PLoS ONE: Suppressor af Cytokine signalering (SOCs) Gener Er Lyddæmpet ved DNA Hypermethylering og histondeacetylering og regulere Reaktion på strålebehandling af livmoderhalskræft celler

Abstrakt

Suppressor af cytokin signalering (SOCS) familie er en vigtig negativ regulator af cytokin signalering og deregulering af SOCS har været involveret i mange typer af kræft. Alle livmoderhalskræft testede cellelinjer udviste lavere udtryk for SOCS1, SOCS3, og SOCS5 end normale væv eller cellelinier. Den immunhistokemi resultat for SOCS proteiner i menneskets cervikal væv bekræftede også, at normalt væv udtrykte højere SOCS proteiner end nabolandet tumor. Svarende til reguleringen af ​​SOCS i andre typer af kræft, DNA methylering bidrog til SOCS1 nedregulering i CaSki, ME-180, og HeLa-celler. Imidlertid blev ekspressionen af ​​SOCS3 eller SOCS5 ikke inddrives ved hæmning af DNA-methylering. Histondeacetylering kan være en anden reguleringsmekanisme involveret i SOCS1 og SOCS3 udtryk, dog SOCS5 udtryk hverken var påvirket af DNA methylering eller histondeacetylering. Ektopisk udtryk for SOCS1 eller SOCS3 tillægges radioresistance til HeLa-celler, som underforståede SOCS signalering regulerer reaktion på stråling i livmoderhalskræft. I denne undersøgelse har vi vist, at SOCS udtryk undertrykt af, dels epigenetisk og ændret SOCS1 og SOCS3 udtryk kan bidrage til Radiosensitivitet fænotype i livmoderhalskræft

Henvisning:. Kim MH, Kim MS, Kim W, Kang MA, Cacalano NA, Kang SB, et al. (2015) Suppressor af Cytokine signalering (SOCs) Gener Er Lyddæmpet ved DNA Hypermethylering og histondeacetylering og regulere Reaktion på strålebehandling i Livmoderhalskræft kræftceller. PLoS ONE 10 (4): e0123133. doi: 10,1371 /journal.pone.0123133

Academic Redaktør: Rodney John Scott, University of Newcastle, AUSTRALIEN

Modtaget: 15 juli, 2014 Accepteret: 22 Februar 2015; Udgivet: April 7, 2015

Copyright: © 2015 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Data kan ikke være stilles til rådighed på grund af etiske begrænsninger. Data er tilgængelige fra KIRAMS Institutionel Data Access /etiske komité for forskere, der opfylder kriterierne for adgang til fortrolige data

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Nuclear R D Program for Ministeriet for Videnskab, IKT og fremtidige planlægning, Republikken Korea (KIRAMS RTR: 504.580-2012). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

medlemmer af suppressor af cytokin signalering (SOCS) familie af proteiner spiller en afgørende rolle i den negative regulering af cytokinsignaltransduktion. Disse proteiner virker på en negativ feedback loop, inhibering af cytokin-aktiverede Janus-kinase /signaltransducere og aktivatorer af transkription (JAK /STAT) signalvejen til at modulere cellulære responser [1]. SOCS1 synes at have tumorsuppressoraktivitet [2] og restaurering af SOCS1 genekspression forårsager væksthæmning og induktion af apoptose i HCC-celler [3]. For nylig viste Sobti et al tab af SOCS1 udtryk gennem promotor methylering i mere end 60% af tilfældene af livmoderhalskræft og foreslog betydningen af ​​SOCS1 nedregulering i HPV-induceret cervikal carcinogenese [4]. SOCS3 er involveret i udviklingen og progressionen af ​​flere maligniteter, og der er tegn på, at SOCS3 har forskellige funktioner afhængigt af tumor oprindelse. I human lunge [5], hepatocellulært [6], og hoved- og halskræft [7], er SOCS3 tavshed af hypermethylering, hvilket giver en vækst fordel for cancerceller. I modsætning hertil SOCS3 kan påvises i brystkræft [8], og SOCS3 udtryk øges under udviklingen og progressionen af ​​prostatacancer [9].

