression assays (Applied Biosystems) for

RBBP6

(

retinoblastoma bindende protein 6

, Hs00544663),

HSPA4 Hotel (

varme shock 70 kDa protein 4

, Hs00382884),

HSPA9 Hotel (

varme shock 70 kDa protein 9

, Hs00269818),

GLG1

(Golgi glycoprotein 1, Hs00939452),

DCTPP1 Hotel (

dCTP pyrophosphatase 1

, Hs00225433),

VPS13A

(

vakuolær protein sortering 13 homolog A

, Hs00362891),

CK18 (keratin 18

, Hs028277483),

ALDOA (aldolase A

, Hs00605108),

CD44 Hotel (Hs01075862),

CD133

(Hs01009250) og

NANOG

(Hs02387400). GAPDH (SIGMA) blev anvendt som en intern standard til at normalisere mRNA-niveauer. Tærsklen cyklus (Ct) værdier blev anvendt til at beregne den relative ekspression forholdene mellem kontrol og behandlede celler.

Western blot-analyse

Expression niveau af RBBP6 og ALDOA i kræftceller blev undersøgt som følger. Cellelysater blev opsamlet efter forskellige behandlinger. Efter proteinkoncentrationen af ​​hver prøve blev justeret, blev elektroforese udført under anvendelse af 10% Tris /Gly-geler (Life Technologies, Carlsbad, CA). Proteinbåndene opnåede blev overført til en Immobilon-P Transfer membran (Amersham, Aylesbury, UK). Derefter blev membranen anbragt i PBS-T-opløsning indeholdende anti-RBBP6 (WH0005930M1, Sigma-Aldrich, MO, USA), anti-ALDOA (HPA004177, ATLAS), og anti-β-actin (1:300 fortynding; Sigma- Aldrich), og fik lov at reagere ved stuetemperatur i 2 timer. Niveauerne af specifikke proteiner i hvert lysat blev påvist ved forøget kemiluminescens hjælp ECL plus (Amersham) efterfulgt af autoradiografi.

Små interfererende RNA Design

sekvenser for

RBBP6

lille interfererende RNA (siRNA) er udformet som følger: si

RBBP6

forstand, 5′-GAAAGAAGAAUAUACUGAUtt-3 ‘; antisense, 5’AUCAGUAUAUUCUUCUUUCgt-3 ‘, og nontargeting siRNA (negativ-siRNA) blev indkøbt fra Ambion (Life Technologies, Carlsbad, CA) .OCUM-12 /SP og OCUM-2MD3 /SP celler blev fremstillet ved 60% konfluens i seks brønde. Transfektionsblandingen blev fremstillet ved tilsætning 150 pi Opti-MEM herunder 9 pi Lipofectamine RNA iMAX Regant (Life Technologies) til 150 pi Opti-MEM herunder 90 pmol siRNA og inkubering i 5 minutter ved stuetemperatur. Endelig ovenstående transfektionsblandingen blev tilsat til tilberedt med seks brønde skålen. Fireogtyve timer efter transfektion blev RT-PCR udført.

sårheling Assay

Cancerceller blev dyrket i plader med 96 brønde (Essen Instruments, Birmingham, UK). Efter at cellerne nåede semi-konfluens, blev et sår skabt i cellemonolaget med 96 brønde ved WoundMaker (Essen Bioscience, MI, USA). Ridsede felter blev taget afbilledet hver 3 timer og blev overvåget med Incucyte live-Cell Imaging System og software (Essen Instruments). Graden af ​​celle- vandringer blev analyseret 24 timer efter sårbehandling som en procentdel af sår konfluens. Gennemsnittet af 4 felter blev beregnet som prøven værdi.

Invasion Assay

Vi brugte chemotaxicell kamre (Kubota, Osaka, Japan) med en 12-um poremembranfilter belagt med 50- pg Matrigel (Collaborative Research Co., Bedford, MA). Kammeret (øvre komponent) blev anbragt i en 24-brønds kulturplade (lavere komponent). Gastrisk cancer celler blev resuspenderet til en slutkoncentration på 5 x 10

3 celler /ml. Derefter 500-pL lavere komponenter. Efter inkubation i 48 timer blev cancerceller på oversiden af ​​membranen fjernes ved aftørring og farvet med hematoxylin. Kræftceller, der invaderede gennem et filter overtrukket med Matrigel ind i den nedre membran blev manuelt talt under et mikroskop ved × 200 forstørrelse. Seks tilfældigt valgte felter blev talt for hver bestemmelse. Middel af fire felter blev beregnet som prøvens værdi. For hver gruppe blev kulturen udført tre gange.

