PLoS ONE: Klinisk Validering af målrettet Next Generation Sequencing til tyktarm og lunger

Abstrakt

Målsætning

For nylig har Next Generation Sequencing (NGS) begyndt at fortrænge andre teknologier til genmutation test, der kræves nu for målrettede behandlinger. Men overførsel af NGS teknologi til klinisk daglig praksis kræver validering.

Metoder

Vi valideret Ion Torrent AmpliSeq Colon og Lungekræft panel spørgekriterierne 1850 hotspots i 22 gener ved hjælp af Ion Torrent Personal Genome Machine . Først brugte vi kommercielle referencestandarder, der bærer mutationer ved defineret allel frekvens (AF). Derefter blev retrospektivt analyseret 51 kolorektale adenokarcinomer (CRC) og 39 ikke-småcellet karcinom (NSCLC)

Resultater

Følsomhed og nøjagtighed til påvisning af varianter på en AF . 4% var 100 % for kommercielle referencestandarder. Blandt de 90 tilfælde blev 89 (98,9%) med succes sekventeret. Blandt de 86 prøver, for hvilke NGS og henvisningen testen var både oplysende, 83 viste overensstemmende resultater mellem NGS og henvisningen test; dvs.

KRAS

BRAF

for CRC og

EGFR

for NSCLC, med de 3 disharmoniske sager hver karakteriseret ved en AF. 10%

konklusioner

Samlet set AmpliSeq colon /lungekræft panel var specifik og følsom for mutation analyse af gen-paneler og kan indarbejdes i den kliniske daglige praksis

Henvisning:. D’Haene N, Le Mercier M, De Nève N, Blanchard O, Delaunoy M, El Housni H, et al. (2015) Klinisk Validering af målrettet Next Generation Sequencing for Colon og lungekræft. PLoS ONE 10 (9): e0138245. doi: 10,1371 /journal.pone.0138245

Redaktør: Aldo Scarpa, University of Verona, Italien

Modtaget: Marts 4, 2015; Accepteret: August 27, 2015; Udgivet: 14 September, 2015

Copyright: © 2015 D’Haene et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:. Dette arbejde blev støttet af midler fra “Fonds Yvonne Boël” (Bruxelles, Belgien). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Nylige fremskridt inden sekventering teknologi har gjort det muligt omfattende profilering af genetiske ændringer i kræft [1]. Udviklingen af ​​tyrosinkinaseinhibitoren behandlinger har gjort det vigtigt at teste cancerpatienter for klinisk signifikante genmutationer, der påvirker fordelene ved behandlingen. Identifikation af cancer-associerede mutationer er blevet standard pleje til kræftbehandling; eksempler på sådanne omfatter

RAS

mutationer i metastatiske kolorektale karcinomer eller

EGFR

mutationer i lungekræft. Rutinemæssig

EGFR

somatiske mutation test anbefales nu i Europa og USA for ikke-planocellulære ikke-småcellet karcinom (NSCLC) [2, 3]. Nye europæiske retningslinjer kraftigt opfordre en bred dækning af exon 18-21 [2]. Desuden nye NCCN retningslinjer for NSCLC bakker kraftigt bredere molekylær profilering med det mål at identificere sjældne driver mutationer for hvilke effektive lægemidler allerede kan være til rådighed, eller på passende informere patienterne om tilgængeligheden af ​​kliniske forsøg (NCCN retningslinjer http: //www.nccn .org /fagfolk /physician_gls /pdf /nscl.pdf). Indtil for nylig, indikationer for standard-of-care molekylær test i kolorektale karcinomer omfattede test for

