PLoS ONE: Molekylær Switch Rolle Akt i Kantet Konval Lectin-induceret apoptose og Autophagy i Human ikke-småcellet lungekræft A549 celler

Abstrakt

Kantet Konval

lektin (POL), isoleret fra traditionel kinesisk medicin urt

(Mill.)

Druce har trukket stigende opmærksomhed på grund af sin brede biologiske aktiviteter. I den foreliggende undersøgelse antitumorvirkninger, herunder apoptosis- og Autophagy-inducerende egenskaber af POL, blev bestemt ved en serie af cellebiologiske metoder såsom MTT, cellulær morfologi observation, flowcytometri, immunblotting. Heri fandt vi, at POL samtidig kunne inducere apoptose og autofagi i humane ikke-småcellet lungekræft A549 celler. POL initieret apoptose gennem hæmme Akt-NF-KB-vejen, mens POL udløste autofagi

via

undertrykke Akt-mTOR pathway, hvilket tyder på det molekylære skifte rolle Akt i reguleringen mellem POL-induceret apoptose og autofagi. Desuden var ROS involveret i POL-induceret hæmning af Akt ekspression, og kan derfor medierer både apoptose og autofagi i A549-celler. Desuden POL viste ingen signifikant cytotoksicitet mod normale humane embryonale lungefibroblast helf celler. På grund af de anti-tumor aktiviteter, kan POL blive en potent anti-cancer medicin i fremtiden terapi, som kunne bane vejen for at udforske GNA-relaterede lektiner i effektive lægemidler i kræftbehandlingen

Henvisning:. Li C, Chen J, Lu B, Shi Z, Wang H, Zhang B, et al. (2014) Molekylær Skift Rolle Akt i

Kantet Konval

Lectin-induceret apoptose og Autophagy i Human ikke-småcellet lungekræft A549 Cells. PLoS ONE 9 (7): e101526. doi: 10,1371 /journal.pone.0101526

Redaktør: Jin Q. Cheng, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: Januar 15, 2014 Accepteret: 8 jun 2014; Udgivet 3. juli, 2014

Copyright: © 2014 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af National Natural Science Foundation of China (nr 81.373.311, No. 31.300.674, No. 30.970.643, No. 81.173.093 og nr J1103518), det særlige program for unge Videnskab og Teknologi Innovative Group i provinsen Sichuan Research, Kina (nr 2011JTD0026). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lektiner er udpeget som kulhydrat-bindende proteiner, der i vid udstrækning findes i dyr, planter og mikroorganismer, og de kunne binde kulhydrater, agglutinere celler eller bundfald polysaccharider og glycokonjugater [1]. Der er opnået hurtige fremskridt i isolering og karakterisering af plante lektiner, og for nylig klassificeringen af ​​lektiner er emended fra 7 familier i 12 familier [2] – [4].

Af note, er kræft forbundet med programmeret celledød (PCD), som spiller en vigtig rolle i homøostase præservering, cellulær differentiering, vækstkontrol, celle forsvar og osv, fællesskab forsegling endelige skæbne cancerceller [5]. Generelt er der to hovedtyper af PCD, der henviser til apoptose og autofagi. Autophagy er en evolutionært bevaret cellulære mekanisme til clearance af beskadigede eller overflødige makro-komplekser og organeller i eukaryote celler, hvilket fører til enten pro-overlevelse eller pro-død effekter [6]. Apoptose, der kan reguleres af talrige molekylære signalveje, er primært målrettet til tumor selvmord. Autophagy og apoptose bære tydelige morfologiske egenskaber og fysiologisk proces, men der findes stadig indviklede sammenhænge mellem dem [7].

Kantet Konval

(Mill.) Druce, en typisk repræsentant for Liliaceae familie, er en vigtig traditionel kinesisk urtemedicin grund af sine brede sorter af biologisk aktive forbindelser.

Kantet Konval

lektin (POL), isoleret fra

Kantet Konval

(Mill.) Druce, er et mannose-bindende specifik

almindelig vintergæk

agglutinin (GNA)-relaterede familie lectin, og udøver bemærkelsesværdig vækst-hæmning virkninger mod A375-celler [8]. Tidligere rapport har vist, at POL inducerede L929 celle apoptose gennem både død-receptoren og mitokondrie veje, samt amplificeret TNFa-induceret L929 celle apoptose [9]. Men om POL samtidigt kunne inducere apoptose og autofagi i kræftceller er stadig i deres vorden. Og hidtil, kan kun

Polygonatum cyrtonema

lektin (PCL) samtidig fremkalde både apoptose og autofagi i humane melanom A375-celler [10] og L929-celler [11]. Derfor skal udforskes apoptosis- og autofagi-fremkaldende virkninger af POL.