Validering af Protein Expression ved immunhistokemi

Immunhistokemi blev udført på formalinfikserede, paraffinindlejrede vævsprøver, der blev deparaffinerede i xylen og dehydreret gennem gradueret ethanol. Snittene blev opvarmet i 10 minutter ved 105 ° C ved autoklavering i Target Retrieval Solution (Dako). Prøverne blev efterfølgende inkuberet med 3% hydrogenperoxid til at blokere endogen peroxidaseaktivitet. Følgende antistoffer blev anvendt i immunhistokemiske proces: anti-RBBP6 (retinoblastoma protein 6; WH0005930M1, 6:1000; Sigma-Aldrich), anti-GLG1 (Golgi glycoprotein 1, HPA010815, 1:80, ATLAS), anti-VPS13A (vacuolær protein sortering 13 homolog A NBP1-85642, 1:500, Novus Biologicals), anti-ALDOA (aldolase A, fruktose-bisphosphat, HPA004177, 1:400, ATLAS), anti-DCTPP1 (dCTP pyrophosphatase 1; HPA002832, 1:200, ATLAS), anti-HSPA9 (varme shock 70 kDa protein 9 HPA000898, 1:200, ATLAS), anti-HSPA4 (varme shock 70 kDa protein 4, HPA010023, 1:200, ATLAS), og anti-KRT18 (keratin 18; ab668, 1:500, Abcam). Prøverne blev inkuberet med hvert antistof natten over ved ca. 4 ° C. Derefter blev prøver inkuberet i tilegnet immunoglobulin G i 10 minutter, efterfulgt af tre gange vask med PBS. Alle prøver blev derefter behandlet med streptavidin-peroxidase-reagens, og inkuberet i PBS diaminobenzidin og 1% hydrogenperoxid (vol /vol), efterfulgt af modfarvning med Mayers hematoxylin.

Immunohistokemisk Evaluering

RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA, og KRT18 ekspressionsniveauerne blev vurderet af både intensiteten af ​​farvning og andelen af ​​farvede tumorceller. Den farvningsintensitet blev scoret på en skala fra 0-3 (0 = nej, 1 = mild, 2 = moderat, 3 = intens). Farvning andele blev scoret på en skala fra 0-4 (procentdelen var forskellige med hvert antistof) baseret på procentdelen af ​​positivt farvede celler. Derfor vil den endelige farvning score, der blev beregnet som et multiplum af farvningsintensitet score og farvningen andel score, være på en skala fra 0-12. Ekspressionsniveauer af DCTPP1 blev betragtet som positive, når det fik en score på 3. Expression niveauer af HSPA4 blev betragtet som positive, når det fik en score på 6. Expression niveauer af ALDOA, KRT18, VPS13A, og GLG1 blev betragtet som positive, når hver fik en score på 8. RBBP6, evalueringen hvoraf kun farvningen andel score blev anvendt til beregning, blev anset for positiv, når det har modtaget en score på 3. HSPA9, evalueringen hvoraf kun den farvningsintensitet score blev anvendt til beregning, blev anset for positiv, når det fik en score på 3. Alle evalueringer blev foretaget af to observatører, der var uvidende om kliniske data og resultat. Når en afvigende evaluering mellem de to uafhængige observatører blev fundet, blev objektglassene kontrolleres igen og revurderes efter drøftelse.

Statistisk analyse

SPSS software program (SPSS Japan, Tokyo, Japan) blev anvendt til dataanalyse. Statistisk signifikans af associationer mellem ekspressionen af ​​proteiner og de forskellige klinisk-patologiske variabler, herunder alder, køn, makroskopisk type, tumor differentiering, samlede antal reseceret lymfeknude, og typen af ​​kirurgi (D1 eller D2 gastrektomi) blev evalueret under anvendelse af Fishers og Chi -squared tests. Overlevelseskurver blev beregnet ud fra operationsdagen til dødstidspunktet eller det sidste opfølgning observation under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden. Derudover blev eventuelle forskelle mellem overlevelseskurver bedømt under anvendelse af log-rank test. Multivariate analyser blev udført i overensstemmelse med Cox regressionsmodellen til at bestemme sammenhængen mellem klinisk-patologiske variabler og dødelighed. P-værdier for 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Det stemness af gastrisk cancer cellelinjer