KRAS

mutations status som indikator for reaktion på anti-epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) stoffer såsom cetuximab [4]. Nu retningslinjer anbefaler, at i det mindste, exon 2

bør fastlægges KRAS

mutation status og når det er muligt, ikke-exon 2

KRAS

NTM

mutation statuts bør også bestemt (NCCN retningslinjer https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/colon.pdf). Dette understreger, at antallet (eller omfanget) af biomarkører, der vil blive skal vurderes i klinisk daglige praksis i molekylær patologi er stærkt stigende. Dette kræver iværksættelse af metoder sondering den mutationsstatus af flere gener. Desuden er denne stigning i antallet af gener for at teste forbundet med et fald i antallet af stikprøver. Den patolog står over for en ny udfordring: optimering af tilgængelige tumorvæv. Da antallet af klinisk signifikante genetiske varianter er steget, har klinisk afprøvning udviklet sig, flytter fra enkelte mutationer at multiplekse hotspot evalueringer i forskellige cancerformer gener. I de senere år har Next Generation Sequencing (NGS) begyndt at fortrænge andre teknologier til genmutation test [5-8]. Målrettet, amplicon-baserede NGS byder samtidig sekventering af tusindvis af korte DNA-sekvens i en massivt parallel måde, og kan tilbyde en omkostningseffektiv metode til påvisning af flere genetiske ændringer med et minimum af DNA [5, 9, 10]. Desuden kan NGS udføres ved anvendelse af DNA fra formalinfikserede, paraffinindlejrede (FFPE) vævsblokke [11-16]. Den kliniske anvendelse af NGS i kræft er påvisningen af ​​klinisk handlingsrettede genetiske /genomiske forandringer, der er kritiske for kræftbehandling [6]. Disse ændringer kan være af diagnostisk, prognostisk eller terapeutisk betydning. Men overførsel af NGS teknologi til klinisk daglig praksis kræver validering.

I den foreliggende undersøgelse, vi evaluerede den kliniske anvendelighed af Ion Ampliseq Colon og Lungekræft panel på Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM-Life Technologies) at screene lunge og kolorektale cancere. Ion Ampliseq Colon og lungekræft panel er en multiplex-PCR-baseret bibliotek forberedelse metode, hvorved 90 amplikoner, der omfatter 1825 mutationsvarianter hotspots i 22 gener relateret til tyktarmen og lungekræft selektivt amplificeret [14, 15, 17, 18].

Materialer og metoder

Etik Statement

Dette arbejde er blevet godkendt af den etiske komité i Erasme Universitetshospital (Bruxelles, Belgien-ref: P2013 /174). Ifølge den belgiske lov fra december 2008 «Loi relative à l’opnåelsen et à l’udnyttelse de materiel corporel Humain afsætte à des applikationer médicales humaines ou à des finner de recherche Scientifique», ingen skriftligt informeret samtykke var påkrævet. Den etiske komité har således givet afkald på behovet for skriftligt informeret samtykke fra deltageren.

Prøver valg

Tumor prøver fra 90 patienter blev efterfølgende analyseret, herunder 51 kolorektale adenokarcinomer (CRC) og 39 ikke-lille celle lungecarcinomer (NSCLC herunder 37 adenocarcinomer og 2 pladecarcinomer). Den mutationsstatus af

KRAS

BRAF

i CRC og

EGFR

i NSCLC tidligere var blevet vurderet i forbindelse med den daglige praksis. De primære prøvetyper var enten kirurgiske resektioner (n = 57, 44 CRC og 13 NSCLC), biopsier (n = 23, 7 CRC og 16 NSCLC) eller celle blokke (n = 10, alle NSCLC). Derudover har vi brugt 12 ikke neoplastiske prøver (6 lunger og 6 koloner) og 5 kommercielle FFPE referencestandarder (Horizon Diagnostics, Cambridge, UK), der bærer mutation i

NTM

,

KRAS

,

AKT

EGFR dele på 50% allel frekvens (AF) og en FFPE multiplex referencestandard (Horizon Diagnostics, Cambridge, UK), der bærer 11 forskellige mutationer ved forskellige definerede AF (0,9-24,4% ).