Materialer og metoder

Molekylær modellering

Tre-dimensionelle struktur af POL blev bygget ved hjælp SWISS -model server (https://swissmodel.expasy.org/) med strukturen af ​​PCL (FBF ID: 3A0E). som skabelon [12], [13]

Cell kultur

lunge adenocarcinom A549 cellelinier blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA), mens normale humane embryonale lunge fibroblast HELF cellelinjer blev købt fra celle bank (Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina). Humane ikke-småcellet lungekræft A549-celler blev dyrket i RPMI-1640 medium (Gibco) indeholdende 10% FBS, 100 mg /ml streptomycin (Invitrogen), 100 U /ml penicillin (Invitrogen), og holdt ved 37 ° C med 5% CO

2 i en fugtig atmosfære. Og humane embryonale lunge fibroblast helf celler, der anvendes som tilsvarende kontrolgruppe, blev dyrket i Dulbecco minimalt essentielt medium (Gibco), der indeholder de samme materialer.

Reagenser

POL blev renset og vedligeholdes af vores laboratorium [8]. Føtalt bovint serum (FBS), 3- (4,5-dimetrylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT), 3,3-diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB), monodansylcadaverin (MDC), autofagi inhibitor 3- methyladenin (3-MA), acridinorange (AO), blev rhodamin-123 og z-VAD-fmk indkøbt fra Sigma Chemical (St. Louis, MO, USA). cytochrom

c

Apoptotisk WB antistof cocktail (ab110415) blev opnået for MitoSciences (Eugene, Oregon, USA). Små interfererende RNA (siRNA’er) mod human Beclin1 (# 6222), LC3 (# 6212) og styre siRNA (# 6568) blev købt fra cellesignalering Technologies, USA

Efter antistoffer blev indkøbt fra Santa Cruz Biotech.: pro-caspase3 (# sc-7148), pro-caspase9 (# sc-56073), Bax (# sc-493), Bud (# sc-6538), Bcl-2 (# sc-492), Bcl-X

L (# sc-8392), PARP (# sc-7150), NF-KB (# sc-109), Phospho-NF-KB (Ser536) (# sc-136.548) og β-actin (# sC- 47.778). Desuden antistoffer herunder Phospho-Beclin1 (Ser234) (ab183335), mTOR (ab2732) og Phospho-mTOR (Ser2448) (ab109268) var fra Abcam. Antistoffer til LC3 (mAb # 12741), Akt (pan) (mAb # 4685), Phospho-Akt (Thr308) (mAb # 2965), Phospho-Akt (Ser473) (mAb # 4060), Phospho-p70S6K (Thr389) ( mAb # 9234) og Phospho-4EBP1 (Thr37 /46) (mAb # 2855) blev købt fra cellesignalering Technologies, USA. Proteiner blev visualiseret ved anvendelse af anti-kanin- eller anti-muse-IgG konjugeret med peroxidase (HRP) og 3,3-diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) som HRP substrat.

konstitutivt aktiveret Akt (Myr-Akt, Addgene plasmid 9008 ), blev NF-KB (T7-RelA, Addgene plasmid 23251), mTOR (Flag-mTOR, Addgene plasmid 26603), tomme vektor (pcDNA3, Addgene plasmid10792) købt fra Addgene.

vækst inhiberingsassay

A549-celler blev podet i 96-brønds plader og dyrket i angivne tid, og de cytotoksiske virkninger af forskellige koncentrationer af POL blev udført som tidligere beskrevet [14]. Absorbansen ved 570 nm blev målt med et spektrofotometer (Model 3550 Microplate Reader, Bio-Rad).

Cell levedygtighed (%) = (OD

570 nm (lægemiddel) /OD

570 nm (kontrol )) x 100%.

mannose inhiberingsassay

MTT-assay blev bestemt som nævnt ovenfor, bortset fra at lectiner blev præinkuberet ved 37 ° C i 30 minutter med forskellige typer af mannoses, såsom mannose α (1,3), mannose α (1,6) og mannose α (1,3:1,6), som fuldstændigt kan inhibere hæmagglutinerende aktivitet ved forskellige koncentrationer af POL.