Det er almindeligt anerkendt, at livmoderhalskræft er radiosensitive og behandlingsresultater er stadig lovende selv efter tumoren er diagnosticeret for sent til behandling med radikal hysterektomi. I Korea, livmoderhalskræft er et stort sundhedsproblem for kvinder, der tegner sig for 9,8% af nye tilfælde kvindelige kræftpatienter. Selvom incidens og dødelighed har været faldende, er forekomsten af ​​livmoderhalskræft hos ældre stigende [10]. Men de fleste af behandlingen fejl i avanceret livmoderhalskræft cancersoriginate fra udvikling af radioresistance, et problem, som vi endnu ikke har overvundet. Interessant, SOCS1 sensibiliserer glioblastom celler for stråling, mens SOCS3 forbedrer tumorcelleoverlevelse og radioresistance [11]. Zhou et al. foreslog, at målretning SOCS ekspression eller funktion i glioblastomceller kan være en nyttig strategi til at sensibilisere tumorceller for ioniserende stråling. Mens DNA beskadigelse respons pathway er kritisk for styring genotoksisk stress, resultatet af reaktionen er meget afhængig af den cellulære kontekst. Det er klart, andre signalveje aktiveres i cellen på tidspunktet for DNA-skader kan modulere svaret og ændre outputtet af DNA beskadigelse-induceret signaltransduktion [12].

I den foreliggende undersøgelse har vi analyseret SOCS1, SOCS3, og SOCS5 genekspression i et panel af cellelinier, der repræsenterer primære,

de novo

human cervikal cancersthat er radiosensitive. Vi har vist, at SOCS1, SOCS3, og SOCS5 ekspression undertrykkes delvist epigenetisk ved DNA hypermethylering og histondeacetylering. Vi viser, at ændrede SOCS1 og SOCS3 udtryk kan bidrage til Radiosensitivitet fænotype i livmoderhalskræft.

Materialer og metoder

Cell kultur, normal cervix væv og hæmmer behandling

Den menneskelige cervical carcinoma cellelinier CaSki, HeLa, ME-180, og SiHa blev opnået fra den koreanske cellelinie Bank (KCLB, Seoul, Korea). Normale human fibroblast cellelinjer CCD-18Lu, CCD-18Co, og WI-38 blev købt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). CaSki og ME-180-cellelinjer blev opretholdt i RPMI-1640 (PAA Laboratories, Pasching, Østrig) og HeLa, SiHa og normale fibroblastceller cellelinier blev opretholdt i DMEM (PAA Laboratories), suppleret med 10% føtalt bovint serum ( Lonza, Walkersville, MD, USA) og 100 enheder penicillin og streptomycin (PAA Laboratories). Alle celler blev dyrket i en befugtet inkubator med 5% CO

2 ved 37 ° C. For inhibering af DNA methyltransferase blev celler podet med en tæthed på 2-5 x 10

5/100 mm skåle og behandlet med 5-azacytidin (5-azaC) ved 10 uM i 72 timer. Medier og 5-azaC blev erstattet hver 24 timer. For inhibering af histon deacetylase blev celler behandlet med Trichostatin A (TSA) ved 100 eller 200 nM i 16 timer. Begge inhibitorer blev indkøbt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MI, USA). En normal cervix væv blev opnået fra en patient, som undergik hysterektomi for myoma uteri. Vi opnåede en skriftligt informeret samtykke fra en patient før operation. Den institutionelle Review Board godkendte godkendelsesproceduren og forsøgsprotokollen (K-1103-003-016) på Sydkorea Institut for Radiologisk og Medicinsk Videnskab.

