PLoS ONE: Expression og New Exon Mutationer af Human Beta Defensiner og deres Association på tyktarmskræft Development

Abstrakt

Udviklingen af ​​kræft involverer genetisk disposition og en række miljømæssige påvirkninger. Hele genomet binding analyser påvisning af den betydelige sammenkædning af mange sygdomme til modtagelighed loci på kromosom 8p23, placeringen af ​​det humane defensin-genklyngen. Humane p-defensiner (HBDS) er vigtige molekyler af medfødte immunitet. Denne undersøgelse blev designet til at analysere ekspressionen og genetiske variationer i HBDS (HBD-1, HBD-2, HBD-3 og HBD-4) og deres formodede association med tyktarmskræft. hBD genekspression og relative proteinekspression blev evalueret ved Real-Time polymerasekædereaktion (qPCR) og immunhistokemi henholdsvis fra 40 normale patienter og 40 patienter aldersmatchede med coloncancer i Saudiarabien. Desuden blev HBD polymorfismer genotypebestemt ved exon sekventering og ved promotor-methylering. hBD-1, hBD-2, hBD-3 og hBD-4 basal messenger RNA-ekspression var signifikant lavere i tumorvæv sammenlignet med normale væv. Adskillige insertionsmutationer blev påvist i forskellige exoner af de analyserede HBDS. Der blev imidlertid ikke methylering i nogen HBDS promotorer opdaget på grund af det begrænsede antal CpG-øer i disse regioner. Vi viste for første gang en forbindelse mellem hBD ekspression og tyktarmskræft. Dette antyder, at der er en betydelig sammenhæng mellem medfødte immunitet deregulering gennem afbrydelse af kationiske peptider (HBDS) og den potentielle udvikling af tyktarmskræft

Henvisning:. Semlali A, Al Amri A, Azzi A, Al Shahrani O, Arafah M, Kohailan M, et al. (2015) Udtryk og New Exon Mutationer af Human Beta Defensiner og deres Association på tyktarmskræft Development. PLoS ONE 10 (6): e0126868. doi: 10,1371 /journal.pone.0126868

Academic Redaktør: Isabelle A. Chemin, CrCL-INSERM, FRANCE

Modtaget: Juli 25, 2014 Accepteret: April 8, 2015; Udgivet: 3 Juni 2015

Copyright: © 2015 Semlali et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:. forfatterne udvide deres påskønnelse til Dekanat af videnskabelig forskning ved King Saud University for at finansiere arbejdet gennem projektet forskningsgruppen No: RGP-VPP-260 og af en bevilling fra Fonds Émile-Beaulieu (Laval University Foundation)