De procentdele af SP-celler var højere i OCUM-12. /SP og OCUM-2MD3 /SP celler end i deres forældres OCUM-12 og OCUM-2MD3 celler (Figur S1). Cancer stamcellemarkører af SP-celler, OCUM-12 /SP og OCUM-2MD3 /SP, såsom CD44, CD133, og NANOG, blev analyseret ved RT-PCR. Ekspressionsniveauet af disse markører blev signifikant forøget i begge SP cellelinier i sammenligning med deres forælder cellelinjer (figur S2). Antallet af sfæroide koloni var signifikant højere i både OCUM-12 /SP og OCUM-2MD3 /SP celler end deres forældre OCUM-12 og OCUM-2MD3 celler (data ikke vist).

Påvisning af kandidatproteiner

Vi undersøgte, om proteiner differentielt eller uafhængigt blev udtrykt i SP celler, og sammenlignet vores resultater til de af deres overordnede celler ved hjælp QSTAR Elite LC-MS /MS. Ved analyse af biologiske processer, og med en 95% sikkerhed cut-off grænse og p 0,05, vi identificeret, at proteiner faktisk blev udtrykt forskelligt. Resultaterne af disse resultater er vist i figur 1. De fleste af de proteiner blev overudtrykt i cytoplasmaet af tumorceller (figur 1A). P-værdi indbefattet i opfindsomhed analysen er angivet i tabel S1. Disse proteiner blev bestemt til at være relateret til cellulære processer, såsom celledød, metabolisme, cellulær organisation, DNA metabolisme, proteinnedbrydning, og behandling af RNA (figur 1B). . Den øverste kanoniske veje er forbundet med disse mål og identificeret af IPA er vist i tabel S2

(A) Lokalisering; (B) Biologiske processer identificerede proteiner. Vi kategoriseret proteiner baseret på deres funktionelle opgaver ved hjælp Ingenuity Pathway Analysis. De molekylære funktioner indberettede omfatter celledød, metabolisme, cellulær organisation, metabolisme af DNA, proteinnedbrydning, behandling af RNA, fremstilling af reaktive oxygenarter, nitrogenoxid, molekylær transport, cellecyklus, foldning protein og cellulær bevægelse. % = 100 X antal identificerede proteiner /analyseret alle 932 proteiner. (C), A Venn-diagram giver til tabel 2. Fyrre proteiner blev øget betydeligt i OCUM-12 /SP celler i forhold til deres forældre OCUM-12 celler. Tredive-fem proteiner blev øget betydeligt i OCUM-2MD3 /SP celler i forhold til deres forældre OCUM-2MD3cells. Otte kandidat proteiner, RBBP6, HSPA4, HSPA9, GLG1, DCTPP1, VPS13A, CK18 og ALDOA, overlapper i både OCUM-12 /SP og OCUM-2MD3 /SP celler. (D), mRNA-ekspression. RT-PCR-analyse viste, at ekspressionsniveauet af

RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1

, og

CK18

var høj i OCUM-12 /SP (9,15 fold, 9,36 gange, 4,14 gange, 7,80 gange, 2,08 gange, 1,46 gange, 3,44 gange, og 1,99 gange, henholdsvis) og OCUM-2MD3 /SP (6,15 gange, 1,71 gange, 2,33 gange 2,30 gange, 2,03 gange, 1,32 gange, 1,35 fold, og 1,31 gange, henholdsvis), i forhold til styring af forældre OCUM-12 og OCUM-2MD3. (E), Korrelation af signalveje mellem RBBP6 og differentielt udtrykte proteiner i CSC-lignende SP celler. RBBP6 er overudtrykt (rød) i CSC-lignende SP-celler (OCUM-12 /SP-celler og OCUM-2MD3 /SP-celler). Hsp90, HSPA4, og TAGLN2 (lyserød) opreguleret i CSC-lignende SP celler blev associeret med RBBP6 signalvejen.