DNA-ekstraktion

DNA blev ekstraheret fra FFPE tumorprøver hjælp QIAamp FFPE væv (Qiagen, Antwerpen, Belgien). Kort fortalt blev ufarvede 10 um paraffinsnit skåret og inkuberet ved 37 ° C i en tørreovn natten over. Paraffinen blev fjernet ved at inkubere objektglassene i 2 successive bade xylen og tumorvævet blev manuelt macrodissected, skrabet af objektglasset med en skalpel og overført til et 1,5 ml rør. DNA blev derefter ekstraheret i henhold til producentens anvisninger. H 100000 og /eller den gennemsnitlige basis dækning var 500X blev betragtet som ikke informativ. Mutationer blev påvist ved anvendelse af Variant Caller plug-in v3.6 med indstillinger lav stringens (Life Technologies). I varianten liste opnåede, blev hver mutation verificeret i den Integrativ genom viewer (IGV) fra de overordnede Institute (https://www.broadinstitute.org/igv/) [19]. Kun mutationer rapporteret i COSMIC (Sanger Institute Katalog over somatiske mutationer i Cancer) database (https://www.sanger.ac.uk/cosmic) blev taget i betragtning, og tavse eller intron mutationer blev ikke rapporteret.

statistiske analyser

De ikke-parametrisk Mann-Whitney og Kruskal-Wallis test blev brugt til at sammenligne to eller flere uafhængige grupper af numeriske data, hhv. Hvis Kruskal-Wallis test var signifikant, blev post-hoc test anvendt ved hjælp af enten standard Dunn procedure for at sammenligne alle gruppens par eller tilpasning for at sammenligne hver eksperimentel betingelse for kontrol, undgå flere sammenligning effekter (som beskrevet i Zar [20] )

Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af Statistica (Statsoft, Tulsa, OK, USA) og p-værdier 0,05 blev betragtet som signifikante.

Resultater

NGS panel validering

Udførelsen af ​​AmpliSeq Colon og lungekræft panel blev først evalueret ved brug 12 ikke neoplastiske væv (6 lunger og 6 koloner) og 6 kommercielle FFPE referencestandarder (5 referencestandarder med en mutation på 50% allel frekvens og en multiplex referencestandard transporterer 11 forskellige mutationer på forskellige definerede allele frekvenser, varierende fra 0,9 til 24,4%).

Nej mutation blev påvist i 12 ikke-neoplastiske væv. De 5 mutationer til stede i de 5 referencestandarder ved 50% allel frekvens blev alle korrekt opdaget af NGS med AmpliSeq Colon og lungekræft panel (tabel 1). Blandt de 11 mutationer i multiplex referencestandard, alle mutationer med AF 3% var korrekt detekteret ved NGS med undtagelse af

KIT

mutation fordi dette gen er ikke inkluderet i de 22 gener af panelet . For de 3 mutationer med AF 3%, kun én (

EGFR

sletning i exon 19, AF = 2,0%) blev registreret af Variant Caller mens de to andre (

EGFR

p .L858R og p.T790M med AF = 2,7% og 0,9% henholdsvis) var ikke. Af IGV inspektion, fandt vi, at disse varianter var til stede, men med lav AF (25/1633 læser (1,5%) og 7/1613 læser (0,4%), henholdsvis). Yderligere mutationer i

CTNNB1

,

BRAF

,

PIK3CA

EGFR

blev opdaget af Variant Caller i referencestandarder (tabel 1).

KRAS

De nationale tilsynsmyndigheder

standarder genereres fra SW48 cellelinie, som er rapporteret til at bære

CTNNB1

p.S33Y og

EGFR

p.G719S mutationer i COSMIC database (https://www.sanger.ac.uk/cosmic);

EGFR

standarder genereres fra RKO cellelinie, som er rapporteret til at bære

BRAF

p.V600E og

PIK3CA

p.H1047R mutationer. Endelig er multiplex referencestandard genereret fra RKO, SW48 og HCT16 cellelinjer, hvilket forklarer påvisning af

CTNNB1

p.S33Y mutation i denne kontrol.