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyktarmskræft ( CRC) er den tredje mest almindeligt diagnosticeret kræft blandt mænd og den fjerde mest almindelige blandt kvinder i hele verden [1]. The American Cancer Society anslår at der vil være mere end 96.000 nye tilfælde af tyktarmskræft, der fører til omkring 50.000 dødsfald i 2014 (American Cancer Society 2014). I Kongeriget Saudi-Arabien (KSA), tyktarmskræft er en af ​​de hyppigste sygdomme [2], med en median alder på 60 år for mænd og 58 år for kvinder [3]. Cancerudvikling er blevet rapporteret at involvere genetiske faktorer [4] og også en række miljømæssige påvirkninger [5]. Genetisk disposition for cancer er multifaktoriel, herunder somatiske genetiske ændringer, såsom mutationer i onkogener eller tumorsuppressorgener [6], og ændringer i genekspression profilering eller DNA-methylering. Genekspressionsprofilering har tilbudt en ny måde at klassificere humane tumorer [7]. Baseret på de mRNA-ekspressionsniveauer af specifikke gener, kan forskellige undertyper af cancer kan identificeres. DNA-methylering er den mest undersøgte epigenetiske markør [8]. DNA hypermethylering-induceret gen-nedregulering er en fælles begivenhed i mange maligniteter, der tjener som en alternativ mekanisme til genetisk mutation at påvirke tabet af tumor suppressor funktioner [9,10]. Opdagelsen af ​​global DNA hypometylering i humane tumorer blev efterfulgt af angivelsen af ​​hypermethylerede tumorsuppressorgener, og for nylig, er også blevet beskrevet inaktivering af microRNA (miRNA) ved DNA-methylering [11,12]. Denne form for epigenetisk ændring kan bidrage til tumor initiering og progression gennem transkriptionel lyddæmpning af tumorsuppressorgener. Faktisk har adskillige gener vist sig at være epigenetisk inaktiveret ina lang række tumorer [13]; Således kan begrebet »hypermethylering profil ‘af tumorer har potentielle kliniske anvendelser [14-16]. Hypermethyleret gener kan omfatte dem, der er involveret i celle cyklus regulering (p16INK4a, p15, Rb) [17], DNA-reparation (BRCA1, MGMT), modstand (MGMT), cellulær differentiering, angiogenese (THBS1) og metastase [13]. Dog foreligger begrænsede oplysninger om den rolle, dereguleringen af ​​medfødte immunitet gener og deres plausibel forbindelse med tyktarmskræft. Desuden beviser for rollen som den naturlige immunforsvar i beskyttelse mod tumor udvikling er blevet påvist ved undersøgelser af immunsvækkede patienter [18]. Det er veldokumenteret, at en svag immunrespons har en direkte og omvendt korrelation med mange typer cancer [19,20]. Alle celler i den menneskelige krop har flere linjer af forsvar mod cellulær transformation, og det menneskelige immunsystem er en vidunderlig og velkoordineret netværk af celler, organer og kirtler, der beskytter kroppen mod uhensigtsmæssige fysiologiske deregulering. En optimeret immunsystem er nøglen til et godt helbred og levetid. Endvidere det medfødte immunrespons har stor specificitet mod bevarede molekylære mønstre af mikroorganisme komponenter, som kaldes patogen-associeret molekylære mønstre (PAMPs). Receptorerne på immunceller, der genkender PAMPs kaldes mønstergenkendelse receptorer (PRRS). Toll-lignende receptorer (TLRs) er en stor klasse af PRRS, og hver TLR genkender en anden PAMP [21-23]. Aktivering af en medfødt immunrespons fortsætter dog binding til mønstergenkendelse receptorer, såsom TLRs. Disse TLR’er er centrale sensorer invaderende patogener, i vid udstrækning aktiveres af medfødte immunforsvar aktører såsom epitelceller [23]. TLR signaleringskaskade kan involvere aktivering af adaptormolekylet MyD88, og begge kaskader fører til aktivering af NF-KB til at fremme transkriptionen af ​​pro-inflammatoriske cytokiner, chemokiner og kationiske peptider også kendt som human beta-defensiner (HBDS). Disse HBDS tilhører en familie af antimikrobielle peptider, der udgør en vigtig del af det medfødte immunforsvar. Til dato har fire HBDS (1-4) blevet identificeret i humane væv. hBD-1 konstitutivt produceret af forskellige epitelvæv såsom luftvejene og huden [24], mens udtrykkene for HBDS er inducerbar [25]. Specifikt hBD-2 stærkt udtrykt i normale epitelceller efter kontakt med mikroorganismer eller cytokin (TNF-og IL-1) stimulering [26,27].

deres genomiske struktur består af to exoner og et intron. Den første exon koder for signalpeptidet, og det andet koder for et modent peptid indledes med en kort anionisk propeptid. Det modne peptid opnået efter proteolytisk spaltning af signalsekvensen. Trods den lave sekvens ligheder mellem disse proteiner, deres 3D strukturer har en lignende defensin-lignende topologisk fold bestående af tre-strenge arrangeret i tre antiparallelle ark begrænset af tre intramolekylære disulfidbroer [28,29]. Beta-defensiner har en klynge af kationiske rester (Lys, Arg) nær carboxylterminalerne af peptiderne. Den C-terminale positivt ladede aminosyrer spiller en afgørende rolle i den antimikrobielle aktivitet [30,29]. De positive netto ladning og hydrofobe egenskaber fremmer HBDS interaktion med mikrobielle membraner. HBDS øve direkte antimikrobiel virkning og er aktive mod bakterier, svampe og vira; parallelt, ifølge de seneste data, de besidder flere biologiske aktiviteter, navnlig, immuno-modulerende dem [29], og er impliceret i den anti-tumor respons.