Apoptose assay

A549 og hELF celler blev behandlet med PBS og 23 ug /ml POL i 12 timer, 24 timer, 36 timer og 48 timer. Cellemorfologi blev afbildet ved fasekontrastmikroskopi (Leica, Wetzlar, Tyskland) samt fluorescens mikroskopi (Olympus, Tokyo, Japan) med Hoechst 33342-farvning. Derefter, i alt 6 x 10

5 A549-celler /brønd blev udpladet i 6-brønds plader og inkuberet i 24 timer, og behandlet med PBS eller 23 pg /mL POL i yderligere 12 timer, 24 timer, 36 timer eller 48 h inkubation. Høstede celler blev analyseret ved flowcytometri assay som beskrevet før [15]. For yderligere at klassificere tidlige og sene apoptose i POL-behandlede A549-celler, blev Annexin V-FITC /PI dobbelt farvning-assay udført af Annexin V-fluoresceinisothiocyanat (FITC) apoptosis afsløring kit ifølge producentens instruktioner (BD Pharmingen, San Diego , CA, USA).

Autophagy assay

efter inkubation med 23 ug /ml POL for angivne tid, A549 og hELF celler blev dyrket med 0,05 mM MDC ved 37 ° C i 60 minutter. Fluorescensintensiteten af ​​cellerne blev analyseret ved flowcytometri. Desuden blev A549-celler inkuberet med PBS eller 23 pg /mL POL indikationsgodkendelse tid farvet med acridinorange (10 ng /ml) i 15 minutter og udsat for flowcytometri. Celler blev henholdsvis transficeret med Beclin1 siRNA, LC3 siRNA og styre siRNA på 33 nm ved anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. De transficerede celler blev anvendt til efterfølgende eksperimenter 24 timer senere.

Caspase-assay

Apoptose blev vurderet ved måling af aktiviteten af ​​caspase-3 ved hjælp af caspase-3-aktivitet kit (Beyotime Institute of Biotechnology Haimen, Kina) ifølge producentens instruktioner.

Påvisning af mitokondrisk membranpotentiale

mitokondrie membranpotentiale blev målt ved anvendelse af fluorescerende farvestof rhodamin-123 som tidligere beskrevet [15]. Fluorescensintensiteten af ​​A549-celler forstyrret 23 ug /ml POL i 12 timer, 24 timer, 36 timer og 48 timer blev analyseret ved flowcytometri.

Bestemmelse af intracellulær ROS

Efter behandling med forskellige koncentrationer af POL for de indikerede tidsperioder blev A549-celler inkuberet med 10 pM 2 ‘, 7’-dichlorofluorescein diacetat (DCFH-DA) i 60 minutter ved 37 ° C. Fluorescensintensiteten af ​​A549-celler blev målt ved flowcytometri med en excitationsbølgelængde på 480 nm og en emissionsbølgelængde på 525 nm. Intracellulær GSH-indhold og GPX-enzymaktivitet blev målt i overensstemmelse med producentens anvisninger.

Transfektioner

A549-celler blev udpladet i 60 mm skåle med RPMI 1640 indeholdende 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin nået til en densitet på 1 x 10

6 celler /skål. Derefter A549-celler kontinuerligt dyrket i PRMI 1640 uden 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin i yderligere 2 timer. For at danne plasmid-Lipofectamin LTX komplekset, blev plasmider blandet med 25X fortyndingsmiddel Lipofectamin LTX, og inkuberet i 20 minutter i stuetemperatur. Derefter transfektioner blev henholdsvis udført i OptiMEM reduceret-serum medium (Invitrogen) indeholdende 1 mg /ml DNA, 0,1% PLUS reagens og 0,3% Lipofectamine LTX transfektionsreagens og tilsat mediet med plasmid i 60 mm skåle i yderligere 48 timer kultur af A549-celler. Endelig blev transfektionseffektiviteten detekteret ved Western Blot-analyse.

Western blot-analyse

A549-celler blev behandlet med 23 ug /ml POL for angivne tid, og efterfølgende både klæbende og flydende celler blev opsamlet. Western blot analyse af cellelysater blev udført som tidligere nævnt [16], [17].

Statistisk analyse af data

Alle data blev udtrykt som gennemsnit ± SEM fra mindst tre uafhængige forsøg . Statistiske sammenligninger blev foretaget af to-vejs ANOVA og envejs ANOVA med Bonferroni post hoc test. En p value≤0.05 blev betragtet som signifikant.