I forhold til deres tilsvarende forælder celler, 40 proteiner var opreguleret i OCUM-12 /SP, og 35 proteiner opreguleret i OCUM-2MD3 /SP. Blandt disse proteiner, otte var opreguleret i begge OCUM-12 /SP-celler og OCUM-2MD3 /SP-celler, hvorimod der ikke blev observeret nogen sådan forbindelse mellem deres tilsvarende moderceller (tabel 2 og figur 1C). Af disse otte proteiner, de tre proteiner, RBBP6, GLG1, og VPS13A blev uafhængigt opdaget i begge SP cellelinier, men ikke i deres tilsvarende moderceller. De fem proteiner, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA, og KRT18, var betydeligt over-udtrykt af mindst 1,2 gange i både SP celler i forhold til deres tilsvarende forælder celler.

mRNA-ekspression niveau af disse 8 kandidat molekyler,

RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1

, og

CK18

blev øget i OCUM-12 /SP (9,15 gange, 9,36 gange, 4.14 fold, 7,80 gange, 2,08 gange, 1,46 gange, 3,44 gange, og 1,99 gange, henholdsvis) og OCUM-2MD3 /SP (6,15 gange, 1,71 gange, 2,33 gange 2,30 gange, 2,03 gange, 1,32 gange, 1,35 gange, og 1.31 fold, henholdsvis) celler, sammenlignet med dem af kontrollen med forældre OCUM-12 og OCUM-2MD3 celler (Figur 1D). Western blot-analyse indikerede, at ekspressionsniveauet af RBBP6 og ALDOA var høj i CUM-12 /SP og OCUM-2MD3 /SP-celler, i sammenligning med OCUM-12 og OCUM-2MD3 celler (Figur S3).

netværket præsenteret i figur 1E blev genereret af IPA, og analysen afhænger af de tidligere karakteriserede og rapporteret protein interaktioner. Således RBBP6, som blev observeret at være overudtrykt i CSC-lignende SP celler, OCUM-12 /SP celler og OCUM-2MD3 /SP celler, var direkte relateret til HSPA4 og Rb, og indirekte er forbundet med Hsp90 og TAGLN2. HSPA4, Hsp90 og TAGLN2 blev også fundet at være opreguleret i CSC-lignende SP celler.

Effekt af siRBBP6 transfektion på migrations- og invasive evner gastriske kræftceller

Figur 2A viser, at si

RBBP6

transfektion faldt betydeligt mRNA-ekspression niveau af både SP cellelinier (OCUM-12 /SP var 12%, p 0,01, OCUM-2MD3 /SP var 2,5% p. 0,01), i sammenligning med den for negativ-siRNA transfektion.

RBBP6

siRNA knockdown faldt betydeligt invasionen (figur 2B) og migration aktivitet (figur 2C) af både SP celler.

(A), OCUM-12 /SP og OCUM-2MD3 /SP viste højere niveau af

RBBP6

mRNA udtryk end deres forældre celler, OCUM-12 og OCUM-2MD3. RBBP6 udtryk i OCUM-12 /SP og OCUM-2MD3 /SP celler effektivt nedreguleret ved si

RBBP6

transfektion. (B), Repræsentative billeder af invaderende OCUM-12 /SP celler viste antallet af cancerceller invaderer poremembranfilter blev reduceret med

RBBP6

siRNA behandling. si

RBBP6

transfektion til OCUM12 /SP celler hæmmede invasionen evner betydeligt. Data er præsenteret som middelværdi og SD (fejlmargener) af fire eksperimenter. *

s

0,05, **

s

0,01. (C), si

RBBP6

behandling for OCUM12 /SP og OCUM-2MD3 /SP celler hæmmede markant migrationen evner, sammenlignet med den kontrol af

negativ-siRNA

behandling. Data er præsenteret som middelværdi og SD (fejlmargener) af fire eksperimenter. *

s

0,05, **

s

. 0,01

immunhistokemisk Vurdering af kandidatlandenes Proteiner og deres forening med klinisk-patologisk funktioner

RBBP6, DCTPP1, og HSPA9 blev observeret at være primært udtrykkes i cytoplasmaet og kerner af gastriske kræftceller. GLG1, VPS13A, HSPA9, HSPA4, ALDOA, og KRT18 blev observeret at være primært udtrykkes i cytoplasmaet (figur 3A). I normale epitelceller, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, og HSPA9 udtryk blev fundet nogle celler i epitel kirtel. KRT18 blev udtrykt i de fleste epitelceller. HSPA4 og ALDOA ekspression blev ikke fundet i normale celler. BBP6, DCTPP1, og HSPA9 blev udtrykt i cytoplasmaet og kerner af normale epitelceller. GLG1, VPS13A, HSPA9, og KRT18 blev observeret i cytoplasmaet af epitelceller (figur 3B).