Formålet med denne undersøgelse var at undersøge deregulering af HBDS genekspressionsprofilen, HBDS exon mutationer, og promotor-methylering af HBDS samt sammenslutningen af ​​disse resultater med tyktarmskræft fremme hos mennesker. Fra et klinisk synspunkt, kan proteiner, der er involveret i disse veje tjene som mål for kræftbehandling, gennem den potentielle anvendelse af hBD /TLR-immunterapi.

Resultater

Kliniske data for patienter diagnosticeret med tyktarmskræft via koloskopi

De kliniske karakteristika for 40 saudiske patienter, herunder alder, nationalitet, familie historie, rygevaner, stadie af tyktarmskræft, medicin og tilstedeværelsen af ​​andre sygdomme, blev indsamlet og sammenlignet mellem tyktarmskræft og kontrollere patienter. Den indskrevet befolkning omfatter ikke-rygere uden familie historie af tyktarmskræft og uden allergi. Undersøgelsen alder varierede mellem 45 og 75 år, med et gennemsnit på 60 ± 16,56 år for mænd og 55 ± 13,74 år for kvinder (tabel 1). Det er også interessant at bemærke, at et stort antal af deltagerne, der lider af kræft i tyktarmen ikke kemoterapi eller strålebehandling.

Differential hBD genekspression i tyktarmskræft væv

For at analysere ekspression af de forskellige HBDS (1-4) på ​​mRNA-niveauet, kvantitativ real-time revers transkription-PCR blev udført under anvendelse af coloncancer væv og normale væv isoleret fra den samme patient. Som vist i figur 1, blev ekspressionsniveauerne af alle HBDS faldet i cancervæv sammenlignet med normale væv. Specifikt HBD-1-niveauer faldt signifikant (p 0,0001) fra 0,99 ± 0,02 hos de normale væv til 0,29 ± 0,14 i cancervæv (Fig 1A). hBD-2 niveauer faldet fra 1,03 ± 0,08 i kontrollerne til 0,36 ± 0,18 i kræft væv, med p 0,0001 (Fig 1B). hBD-3 faldt fra 1,11 ± 0,11 i kontrolgruppen væv til 0,48 ± 0,09 i kræft væv (Fig 1C), og hBD-4 faldet fra 0,99 ± 0,03 i kontrol væv til 0,46 ± 0,10 i kræft væv (Fig 1D) .

Totalt cellulært RNA frisk ekstraheret fra normale og tyktarmskræft væv blev revers transkriberet til cDNA og derefter anvendt til at måle hBD mRNA-ekspression (Panel1A til 1D).

Immunhistokemisk sammenligning mellem forskellige antimikrobielle peptider

for at bekræfte mRNA udtryk data, vi bestemmes HBDS proteinekspression ved immunhistokemi. Som vist i figur 2A, blev positiv immunofarvning for HBDS generelt observeret i normale colon-epitelceller og også i nogle stromaceller. Men intensiteten af ​​farvning for alle HBDS var lavere i adenocarcinom kolon tumorvæv. For at kvantitativt at bestemme den differentielle ekspression af HBDS i coloncancer væv i forhold til normale væv, vi tælles de positive celler og bestemmes en vilkårlig ekspressionsniveau, som vist i fig 2B til 2D. Disse resultater bekræftede lave HBDS i kræft væv i forhold til normale væv. Den observerede lave HBD proteiner bekræfter konstateringen af ​​lave niveauer af hBD genekspression.

Væv blev immunfarvet ved anvendelse af specifikke antistoffer (HBD Panel 2A). hBD- positive celler i væv blev anslået som følger: 0 point, ingen positiv farve; 1 point, 20% positiv farvning; 2 point, 21-50% positiv farvning; 3 point, 51-75% positiv farvning; og 4 point, 75% positiv farvning. Dette præsenteres i Panel B.