Præcisionen (reproducerbarhed og repeterbarhed) blev også evalueret under anvendelse af 2 FFPE tumorprøver og multiplex referencestandard. Prøverne blev analyseret 5 gange (5 bibliotek produktioner startende fra det samme DNA ekstrakt) i tre forskellige eksperimenter (tabel 2). Alle mutationer med en AF 4% var konsekvent opdaget. Men mutationer med en AF 3% blev påvist ved Variant Caller i en eller flere, men ikke alle, af de fem gentagelser. Af IGV inspektion, TP53 mutationer inkonsekvent detekteres af Variant Caller var kun til stede i replikat for hvilken mutationen blev registreret af Variant Caller, men ikke for de andre gentagelser (S1 tabel). For reference standarden blev de 3 EGFR varianter opdaget af IGV inspektion (men med en variant dækning 30x for de fleste af de gentagelser). Selvom disse var der modstridende opdaget af Variant Caller (S1 Table)

Desuden blev nogle mutationer verificeret af ddPCR (tabel 2). Den p.H1047Q PIK3CA mutation, konsekvent opdaget af NGS med en gennemsnitlig AF på 10,8%, blev også opdaget af ddPCR med en AF på 9,1%. I modsætning hertil blev p.R181C og p.H168Y TP53 mutationer inkonsekvent opdaget af NGS ikke opdaget af ddPCR. I betragtning af de faktiske forhold, at mutationer detekteret med en AF 3% blev ikke valideret af ddPCR (til TP53 mutationer) eller inkonsekvent opdaget (EGFR mutationer i referencestandard), og at KRAS mutation med en forventet AF 5% konsekvent blev påvist med en AF varierende fra 4,6 til 5,9%, vi valgt en 4% aF-tærskel for mutation rapportering. Denne tærskel er i overensstemmelse med de data, der er rapporteret i litteraturen for denne NGS platform [9, 16, 21].

Sequencing forestillinger

Et sæt af 90 FFPE prøver, herunder 51 CRC og 39 NSCLC , blev sekventeret ved NGS. Sekventering præstation blev vurderet ud fra antallet og fordelingen af ​​læser på tværs af de målrettede regioner. Blandt de 90 sekventerede tilfælde, 89 (98,9%) var en succes (antal kortlagt læser 100000 eller gennemsnitlig basis dækning 500x). Den unsuccesfull Sagen blev betragtet som ikke informativ på grund af en række læser 100 000 (40,072 læser) og gennemsnitlig basis dækning 500x (1.2X). Blandt de 89 held sekventerede tilfælde blev ét tilfælde betragtes suboptimal (antal ordlyd: 69,564 og gennemsnitlig basis dækning: 676x), men kvaliteten af ​​sekventering blev anset god nok til yderligere analyse. Alle de andre tilfælde (n = 88, 97,8%) havde en række læser 100.000 og en gennemsnitlig basis dækning 1000X. Det gennemsnitlige antal læser pr prøver var 232,832 og den gennemsnitlige basis dækning dybde var 2,296. I gennemsnit havde 91,6% af de amplikoner en dækning dybde på mere end 500x (tabel 3). Der var ingen signifikant forskel mellem CRC og NSCLC med hensyn til antallet af læser (p = 0,45), basis dækning dybde (p = 0,42) og procentdelen af ​​amplikoner med en dækning dybde højere end 500x (p = 0,32) (Mann-Whitney-test ). For 12 tilfælde, mængden af ​​DNA opnået efter ekstraktion var for lav til at nå den nødvendige 10 ng til målrettet sekventering (DNA-koncentration i området fra 0,1 til 1.5ng /pl). Den sekventering var en succes for de 12 sager, og blev ikke observeret nogen statistisk forskel med hensyn til antallet af læser (p = 0,45), basis dækning dybde (p = 0,42) og i form af en procentdel af amplikoner med en dækning dybde på mere end 500x ( p = 0,32) mellem prøver med mindre end det krævede 10 ng DNA og prøver med tilstrækkelig DNA (Mann-Whitney-test, tabel 3). Dette tyder på, at en vellykket sekventering kan opnås fra så lidt som 1 ng DNA.