(a) Udtryk i kræftceller. RBBP6, DCTPP1, og HSPA9 ekspression blev observeret primært i cytoplasmaet og kernen. GLG1, VPS13A, HSPA4, ALDOA, og KRT18 blev udtrykt i cytoplasmaet. (B), Ekspression i epitelceller. RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, og HSPA9 udtryk blev fundet nogle celler i epitel kirtel. KRT18 blev udtrykt i de fleste epitelceller. HSPA4 og ALDOA ekspression blev ikke fundet i normale celler.

Vi udforskes sammenhængen mellem ekspressionsniveauet af de otte kandidatlande proteiner, og de klinisk-patologiske træk. Antallet af sager til hver score for de otte mål blev vist i tabel S3. Disse otte proteiner blev bestemt til at være forbundet med potentielt maligne processer, såsom fjernmetastaser, lymfeknude (LN) metastase, invasion dybde, eller stadiet fremføring (tabel 3). De beregnede p-værdier var som følger: RBBP6 var signifikant associeret med invasion dybde (p 0,001), LN metastase (p 0,001), fjernmetastaser (p = 0,013), og klinisk fase (p 0,001); GLG1 var signifikant associeret med kun fjernmetastaser (p = 0,045). VPS13A var signifikant associeret med invasion dybde (p = 0,005), LN metastase (p 0,001), og fase fremgang (p = 0,005); DCTPP1 var signifikant associeret med invasion dybde (p 0,001), LN metastase (p 0,001), fjernmetastaser (p 0,001), og fase fremgang (p 0,001); HSPA9 var signifikant associeret med invasion dybde (p 0,001), LN metastase (p 0,001), og fase fremgang (p 0,001); HSPA4 var signifikant associeret med invasion dybde (p 0,001), LN metastaser (p 0,001), fjernmetastaser (p = 0,007), og scene avancement (p 0,001); ALDOA var signifikant associeret med invasion dybde (p = 0,034), LN metastaser (p = 0,004), og scene avancement (p = 0,029); og KRT18 var signifikant associeret med invasion dybde (p = 0,001), LN metastaser (p = 0,001), fjernmetastaser (p = 0,034), og scene avancement (p = 0,004).

Prognose

Kaplan-Meier-kurver foreslog, at af de otte over-udtrykte proteiner, RBBP6, DCTPP1, HSPA4, og ALDOA, var signifikant associeret med ringe overlevelse hos alle patienter (figur 4). Den kumulative fem år samlede overlevelsesraten for RBBP6-positive tilfælde (61%) var signifikant mindre (p = 0,002) end den for RBBP6-negative tilfælde (78%). Desuden patienter på stadium III, den samlede overlevelse på RBBP6-positive tilfælde var signifikant mindre (p = 0,034) end for RBBP6-negative sager. Prognosen for patienter med DCTPP1-positive tumorer (63%) var signifikant dårligere (p = 0,016) end den for DCTPP1-negative tumorer (75%). Den femårige samlet overlevelse på HSPA4-positive tilfælde (66%) var signifikant mindre (p = 0,047) end for HSPA4-negative sager (75%). Den femårige samlet overlevelse på ALDOA-positive tumorer udviser overekspression (61%) var signifikant dårligere (p = 0,043) end for ALDOA-negative tumorer (72%). I modsætning hertil blev der ikke observeret nogen signifikante korrelationer mellem andre proteiner og patient overlevelse. Efter univariat analyse blev RBBP6, DCTPP1, HSPA4, og ALDOA ekspressionsniveauerne signifikant associeret med dårlig prognose i 300 mavecancerpatienter (tabel 4). Desuden makroskopisk type (type 4), histologiske type (diffuse), T kategori (T2-4), invasion fartøj, infiltration mønster (INF b, c), peritoneal metastase, og LN metastaser blev bestemt til at være signifikant associeret med en dårlig prognose. Multivariat analyse blev udført ved hjælp af Cox Proportional Hazards Model for alle væsentlige variabler i univariate analyse. Ved analyse færdiggørelse, RBBP6 ekspression (p = 0,023), BORRMANN type 4 (p 0,001), bughinde positive (p = 0,001), LN metastase (p = 0,003), og hepatisk metastase (p = 0,001) blev bekræftet som uafhængige faktorer korreleret med overlevelse (tabel 3).