Udbredelsen af ​​HBD exon mutationer i kolon kræftpatienter

For at undersøge sammenslutning af HBD mutationer og deres lavere udtryk hos patienter med tyktarmskræft, exon sekventering for alle HBDS blev analyseret.

de novo

mutation på HBDS er skønnet i tabel 2, for hBD-1; tre mutationer blev påvist i exon 1 (to i 5’UTR region, før den translaterede sekvens og en i promotoren). Disse mutationer påvirker ikke proteinstrukturen, men kan påvirke ekspressionen og stabiliteten af ​​mRNA. To andre insertionsmutationer blev påvist i den translaterede region af exon 2, der førte til et umodent protein. Vi fandt også fem mutationer i 3′-utranslaterede region (3’UTR). 3’UTR vides at indeholde regulatoriske elementer, der er væsentlige for den korrekte ekspression af flere gener. blev påvist to typer mutationer: 8 (80%) var insertioner og 2 (20%) var overgange. Som angivet i tabel 2, kan den samme patient indeholde en eller flere mutationer i hBD1 regionen (eksempel T17 = tyktarmskræft patient nummer 17 havde 3 forskellige mutationer af hBD-1-genet). Overgangen mutation i 3’UTR af hBD-1-genet er ikke forbundet med tyktarmskræft, men er i stedet knyttet til Saudi befolkning, da det blev fundet i alle normale og cancer deltagere undtagen i ét tilfælde (T4).

i hBD-2, blev der påvist fire samlede mutationer i tyktarmskræft væv, men ikke i normale væv: tre i promoteren (en overgang mutation og to indsættelse mutationer), ingen mutationer i de oversatte sekvenser for exon 1 og exon 2, og to overgang mutationer i 3’UTR-regionen (en overgang i 3’UTR er ikke forbundet med tyktarmskræft, men med den Saudi befolkning). I hBD-2, blev påvist tre typer mutationer: 1 (20%) var en transversion, 2 (20%) var en insertion og 3 (60%) var overgang mutationer. Alle mutationer detekteret i hBD-2 har nogen konsekvens for proteinstrukturen, men kan påvirke hBD-2-ekspression og gen stabilitet. I hBD-3, alle mutationer (100%) påviste var insertionsmutationer (tabel 2): ​​En insertion blev påvist i 5’UTR region blev en insertion fundet i den translaterede sekvens af exon 1, inducere en fuldstændig sekvens ændring begyndende ved rest 4, samt tre andre mutationer i den translaterede region af exon 2 (et af disse insertioner var nær stopkodonet), og tre insertioner blev påvist i 3’UTR region af hBD-3-genet. Insertioner 7 og 8 var specifikke for Saudi befolkning og var ikke forbundet med coloncancer; alle tumorer og alle normale væv præsenterede disse mutationer (tabel 2). I hBD-4 blev detekteret tre samlede mutationer: en i 5’UTR der ikke påvirkede hBD-4-protein struktur og to i exon 2, der genererer en ufuldstændig sekvens, med komplet sekvens ændring begyndende ved rest 22 og 56. To blev påvist typer mutationer i hBD-4: 1 (30%) var en overgang og 2 (60%) var insertioner (tabel 2). Der blev imidlertid ikke methylering i nogen HBDS promotorer opdaget på grund af det begrænsede antal CpG-øer i disse regioner.

Struktur-Function Analysis

Vi har undersøgt genproduktet af hver exon påvirket af en rammeskiftsmutation som følge af de observerede nukleotidinsertioner. Den resulterende sekvens oversættelser for hvert hBD med berørte exon produkter er vist i fig 3 og 4. De to insertioner på exon 2 i hBD-1, som angivet i tabel 2, forårsager læserammeforskydning mutationer efter peptidet signalsekvensen (Fig 3A) . Derfor kan ingen modne hBD1 protein syntetiseres. Ingen insertion blev fundet på exon 2 på det humane hBD-2-genet (fig 3B og 4B). Fem insertioner blev fundet på hBD-3-genet i tyktarmskræft. Insertion 1 medfører en rammeskiftsmutation fra rest 3 i peptidet signalsekvensen, uden modne hBD-3-syntese (figur 3C). Indsættelse 2 forårsager en ramme-shift mutation påvirker 5 af 6 C-terminale rester, C63 → L, R64 → P, R65 → K og K66 → E (fig 3C). Derudover er et indsat isoleucin fundet i sekvensen af ​​det muterede HDB-3 ved den C-terminale ende (figur 3C). At evaluere, konsekvensen af ​​mutationen på strukturen af ​​hBD-3, vi bygget en hBD-3 molekylær model med mutationerne påvirker den C-terminale ende. Fig 4C og 4D illustrerer positionerne af mutationerne i en tredimensional model af hBD-3 sammenlignet med vildtype-proteinet. Som vist i fig 4C og 4D, i cancervæv, er mutant 2 mangler den tredje disulfidbinding Cys63-Cys45 grundet Cys63 → Leu mutation. Vi forudser, at denne mutant vil have en mindre stabil struktur end den for vildtype-proteinet. S3-tabellen angiver virkningerne af de andre mutationer. Vi har beregnet forudsigelser af protein stabilitet på den molekylære struktur af hBD-3 ved hjælp af både den popmusik [31] og CUPSAT [32] programmer. Fig 3C og Fig 4C og 4D viser de observerede rammeskiftsmutation typer og de tilsvarende stabiliserende /destabiliserende virkninger på hBD-3 struktur. Mutationer Cys63 → Leu og ARG64 → Pro påvirke aminosyrer, der er begravet i strukturen og blev bestemt til at være energisk destabiliserende, hvilket tyder på en reduktion af protein stabilitet. Mutationer Arg66 → Lys og Lys67 → Pro påvirke opløsningsmiddel eksponerede rester og blev bestemt til at være energisk stabiliserende (tabel 3). Indsættelse 3 på exon 2 producerede Lys67 → Glu og den ekstra rest I68, som ikke har nogen effekt på strukturen stabilitet. Indsættelse 4-2 ville producere et protein med en ekstra C-terminal leucin (fig 3C).