Resultater

Molekylær modellering af POL

Lektiner fra GNA-relaterede familie bære forskellig aminosyresekvens forfatning, men de alle udstillede lignende tredimensional struktur. GNA-relaterede familie lectiner bærer streng mannose-bindende aktivitet, og bevares aminosyremotiv af ‘QXDXNXVXY’ spiller vigtige roller i mannose anerkendelse. POL besad tre konserverede ‘QXDXNXVXY’ subdomæner, og derfor POL var streng mannose-bindende lektin. Som vist i fig. 1A blev den tredimensionelle struktur af POL bygget, og monomeren med POL udviste en β-tønde, der omfatter tre subdomæner (I, II, III), hvert underdomæne består af tre eller fire strenge af antiparallel β sheet interagere med Ω loop.

(A) Molekylær struktur POL monomer. (B) coloncarcinom Caco-2-celler, cervix carcinoma HeLa-celler, ikke-småcellet lungekræft A549-celler, hepatocellulært carcinom HepG

2 og 7721 celler, bryst carcinom MCF-7 celler, melanoma A375-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af POL i 24 timer, og IC

50 værdier blev kvantificeret ved MTT-assay (middelværdi ± SEM,

n

= 3). (C) A549-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af POL, og derefter cellelevedygtigheden blev bestemt ved MTT-assayet på det angivne tidspunkt (middelværdi ± SEM,

n

= 3). (D) Diverse koncentration af POL blev præinkuberet ved 37 ° C i 30 minutter med mannose (1-3), mannose (1-6) og mannose (1-3; 1-6), og derefter behandlet med A549-celler i 24 h. Cellen hæmmende forhold blev målt ved MTT assay (gennemsnit ± SEM,

n

= 3).

cytotoksiske virkninger af POL på A549 celler

Den hæmmende vækst virkninger af POL blev evalueret af MTT assay på humane cancerceller, herunder tyktarmscarcinomceller Caco-2 celler, livmoderhalsen karcinom HeLa-celler, ikke-småcellet lungekræft A549 celler, hepatocellulært carcinom HepG

2 og 7721 celler, bryst carcinom MCF- 7-celler, melanom A375-celler, og IC

50 værdier var 47 ug /ml, 30 ug /ml, 23 ug /ml, 42 ug /ml, 38 ug /ml, 50 ug /ml og 26 ug /ml henholdsvis (fig. 1B). Dette resultat viste, at POL var mere følsomme over for ikke-småcellet lungekræft A549-celler, og derfor blev A549-celler valgt til yderligere udforskning.

POL induceret A549 celledød på en dosis- og tidsafhængig måde, og 0 ug /ml til 100 ug /ml POL udøvede potente inhiberende virkninger på væksten af ​​A549-celler (fig. 1C). Efter 24 timers inkubation med 23 mg /ml POL, den hæmmende nåede næsten til 50%.

Sammenhængen mellem sukker-bindende og anti-proliferative aktivitet af POL

mannose hæmning assay blev udført for at bestemme forholdet mellem sukker-bindende aktivitet af POL og dets anti-proliferativ egenskab. Forskellige koncentrationer af POL blev præinkuberet med mannose α (1,3), mannose α (1,6) og mannose α (1,3:1,6) i 30 min. På grund af den mannose-bindende aktivitet af POL, alle tre typer mannoses inhiberede fuldstændigt hæmagglutinerende aktivitet af POL. Som vist i fig. 1D, de væksthæmmende virkninger af forskellige koncentrationer af POL blev tabt på det tilsvarende niveau med den taber af mannose-bindende aktivitet, hvilket indikerer, at der kan være en tæt forbindelse mellem hæmagglutinerende aktivitet og anti-proliferativ egenskab af POL.

POL inducerer apoptose i A549-celler

Afgrænsede apoptotiske morfologiske ændringer som membranblæredannelse, reduktion cellevolumen og afrunding, blev observeret i 23 ug /ml POL-behandlede A549-celler ved fasekontrastmikroskopi (fig. 2A). Desuden blev betydelig DNA fragmentation i kerner observeret i POL-induceret A549-celler, mens PBS-behandlede kontrolgruppe viste normale, runde og homogent farvede kerner (fig. 2B). Men 23 mikrogram /ml POL ikke resultere i synlige apoptotisk morfologi i ikke-kræft helf celler efter 24 timer eller 48 h behandling (Fig. 2C og fig. 2D). Disse resultater antydede, at POL selektivt kunne fremkalde A549 celler apoptose, men kunne ikke udløse apoptose af normale helf celler. Derudover som vist i fig. 2E, 23 mikrogram /ml POL markant ført til forbedring af Sub-G