Vi overvejede derefter indflydelsen af ​​forskellige primære prøvetyper på sekventering ydeevne. Ingen statistisk forskel blev observeret i form af antallet af læser og base dækning dybde mellem kirurgiske resektioner, biopsier og celle blokke (Kruskal-Wallis test, tabel 3). Procentdelen af ​​amplikoner med en dækning dybde på mere end 500X var imidlertid signifikant højere for celleblokkene end for biopsier (Kruskal-Wallis test p = 0,02 og post-hoc test p = 0,02).

ampliconer, som viste en dækning under 250X blev betragtet som ikke informativ. Denne grænse blev allerede brugt i litteraturen [22]. Nogle af de amplikoner af panelet gentagne gange ikke nå 250x (i mere end 10% af prøverne). Disse amplikoner er anført i tabel 4. amplikoner der gentagne gange mislykkedes var den samme for de forskellige primære prøvetyper (biopsier, celle blokke og kirurgisk resektion). For disse amplikoner, GC indholdet var signifikant højere (gennemsnitligt GC-indhold i de 7 amplikoner der gentagne gange mislykkedes var 69,6% mod 48% for de andre amplikoner, p = 0,00005), mens længden ikke var signifikant forskellige (den gennemsnitlige varighed af 7 amplikoner der gentagne gange mislykkedes var 108 bp mod 112 for de andre amplikoner).

Sammenligning med andre metoder

Et sæt af 90 FFPE prøver, herunder 51 CRC og 39 NSCLC, var sekventeret ved NGS. Den mutationsstatus af

KRAS

(exon 2) og

BRAF

(p.V600E) i CRC og

EGFR

(p.L858R og udeladelser i exon 19) i NSCLC tidligere er blevet vurderet af PCR i forbindelse med den daglige praksis.

NSCLC.

Sekventering var en succes for 38 af de 39 prøver testet (97%), mens den

EGFR

analyse med PCR-fremgangsmåden var vellykket til kun 35 af de 39 prøver (90%). 34 prøver har succes teste både NGS og PCR, tillader undersøgelse af konkordans.

Brug NGS, mutationer i

EGFR

blev påvist i 4/38 tilfælde (10,5%). Tre ud af fire

EGFR

mutationer blev også påvist ved PCR. For én prøve, der blev anset for ikke informativ ved PCR, en p.L861Q

EGFR

mutationen blev opdaget ved hjælp af NGS (S2 tabel). Desuden er en p.L858R

EGFR

mutation blev påvist ved PCR og ved NGS. Men for denne prøve Variant Caller opdaget mutationen på en AF på 1,9%; givet vores kriterier til at overveje en variant som autentisk (se materiale og metoder) kunne vi ikke validere denne variant.

Samlet overensstemmelse mellem de to metoder til

EGFR

mutationer afsløring var af 33/34 (97%)

Endvidere blev mutationer i andre gener opdaget af NGS:. mutationer i

KRAS

for 15/38 prøver (39,5%), mutationer i

TP53

til 15/38 patienter (39,5%), mutationer i

STK11

for 3/38 patienter (7,9%), mutation i

BRAF

for én prøve (2,6%), mutation i

PIK3CA

for én patient (2,6%), mutation i

CTNNB1

for én prøve (2,6%). Mutations profiler af NSCLC blev sammenfattet i figur 1 og i S2 tabel. Samlet blev 29/38 prøver kendetegnet ved mindst én mutation (76,3%).

Mutationer i forskellige gener (rækker) er anført for hver NSCLC prøve (søjler). En grå firkant angiver, at en mutation (rapporteret i COSMIC database (https://www.sanger.ac.uk/cosmic), undtagen polymorfisme) blev fundet med Ampliseq Colon og Lung panel i genet, mens en tom firkant angiver at ingen relevante mutation blev fundet for genet

de 2 KRAS-mutationer identificeret med en aF. 6% (én p.G12S med en aF på 4%, en p.G12D med en aF 5%), blev verificeret ved ddPCR. De 2 mutationer blev opdaget af ddPCR med en AF på 1,1 og 5,7%, henholdsvis (S2 tabel).

CRC.

sekventering og PCR var en succes for alle prøver.