Mutationer er fremhævet med rødt for hver HBDS gen. Vejviser

Vedrørende hBD-4 kan indsættelse 1 forårsage frame-shift-mutationer startende to rester efter signalpeptidsekvensen, hvilket resulterer i inhibering af modent hBD-4 proteinsyntese. Indsættelse 2 introducerer en ramme-shift mutation startende fra rest 55-63, der producerer en afkortet hBD-4 mutant protein

Diskussion

Tyktarmskræft er en betydelig risiko for folkesundheden; Det har vist sig at være den anden mest almindelige malignitet i Saudi befolkning [33] og blev andenplads i kræft dødelighed i USA [34]. Mange genetiske og epigenetiske mekanismer er blevet bestemt til at bidrage til tyktarmskræft, herunder CpG hypermethyleringsassocierede, ikke-kodende RNA ændringer, somatiske mutationer og lysin acetylering af histoner [35]. Meget få undersøgelser har fokuseret på de epigenetiske modifikationer er ansvarlige for udviklingen af ​​denne sygdom. I den aktuelle undersøgelse, viste vi for første gang en klar sammenhæng mellem hBD udtryk /produktion og tyktarmskræft. Vores data viste en signifikant reduktion af HBDS i cancervæv sammenlignet med normale væv. Disse data er positive over dem, der tidligere rapporteret med hBD-1I nyre- eller prostatakræft [36-38], og også i mundtlig planocellulært karcinom (OSCC) [39,40]. Interessant nok blev rapporteret tilsvarende data med hBD-2, der viser, at hBD-2-mRNA og proteinekspression blev signifikant reduceret i spytkirtel kræft [41]. Andre undersøgelser ved hjælp af forskellige cancer cellelinjer har også vist, at hBD-2 kan styre cellevækst via anholdelsen af ​​G1 /S overgang og aktivering af pRB i maligne epitelceller [42]. hBD-3 vides at undertrykke cancer cellemigrering [43]. I oral planocellulært karcinom, human beta-defensin 1, 2 og 3 udviser modsatte virkninger på celleproliferation. Derfor kunne hBD-1 defineres som et tumorsuppressorgen, mens hBD-2 og -3 kunne være proto-onkogener [44].