1 fag andel af A549 celler i en tidsafhængig måde (b: 27,34 ± 4,1%, c: 39,27 ± 5,8%), hvilket indikerer, at POL induceret apoptose i A549-celler. Endvidere blev Annexin V-FITC og PI dobbelt farvning udført for at klassificere blandt levende celler (Annexin V- /PI-), tidligt apoptotisk (Annexin V + /PI-), sent apoptotiske (Annexin V + /PI +) og nekrotiske celler (Annexin V – /PI +). Som vist i fig. 2F, efter 23 mikrogram /ml POL behandling, procentdelen af ​​levende celler blev gradvist reduceret (a: 98,25 ± 1,3%, b: 74,63 ± 4,7%, c: 55,71 ± 3,9%), mens forholdet mellem tidlig (b: 15,34 ± 2,6%, c: 23.75 ± 2,8%) og sent (b: 13,94 ± 3,6%, c:. 22.14 ± 4,5%) apoptotiske celler blev forøget med stigende tid

(A) A549-celler blev behandlet med PBS (24 h) eller 23 ug /ml POL for angivne tid, og de morfologiske sorter blev påvist under fasekontrastmikroskopi og (B) fluorescerende mikroskopi (200 ×). (C) Efter behandling med HELF celler med PBS (24 h) eller 23 ug /ml POL for angivne tidsrum blev morfologiske sorter detekteret under fasekontrastmikroskopi og (D) fluorescensmikroskopi (200 ×). (E) Forskellige faser procentdel af A549-celler forstyrret 23 ug /ml POL i 24 timer eller 48 timer blev målt ved flowcytometri. Kontrolgruppe blev behandlet med PBS i 24 timer. (F) A549 celler blev udsat for 23 ug /ml POL i 24 timer eller 48 timer blev forholdene mellem tidlig apoptose og sen apoptose målt ved flowcytometri under anvendelse af Annexin V-FITC /PI dobbelt farvning-assay. Kontrolgruppen blev behandlet med PBS i 24 timer.

POL udløser autofagi i A549 celler

For at påvise dannelsen af ​​autophagic vakuoler, MDC fluorescerende intensitet på 23 mikrogram /ml POL -behandlet A549 og hELF celler i 24 timer eller 48 timer blev analyseret ved flowcytometri. Som vist i fig. 3A, autophagic vakuoler blev dannet i A549-celler, der blev fremhævede ved forøget MDC fluorescensintensitet, indikerer tilstedeværelsen af ​​autophagic celledød. Men i fig. 3B, MDC fluorescerende intensitet helf celler behandlet med POL var ikke øget hverken efter 24 timer eller 48 timer, hvilket tyder autophagic vakuoler ikke blev dannet i POL-induceret helf celler. Vi kunne omfatte, at POL kan selektivt inducere autophagic celledød i A549-celler, men ikke i HELF celler. Ved yderligere anvendelse af acridinorange-farvning, dannelsen af ​​sure vesikulære organeller (AVO) i POL-udløst A549-celler blev demonstreret (fig. 3C). Da Beclin1 forbedring og transformation af LC3I til LC3II var karakteristika autophagy, blev opdaget udtrykkene for Beclin1 og LC3 i POL-induceret A549 celler. Som vist i fig. 3D, POL inducerede den tidsafhængige forøgelse af Beclin 1 niveau og akkumulering af LC3-II i A549 celler. Efterfølgende blev udtryk for Beclin1 og LC3 slået ned ved hjælp af specifikke siRNA’er (Fig. 3E). Transfektion med Beclin1 eller LC3 siRNA faldt POL-induceret cellevækstinhiberingen (fig. 3F). Alle disse resultater viste, at POL induceret autofagi i A549-celler.

A549-celler (A) og HELF celler (B) blev behandlet med PBS (24 h) eller 23 ug /ml POL for angivne tid, og MDC fluorescerende intensitet blev analyseret ved flowcytometri. (C) A549-celler blev behandlet med PBS (24 h) eller 23 ug /ml POL for angivne tid, og acridinorange fluorescensintensitet blev målt ved flowcytometri. (D) A549-celler blev behandlet med 23 ug /ml POL for angivne tid, efterfulgt af Western blot-analyse til påvisning af phosphorylerede-Beclin1 og LC3 niveauer. β-actin blev anvendt som en lige loading kontrol. (E) A549-celler blev transficeret med Beclin1, LC3 eller kontrol siRNA i 24 timer blev den Beclin1 og LC3 niveauer undersøgt ved Western blot-analyse. (F) A549-celler blev transficeret med Beclin1, LC3 eller kontrol siRNA i 24 timer efterfulgt af stimulering med eller uden 23 ug /ml POL i 24 timer blev cellevækstinhiberingen forhold målt ved MTT-assayet (middelværdi ± SEM,

n

= 3).