Brug NGS, mutationer i

KRAS

blev påvist i 30/51 tilfælde (58,8%), mens

KRAS

analyse med PCR-metoden opdaget kun 23 tilfælde af mutationer i

KRAS

gen (45,1%). Fem af de 7 disharmoniske sager blev præget af mutationer i codon 59, 61 og 146 (exons 3 og 4), der ikke var omfattet af PCR-testen. Mutationer i codon 61 og 146 blev testet og valideret af ddPCR (S3 Table) For de 2 resterende tilfælde ikke påvises ved PCR,

KRAS

p.G12V mutation blev opdaget af NGS med en AF på 8 og 9%, henholdsvis. Disse mutationer blev også påvist ved ddPCR med en AF på 12,5 og 9%, hhv. I de 23 samstemmende tilfælde, AF af

KRAS

mutationer var højere end 20% i 21 tilfælde; Kun i to tilfælde var præget af en AF på 9 og 10%, hhv.

mutationsstatus af

BRAF

ved PCR blev evalueret for 49 tilfælde (for 2 tilfælde var der ikke nok DNA) .

BRAF

p.V600E mutation blev detekteret i 5 patienter (10,2%) under anvendelse af NGS eller PCR. . Desuden er en

BRAF

p.E586K mutation blev detekteret ved anvendelse NGS

Desuden mutationer i andre gener blev opdaget af NGS: mutationer i

NTM

for 2/51 patienter (3,9%), mutationer i

TP53

for 32/51 patienter (62,7%), mutationer i

PIK3CA

for 10/51 patienter (19,6%) og mutationer i

FBXW7

til 5/51 prøver (9,8%). De 2 NTM mutationer og den p.E545K, p.H1047 PIK3CA mutationer blev alle godkendt af ddPCR (S3 tabel).

mutations profiler af CRC blev sammenfattet i figur 2 og S3 tabel. Samlet blev 45/51 prøver kendetegnet ved mindst én mutation (88,2%).

Mutationer i forskellige gener (rækker) er anført for hver CRC prøve (søjler). En grå firkant angiver, at en mutation (rapporteret i COSMIC database (https://www.sanger.ac.uk/cosmic), undtagen polymorfisme) blev fundet med Ampliseq Colon og Lung panel i genet, mens en tom firkant angiver at nogen relevant mutation blev fundet for genet.

diskussion

En stor fordel ved NGS forhold til traditionelle mutation påvisningsmetoder er dens evne til at screene multiple mutationer i multiple gener samtidigt uden behov at udføre flere sekventielle tests. Flere undersøgelser har allerede valideret anvendelse af NGS og dens overlegenhed på sigt af følsomhed, hastighed og omkostninger sammenlignet med traditionelle metoder. [18, 23, 24] I vores egen erfaring, for test, herunder mere end to til tre forskellige hotspots, NGS er billigere, hurtigere og kræver mindre DNA end det ville være behov for traditionelle metoder. Dette er af særlig betydning for cytologiske prøver og små-vævsbiopsier for hvilke adskillige molekylære ændringer skal screenes, som for NSCLC prøver fx [9, 18]. Faktisk NGS kræver kun 10 ng for den fulde kolon og lungekræft panelet, mens traditionelle metoder kan kræve op til 10 ng DNA for hver testet mutation.

præcision (reproducerbarhed og repeterbarhed) analyse ved hjælp reference- standarder med en kendt AF tilladt os at vise, at alle mutationer med en AF 5% var konsekvent opdaget. Men mutationer med en AF 3% blev opdaget inkonsekvent. Hertil kommer, når kliniske prøver blev analyseret 5 gange i 3 forskellige eksperimenter, Variant Caller inkonsekvent opdaget mutationer med en AF 3%, som ikke er opdaget af ddPCR, hvilket tyder på, at disse mutationer svarer til sekventering artefakter, som det ofte observeret med DNA ekstraheret fra FFPE prøver [25-27]. Tærsklen for 4% blev således valgt til mutation rapportering som en balance mellem at maksimere følsomhed og minimere de falsk-positive resultater på grund af teknisk artefakt. Denne tærskel er i overensstemmelse med andre sensitivitet og specificitet data rapporteret i litteraturen for denne NGS platform [16, 21]. Ved hjælp af denne tærskel, blev et tilfælde af NSCLC med en p.L858R EGFR mutation savnet. Til denne prøve detekteres Variant Caller mutationen ved AF på 1,9%. Men i betragtning af vores kriterier for at overveje en variant som autentisk (AF 4% og variant dækning 30x), kunne vi ikke validere denne variant. Det blev for nylig foreslået, at kendte klinisk relevante genvarianter, såsom