forventes deregulering af genekspression til at påvirke 1-3% af transkriptomet [45], herunder medfødte immunitet gener, hvis udtryk er overvejende nedreguleret i cancer væv. DNA methylering af CpG-rige promotorregioner er ved at vinde anerkendelse som en vigtig mekanisme i inaktivering af de samme gener, der er involveret som medfødte immunitet og tumor suppressor gener i kræftceller [46]. En anden mekanisme til gen-inaktivering er somatiske mutationer. Theses mutationer bidrager til dannelse cancer. Vores hypotese var, at cancervæv nedregulering af hBD genekspression i colon kan skyldes tilstedeværelsen af ​​epigenetiske ændringer, især mutationer i HBD exoner. I stedet var der ingen detekterbar methylering i alle HBDS promotorer af normale colon væv og cancer tyktarmskræft (data ikke vist). Dette kan skyldes det reducerede antal CpG-øer i HBD promotorer. Vi har bekræftet, at patienter med en ramme-shift mutation, den HBDS protein var helt fraværende. Den stigende interesse for beta defensiner er støt øge vores viden om forskellige aspekter af deres gen placering og ekspressionsmønstre og transkriptionsfaktorer involveret i deres regulering. HBD genomiske struktur består af to exoner og et intron. Den første exon koder for signalpeptidet, og det andet koder for et modent peptid indledes med en kort anionisk propeptid. Ud over at have tilsvarende proteinfoldning og struktur, strukturer hBD-1, -2, og -3 også har afsløret, at hvert protein er stabiliseret af tre disulfidbroer mellem konserverede cysteiner. I denne undersøgelse mange nye mutationer, generelt insertioner, blev påvist i forskellige exoner (1/2). Disse mutationer bidrager til væsentlige ændringer i protein struktur HBDS (dvs. hBD-1, hBD-3 og hBD-4). hBD-1 mutationer og mutation 1 af hBD-3 er den mest skadelige, fordi de fører til trunkerede pre-proteiner uden forudsagt modent hBD-1 proteinsyntese. hBD-3-mutationen 2 proteinet forstyrre grund af fraværet af en disulfidbro forårsaget af udskiftningen af ​​Cys63 → Leu. Endvidere i samme mutant, introducerer Lys67 → Glu substitution en negativt ladet, sur rest i en positivt ladet, hydrofob C-terminal del. Da det blev bestemt, at aggregering af positive ladninger på den C-terminale del er vigtig for antimikrobiel aktivitet [47], er indførelsen af ​​en negativt ladet rest forudsagt at påvirke proteinfunktion. Begge hBD-4 mutanter forventes at have nogen funktionel peptid på grund af ændringer i proteinsekvensen. Ingen struktur forudsigelse kunne udføres for denne mutant fordi dets struktur ikke er tilgængelig. De andre mutationer findes i hBD promotor-regionen forventes at påvirke ekspressionen /stabilitet af de regulatoriske regioner (5’UTR og 3’UTR) i colon cancer væv, hvilket forklarer, hvorfor udtryk for disse HBDS blev nedsat i tyktarmskræft væv sammenlignet med normale væv. blev påvist adskillige andre mutationer i intronerne for alle HBDS, som enten eksisterede primært i alle væv i Saudi befolkning (normal og cancer) eller blev kun fundet i væv fra patienter med coloncancer (data ikke vist). Disse Intron mutationer kan have en mulig rolle i tyktarmskræft, og dette fund kræver yderligere undersøgelser. Fordi HBDS spille en aktiv rolle i det medfødte immunsystem, kan tilstedeværelsen af ​​exon mutationer i HBDS føre til dysregulering af medfødte immunitet og efterfølgende hæmmer immunforsvaret overvågning mod udvikling tyktarmskræft.

Materialer og Metoder

Generelle reagenser

RNA stigen blev opnået fra Ambion /Life-teknologier (Burlington, ON, Canada). DNA /RNA kits var fra Qiagen (Hilden, Tyskland). Primere blev opnået fra Life technologies /Invitrogen (Burlington, ON, Canada). CDNA høj kapacitet revers transkription kit var fra Applied Biosystems (Warrington, USA). SYBR Green blev opnået fra Bio-Rad (Mississauga, ON, Canada). HBD antistoffer blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA, U.S.A.). hBD-1 (N-20) er anti-kanin IgG i N-terminalen, hBD-2 (C-17) er anti-gede-IgG for N-terminalen. hBD-3 (FL-67) er anti-kanin IgG i N-terminalen. hBD-4 (FL-72) er anti-kanin IgG i N-terminalen. Mega BACE kit til sekventering blev opnået fra GE Healthcare Life Science (Buckinghamshire, UK), og EpiTect Bisulfite kit til DNA methylering blev opnået fra Qiagen (Toronto, Canada).