POL Fremkalde caspase-afhængig apoptose i A549 celler

Som vist i fig. 4A, efter autophagic inhibitor 3-MA behandling, 23 ug /ml POL signifikant forøget caspase-3-aktivitet i en tidsafhængig måde, hvilket indikerer POL-induceret apoptose forekommer gennem aktivering af fælles apoptotiske eksekutorer såsom caspase-3. Desuden Western blot-analyser efter autofagi blev inhiberet viste, at efter behandling med 23 ug /ml POL for angivne tidspunkt blev caspase-3 og -9 spaltet, eftersom procaspase-3 og -9 blev reduceret, mens spaltet caspase-3 og -9 var forøget (fig. 4B a). Også, opregulering af pro-apoptotiske Bax og byde proteiner samt nedregulering af anti-apoptotiske Bcl-2 og Bcl-X

L-proteiner blev observeret efter POL behandling. Desuden 23 mikrogram /ml POL førte til spaltning af PARP fra en 116 kDa bånd til en kDa fragment 89 med stigende tid (fig. 4B b), og cytochrom

c

blev løsladt fra mitokondrier i cytoplasmaet efter POL behandling (fig. 4B c). Som vist i fig. 4C og fig. 4D, når autofagi blev undertrykt af 3-MA, POL faldt rhodamin 123 fluorescensintensitet i en tidsafhængig måde. Endvidere kunne kløvning af caspase-3 og -9 reddes i nærvær af 10 uM z-VAD-fmk i POL-induceret A549-celler (fig. 4E). Og, Sub-G

1 celle andel analyse og Annexin V /PI dobbelt farvning blev også vist, at caspaseinhibitor z-VAD-FMK kunne beskytte A549 celler fra apoptotisk celledød (fig. 4F og fig. 4G). Alle disse resultater viser tydeligt, at POL apoptose gennem mitokondrie-medieret vej i A549-celler.

(A) Virkninger af 23 ug /mL POL på caspase-3-aktivering med stigende tid (middelværdi ± SEM,

n

= 3) (* p 0,05

vs

0 h gruppe).. (B) 23 ug /ml POL inducerede kløvning af caspase-3, caspase-9 (a). POL resulterede i kløvning af PARP, opregulering af pro-apoptotisk Bax og Bid, samt nedregulering af anti-apoptotiske Bcl-2 og Bcl-X

L med dyrkningstid (b). Cellelysater blev fraktioneret til isolering cytoplasmatiske og rå mitokondrier, og tilstedeværelsen af ​​cytochrom

c

i cytosoliske og mitokondriske fraktioner blev vurderet ved WB analyse under anvendelse af ApoTrack antistofcocktail. β-Actin blev anvendt som en cytosol lige ladningskontrol, mens prohibitin blev anvendt som mitokondrier loading kontrol (c). (C) Indflydelsen af ​​23 ug /mL POL på integriteten af ​​mitokondrielle membraner blev målt ved rhodamin 123-farvning, og fluorescensintensiteten blev analyseret ved flowcytometri. (D) De sorter af mitochondriemembraner potentiale blev yderligere præsenteret som bar diagram (gennemsnit ± SEM,

n

= 3) (** p 0,001

vs

Kontrolgruppe, ns:. Nej signifikant

vs

. kontrolgruppen). (E) Western blot-analyse af pro-caspase 3, spaltet caspase 3, pro-caspase9 og spaltede caspase9 niveauer i A549-celler behandlet med 23 ug /ml alene eller i kombination med 10 pM caspaseinhibitor z-VAD-fmk i 24 timer. (F) A549-celler blev behandlet med 23 ug /ml POL alene eller kombineret med 10 pM caspaseinhibitor z-VAD-fmk i 24 timer og farvet med propidiumiodid (PI), kvantificering af PI farvende data præsenteret som procentdele af celler i SubG

1 fase. (G) indflydelse caspase den 23 mikrogram /ml POL-induceret SubG

1 fase forholdet var repræsenteret som bar diagram (gennemsnit ± SEM,

n

= 3) (## p 0,001

vs

POL gruppe, ns:.. ingen signifikant

vs

POL gruppe)