EGFR

mutationer for NSCLC, skal indberettes uanset AF [28]. I vores nuværende klinisk praksis, når vi observerer et kendt klinisk relevante gen variant, men med en AF under tærsklen, rapporterer vi, at genet variant er mistanke, men ikke bekræftet, og at det ville være interessant at teste en anden prøve fra patienten hvis tilgængelig .

Uoverensstemmelser mellem NGS og traditionelle metoder blev observeret for 2 CRC sager med KRAS G12V mutationer, begge med en allel frekvens 10%. Denne lave AF kan forklare de forskelle, fordi tærsklen på traditionelle metode varierer fra 3 til 20% af mutant DNA for KRAS testning. For disse 2 sager,

KRAS

p.G12V mutationer blev valideret af ddPCR.

En af udfordringerne ved hjælp NGS er at fortolke de fundne mutationer inden for biologisk sammenhæng. Som allerede beskrevet [28], varianterne kan inddeles i tre kategorier: i) dem, der kan have en direkte indvirkning på patientpleje og betragtes handlingsrettede; (Ii) dem, der kan have biologisk relevans, men er ikke klart handlingsrettede; og (iii) dem, der er af ukendt betydning. I den foreliggende undersøgelse, NGS analyse opdaget mutationer (bortset

EGFR

mutationer for NSCLC og end

KRAS

NTM

for CRC) med potentielle kliniske effekt for 4 patienter med NSCLC (en

PIK3CA

mutation og 3

STK11

mutationer) og for 14 patienter med CRC (10

PIK3CA

mutationer, 5

BRAF

mutationer-én patient husly

PIK3CA

og

BRAF

mutationer). Faktisk støtter prækliniske data argumentet om, at NSCLC cellelinjer med

PIK3CA

eller

STK11

KRAS

mutation show forøget følsomhed over for PIK3 hæmmere eller MAPK og mTOR signalering hæmning, henholdsvis [29] – [30]. Desuden er en fase I dosis-eskalering klinisk forsøg med en pan-klasse I PI3K inhibitor hos patienter med fremskredne solide tumorer-primært colorectal, bryst, og lunge-viste foreløbige antitumoraktivitet [31]. På samme måde blev tilsyneladende antitumoraktivitet observeret hos patienter med

BRAF

muteret CRC behandlet med en selektiv mutant BRAF inhibitor [32].

Som konklusion den foreliggende undersøgelse validerede den kliniske anvendeligheden af ​​Ion Ampliseq Colon og lungekræft panel på Ion Torrent Personal Genome Machine til screening lunge- og tarmkræft. Samlet set AmpliSeq colon /lungekræft panel var specifik og følsom nok til mutation analyse af gen-paneler og kan indarbejdes i den kliniske daglige praksis.

Støtte Information

S1 fil. Supplerende metoder:. Påvisning af KRAS, BRAF og EGFR-mutationer og dråbe digital PCR

doi: 10,1371 /journal.pone.0138245.s001

(DOCX)

S1 Table. Dækning analyse for varianter ikke konsekvent påvist i præcision analyse

doi:. 10,1371 /journal.pone.0138245.s002

(DOC)

S2 Table. Sekventeringsresultaterne af NSCLC

doi:. 10,1371 /journal.pone.0138245.s003

(DOCX)

S3 Table. Sekventeringsresultaterne af CRC

doi:. 10,1371 /journal.pone.0138245.s004

(DOCX)