Patient prøver

prøver blev indsamlet fra 40 patienter diagnosticeret til at have tyktarmskræft (24 hanner og 16 hunner, mellem 45 og 75 år, med et gennemsnit på 60 ± 16,56 år for mænd og 55 ± 13,74 år for kvinder og 40 tilsvarende alder normale kontroller med ingen kræft. undersøgelsen blev godkendt af Institutional Review Board fra den etiske komité på King Khalid Universitetshospital i Riyadh, KSA nummer 12/3352 /IRB. skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle deltagere.

Normalt væv i den fjerne margen til tumoren blev opsamlet på tidspunktet for endoskopi. diagnosen kræft var baseret på standard kliniske, endoskopisk, radiologiske og histologiske kriterier. klinisk og demografiske karakteristika blev registreret, herunder alder ved diagnose, køn, familiehistorie, rygning vaner, sygdom adfærd, sygdom placering og behovet for kirurgi (tabel 1). Vævsprøverne blev anvendt til RNA ekstraktion, immunhistokemi, og genomisk DNA ekstraktioner.

Vævsprøver der skal anvendes til RNA-analyse blev straks nedsænket i RNA senere løsning (Ambion, Courtabeuf, Frankrig).

RNA-isolering, revers transkription og genekspression ved real-time RT-PCR

Totalt væv RNA blev ekstraheret under anvendelse af DNA /RNA Mini kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Den koncentration, renhed og kvalitet af den isolerede RNA blev alle bestemt ved anvendelse af Agilent 2100 Bio-analysesystemer og Agilent Lille RNA-analyse kit ifølge instruktionerne fra producenten (Agilent teknologier, Waldbronn, Tyskland).

Det RNA (1 ug af hver prøve) blev revers transkriberet til cDNA ved hjælp af en høj kapacitet cDNA revers transkription kit (Applied Biosystems, Warrington, USA). Betingelserne for fremstilling af cDNA templates til PCR-analyse var 10 minutter ved 25 ° C, 2 timer ved 37 ° C, og 5 minutter ved 85 ° C. Kvantitativ PCR (qPCR) blev udført som tidligere beskrevet [48-50]. Mængderne af de mRNA-transkripter blev målt ved anvendelse af Applied Biosystems 7500 Fast real-time PCR detection system. Reaktioner blev udført ved anvendelse af en PCR Sybr Green Supermix fra Applied Biosystems. Primere blev tilsat til reaktionsblandingen ved en slutkoncentration på 250 nM. Fem mikroliter af hver cDNA prøve blev tilsat til en 20-pi PCR blanding indeholdende 12,5 pi SYBR Green Supermix og 0,5 pi specifikke primere (HBDS eller GAPDH (S1 tabel)) og 7 pi RNase- /DNase-frit vand. Hver reaktion blev udført i en 7500 hurtig real time PCR Thermal Cycler. Termocyklusbetingelserne for HBDS blev etableret som 5 minutter ved 95 ° C efterfulgt af 36 cykler af 15 sekunder ved 95 ° C, 30 sekunder ved 63 ° C (bortset HBD3 ved 52 ° C) og 30 sekunder ved 72 ° C, med hver reaktion udføres in triplo. Specificiteten af ​​hvert primerpar blev verificeret ved tilstedeværelsen af ​​en top enkelt smeltetemperatur. GAPDH produceret ensartede ekspressionsniveauer varierende med mindre end 0,5 CT’er mellem prøve betingelser og blev derfor anvendt som reference gen til denne undersøgelse. De amplificerede produkter blev kørt på en agarosegel for at bekræfte, at der ikke var nogen falske produkter amplificeret i cyklusserne. Resultaterne blev analyseret ved hjælp af 2

-ΔΔCt (Livak) relativ udtryk metode.