Hæmning af autofagi delvist reducerer POL-induceret apoptose

Som. vist i fig. 5A, efter autophagy blev undertrykt, POL-induceret cellevækst-inhibering blev signifikant nedsat. Inhibering af autophagy af 3 mA eller knockdown af Beclin1 ved forbehandling med Beclin1 siRNA (Fig. 5B) faldt forholdet mellem MDC positive celler (fig. 5C a), hvilket indikerer, at autophagy blev undertrykt af 3mA og Beclin1 siRNA. Desuden, nedtrykning af POL-induceret autofagi inhiberede POL-induceret apoptose i A549-celler, som blev fremhævede ved reduktion af sub-G

1 fag-DNA-indhold (fig. 5C b), samt tidlige og sene apoptotiske del (Fig . 5C c). Konsekvent, undertrykkelse af autophagy ved enten 3mA eller Beclin1 siRNA også ført til fald i PARP spaltning og LC3-II-ekspression i POL behandlede A549-celler (fig. 5D og fig. 5E). Alle disse resultater viste, at inhibering af autofagi delvist reducerer POL-induceret apoptose i A549-celler.

(A) A549-celler blev forbehandlet med 2 mM 3mA 1 time før administration af 23 ug /ml POL for angivne tid , og cellen inhiberende forholdet blev målt ved MTT-assayet. Kontrolgruppe blev behandlet med PBS. (Gennemsnit ± SEM,

n

= 3) (* p 0,05, ** p 0,001

vs

Kontrolgruppe, ns:.. Ingen signifikant

vs

Kontrol gruppe, # p 0,05, ## p. 0,001

vs

POL gruppe). (B) A549-celler blev transficeret med kontrol siRNA og specifik Beclin1 siRNA i 24 timer blev Beclin1 niveau undersøgt ved Western blot-analyse. (C) A549-celler blev forbehandlet med 2 mM 3mA eller transficeres specifikke Beclin1 siRNA før administration af 23 ug /ml POL i 24 timer, og MDC fluorescensintensitet (a), SubG

1 phag-forhold (B ) og tidligt samt sen apoptose (c) blev analyseret ved flowcytometri. Kontrolgruppe blev behandlet med PBS i 24 timer. Data blev repræsenteret som bar diagram. (Gennemsnit ± SEM,

n

= 3) (* p 0,05, ** p 0,001

vs

Kontrolgruppe, ns:. Ingen signifikant

vs

Control. gruppe, # p 0,05, ## p. 0,001

vs

POL gruppe). (D) Spaltet PARP og LC3-II udtryk i A549-celler behandlet med 23 ug /ml POL i 24 timer i fravær eller nærvær af 3 mA (2 mM) blev målt. De repræsentative tal blev vist. (E) A549-celler blev fortrinsvis transficeret med kontrol siRNA eller specifik Beclin1 siRNA i 24 timer før den 23. ug /ml POL behandling i yderligere 24 timer, og spaltning af PARP samt ekspression af LC3II blev målt.

POL udløser apoptose gennem undertrykke Akt-NF-KB-sti og igangsætter autofagi

via

hæmmende Akt-mTOR pathway

Western blot-analyser viste, at behandling af A549 celler med 23 mg /ml POL for angivet tid resulterede i nedsat udtryk for fosforyleret-NF-KB (p65) (Ser536), phosphoryleret-Akt (Ser473), phosphoryleret-Akt (Thr308), phosphoryleret-mTOR (Ser2448), phosphoryleret-70S6K (Thr389) og phosphoryleret-4E -BP1 (Thr37 /46) (fig. 6A). Og de nedstrøms substrater af mTORC1, p70S6K (70 kDa ribosomal S6 kinase) og 4E-BP1, blev også effektivt dephosphoryleret med POL behandling i A549-celler (fig. 6A). For at bekræfte signalvejen i POL-behandlede A549-celler anvendte vi genetiske tilgang til henholdsvis over-express Akt, NF-KB og mTOR (fig. 6B) i POL-behandlede A549-celler. Som vist i fig. 6B, der var stærk aktivering af Akt, NF-KB og mTOR i transficerede A549-celler sammenlignet med vektoren-transficerede dem, bekræfter transfektionseffektiviteten. Transfektion af Myr-Akt i A549-celler (over-ekspression af Akt) omvendt POL-induceret reduktion af phosphoryleret-NF-KB (p65) (Ser536) og phosphoryleret-mTOR (Ser2448) (fig. 6B). Men Transfektion af T7-RelA (overekspression af NF-KB) eller Flag-mTOR (overekspression af mTOR) resulterede ikke i nogen omvendte af proteinerne (fig. 6B), hvilket indikerer, at Akt kunne være opstrøms for NF-KB og mTOR i POL-behandlede A549 celler.