Udarbejdelse af biopsier til immunhistokemi

Paraffin-indlejrede blokke af tyktarmskræft væv og normal colon væv prøver blev skåret i 3-um-tykke snit. Snittene blev monteret på saltvand-coatede objektglas og inkuberet i 15 til 20 minutter i en varmluftsovn ved 60 ° C. Vævssnit blev deparaffineret med EZ Prep (Ventana, Arizona, USA) ved 75 ° C, varme forbehandlet i Cell Conditioning 1 (CC1, Ventana, Arizona, USA) under anvendelse af en “standard celle conditioning” protokol for antigen-genvinding ved 100 ° C, og derefter inkuberet med en dråbe inhibitor opløsning i fire minutter ved 37 ° C og efterfølgende vasket. Objektglassene blev inkuberet i 32 minutter ved 37 ° C med et af følgende antistoffer (fortyndet 1: 100): anti-human-hBD-1, anti-human-hBD-2, anti-human-hBD-3 eller anti- human-hBD-4 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Derefter blev det sekundære antistof UltraView universel HRP multimer tilsat. Den immunolocalizedhBD-1, hBD-2 blev hBD-3 og hBD-4-proteiner visualiseres ved anvendelse af en kobber-forstærket DAB reaktion. Negative blindprøvekontrol blev fremstillet under farvningen, hvori det første antistof blev udeladt og erstattet med PBS. Objektglassene blev modfarvet med hematoxylin II og Bluing Reagent (Ventana, Arizona, USA) i 30 minutter ved 4 ° C, og derefter blev flydende dækglas (LCS) tilsat som en barriere mellem de vandige reagenser og luften til forhindre fordampning, hvorved der tilvejebringes prøve stabilitet. Derefter blev prøverne til montering i DPX dehydreret ved sekventielle vaskninger i graduerede alkoholer: 70% ethanol, 96% ethanol og absolut ethanol og to ændringer i xylen. Efter at vi har tilføjet en lille dråbe DPX til modellen som beløber medier. De immuno-farvede sektioner blev analyseret af et Olympus BX51 lysmikroskop og DP72 Olympus digitalkamera (forstørrelse 200X og 400X) (Olympus America Inc, Center Valley, PA, USA).

Scores fik i henhold til niveauet og rækken af ​​farven som følger: 0 point, ingen positiv farve; 1 point, 20% positiv farvning; 2 point, 21-50% positiv farvning; 3 point, 51-75% positiv farvning; og 4 point, . 75% positiv farvning

bisulfitbehandling

For at kontrollere status methylering af promotor-regionen bisulfitbehandling og nyttiggørelse af prøver blev udført med EpiTect Bisulfite kit (QIAGEN) ved at følge producentens instruktioner. Kort beskrevet blev 2 ug DNA i 20 volumen pi anvendt til hver reaktion og blandet med 85 pi bisulfit mix og 35 pi DNA beskytte puffer. Omdannelse med bisulfit blev udført på en termocykler som følger: 99 ° C i 5 min, 60 ° C i 25 min, 99 ° C i 5 min, 60 ° C i 85 min, 99 ° C i 5 min, 60 ° C i 175 min og 20 ° C på ubestemt tid. Det bisulfit-behandlede DNA blev udvundet ved EpiTect spinkolonne og efterfølgende sekventeret for at bekræfte effektiviteten af ​​omdannelse med bisulfit. Det eluerede genomisk DNA blev anvendt til promotorregion amplifikation og sekventering.

Polymerasekædereaktion og sekventering

Genomisk DNA blev ekstraheret fra alle prøver under anvendelse af et DNA-kit fra Qiagen (Hilden, Tyskland). DNA-koncentrationen af ​​hver prøve blev målt ved anvendelse af en NanoVue ultraviolet spektrofotometer. Alle exonerne af HBDS (1, 2, 3 og 4) blev amplificeret under anvendelse af polymerasekædereaktion (PCR) primere (S2 Table). Fremad og bagud exon primerpar anvendt i PCR reaktioner er beskrevet i S2 tabel. PCR-blandingen indeholdt 50 ng DNA, 5 pmol /l hver primer, 2.5nmol /ml af hver dNTP, og 1,25 U Taq DNA-polymerase i 20 pi buffer med 0,04 mmol /l Mg2 +. Efter en indledende denatureringstrin ved 94 ° C i 5 minutter blev 35 PCR-cykler udføres, som omfattede 45 s for denaturering ved 94 ° C, 30 s for annealing ved 60 ° C og 45 s for forlængelse ved 68 ° C. PCR-produkterne blev analyseret ved 1% agarosegelelektroforese. Efter observere klare og præcist mellemstore bands, amplifikationsprodukterne blev derefter renset og direkte sekventeret på en Sanger påvisning sekvens-system (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA, USA).

Strukturel analyse af mutationerne

3D-struktur af de menneskelige beta defensinerne (Protein data Bank indgang 1KJ6) [51] blev anvendt til at estimere effekten af ​​udvalgte gen ramme-shift mutationer på strukturen af ​​enzymet.