(A) efter behandlet med 23 ug /m POL for angivne tid, niveauerne af fosforyleret-Akt, Akt, phosphoryleret-NF-KB (p65) , NF-KB (p65), phosphorylerede-mTOR, mTOR, phosphoryleret-p70S6K og phosphoryleret-4E-BP1 blev påvist. β-actin blev anvendt som en lige loading kontrol. (B) A549-celler blev transficeret med tom vektor, Myr-Akt (aktiveret), T7-RelA (aktiveret) og Flag-mTOR (aktiveret) og behandlet med 23 ug /ml POL til 0 timer eller 24 timer. Niveauerne af fosforyleret-Akt, Akt, phosphoryleret-NF-KB (p65), NF-KB (p65), phosphoryleret-mTOR og mTOR blev målt. β-actin blev anvendt som en lige loading kontrol. (C) vedvarende aktivering af Akt, NF-KB og mTOR prio til 23 ug /ml POL behandling i 24 timer, blev påvist de morfologiske sorter under fasekontrastmikroskopi. Kontrolgruppe blev behandlet med PBS i 24 timer. (D) Efter kontinuerlig aktivering af Akt, NF-KB og mTOR, blev 23 ug /ml POL behandlet med A549-celler i 24 timer, den SubG

1 fag-forhold (a), tidligt samt sen apoptose ratio (b ), blev MDC fluorescensintensitet (c), og AVO fluorescensintensitet (d) analyseret ved flowcytometri. Kontrolgruppe blev behandlet med PBS i 24 timer. Data blev repræsenteret som bar diagram. (Gennemsnit ± SEM,

n

= 3). (* P 0,05, ** p 0,001

vs

Kontrolgruppe, ns:. Ingen signifikant

vs

POL gruppen, # p 0,05, ## p 0,001

. vs

POL gruppe).

For yderligere at kontrollere, om disse proteiner deltaget i POL-induceret apoptose eller autophagy, morfologi afsløring og flowcytometri assay blev anvendt. Som vist i fig. 6C, over-ekspression af Akt omvendt POL-induceret celledød, mens overekspression af NF-KB og mTOR stadig bibeholdes delvis POL-induceret celledød. Det angives, at Akt kunne stå for POL-induceret både apoptose og autofagi i A549 celler. Desuden Akt overekspression resulterede i fald i SubG

1 del (fig. 6D a), tidligt apoptotiske (Annexin V + /PI-) og sent apoptotiske (Annexin V + /PI +) celler (Fig. 6D b), MDC fluorescensintensitet (fig. 6D c) samt sure vesikulære organeller (AVO) dannelse (fig. 6D d). Disse resultater viste, at over-ekspression af Akt kunne ændre POL-induceret apoptose og autophagy samtidigt, hvilket indikerer Akt protein kan indebære både POL-induceret apoptose og autofagi. Men overekspression af NF-KB resulterede kun i undertrykkelse af apoptotiske funktioner, herunder faldt betydeligt dele af SubG

1 (fig. 6D a) samt tidlig og sen apoptotiske celler (fig. 6D b). Mens overekspression af mTOR tilbageføres kun POL-induceret autophagy, som karakteriseret ved reduceret fluorescerende intensitet MDC (Fig. 6D c) og AO (fig. 6D d). Tilsammen kan vi konkludere, at POL-induceret apoptose gennem undertrykke Akt-NF-KB-vejen, mens indledt autofagi

via

hæmme Akt-mTOR pathway. Akt driver skifte mellem autofagi og apoptose i POL-behandlede A549 celler.

POL-induceret molekylær switch rolle Akt er ROS-afhængig

ROS-niveauer blev påvist ved anvendelse ROS-afsløring fluorescerende farvestof DCFH -DA. Det er påvist, at ROS akkumulation blev styrket i POL-induceret A549 celler i en dosis- og tidsafhængig måde (fig. 7A). Endvidere inkubation af A549-celler med 23 pg /mL POL førte til en reduktion af GSH-indhold og GPX enzymaktivitet i en tidsafhængig måde, hvilket antyder, at POL ophævede GSH antioxidant systemet og sidst resulterede i massiv ROS-akkumulering i A549-celler (fig . 7B). Og kunne dette 23 ug /mL POL-inducerede stigning af ROS inhiberes ved forbehandling med ROS scavenger, NAC (fig. 7C). Desuden kan denne stigning også inhiberes ved forbehandling med apoptoseinhibitor z-VAD-fmk eller autofagi inhibitor 3-MA (fig. 7D). β-actin blev anvendt som en lige loading kontrol.