RealtimeqRT-PCR

Total RNA fra celler og væv blev isoleret ved hjælp af Hybrid-R Total RNA Purification Kit (GeneAll, Seoul, Korea). I alt 1 ug totalt RNA revers transkriberet under anvendelse af PrimeScript RT Reagent Kit (Takara Bio Inc., Japan) med 25 pmol oligo-dT primer og 50 pmol af tilfældig hexamer. cDNA blev fortyndet 1/10 med EZ fortyndingsbuffer (Takara Bio Inc.), og 2 pi blev anvendt som template i en 20 pi PCR-reaktion. Kvantitativ PCR blev udført ved anvendelse af Premix Ex Taq (Takara Bio Inc.) i en CFX-96 thermocycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Følgende primere blev anvendt til PCR: cyclophilin A (CypA) (sense, ACG GCG AGC CCT TGG antisense, TTT CTG CTG TCT TTG GGA CCT), SOCS1 (sense, TTT TCG CCC TTA GCG TGA A antisense, CAT CCA GGT GAA AGC GGC), SOCS3 (forstand, GCT CCA AAA GCG AGT ACC AGC, antisense, AGT AGA ATC CGC TCT FTT GCA G), og SOCS5 (forstand, AAA AGT TGG ATC TGT TCC TAT GCC, antisense, ACT ATT ATC TGA CTT GTT TG). Fluorogene prober (6-carboxyfluorescein) var: CypA, CGC GTC TCC TTT GAG CTG TTT GCA; SOCS1, CCT CGG GAC CCA CGA GCA TCC; SOCS3, TTG CGC ACG GCG TTC ACC AC; SOCS5, AGG ATG ATT TTG TGA ACC GTG AAG TAC GTG A. DNMT1 genekspression blev målt ved hjælp af SYBR premix Ex Taq II kit (Takara Bio Inc.) med primere (sans, CTT CTT CAG CAC AAC CGT CA, antisense, GAA GAG CCG GTA GGT GTC AG). Den relative kvantificering af genekspression blev beregnet med ddC (t) fremgangsmåde, hvor CypA mRNA blev anvendt til normalisering. PCR-programmet var følgende: efter en indledende forinkubationstrin ved 95 ° C i 3 minutter, var der 45 cykler, hver bestående af 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 60 s. Den sidste forstærkning cyklus blev efterfulgt af en smelte kurve analyse for at sikre om specificiteten af ​​QRT-PCR.

Immunhistokemi

Alle vævsprøver blev opnået med fuld etisk godkendelse fra KIRAMS institutionelle gennemgang board (IRB nr K-1103-003-016). Immunohistokemisk farvning for SOCS1, SOCS3, og SOCS5 blev udført ved en automatiseret immunhistokemisk farvningsværktøjet (Autostainer 480, Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA) på formalin-fikserede paraffin-indlejrede vævssnit af pladecellecarcinomer opnået fra cervix uteri. Snit blev afparaffiniseret med xylen i 15 minutter og forbehandlet i en mikrobølgeovn under anvendelse 0,01 M citratpuffer (pH 6,0) i 30 minutter. Snit blev inkuberet med primære antistoffer rettet mod SOCS1 (01:25, ab62584, Abcam, Cambridge, UK), SOCS3 (1: 100, ab16030, Abcam) og SOCS5 (1: 100, sc-100.858, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz , CA, USA) i 60 minutter ved stuetemperatur og påvist under anvendelse UltraVision LP Detection System HRP Polymer DAB Plus Chromogen (Thermo Fisher Scientific).

Methylering-specifik PCR (MSP)

MSP blev udført for at undersøge status for methylering af promotoren regioner i SOCS1, SOCS3, og SOCS5 gener . Efter behandling med bisulfit til at modificere DNA’et, blev PCR udført for at skelne methyleret fra methyleret DNA som beskrevet af Herman et al [13]. Genomisk DNA blev ekstraheret fra cellelinjer under anvendelse Exgene Cell SV Kit (GeneAll, Korea) og bisulfit modifikation af genomisk DNA blev udført under anvendelse af EZ DNA-methylering Kit (Zymo Research, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Det bisulfit-behandlede DNA blev amplificeret med enten en methylering-specifikke primere eller primere specifikke for umethylerede sekvens. Kort fortalt, en 20 pi reaktionsvolumen indeholdende 25 ng bisulfit modificerede DNA, 1 × PCR-buffer, 1,5 mM MgCl

2, 0,25 mM dNTP’er, 0,5 uM primer mix og 1 enhed Ex-Taq Hot Start enzym (Takara BioInc) blev anvendes. PCR-produkterne blev elektroforesebehandlet på en 2% agarosegel, farvet med RedSafe Nucleic Acid farveopløsning (Intron, Korea) og visualiseret under UV-belysning. Primer lister og PCR-betingelser for MFP er opsummeret i S1 tabel.

bisulfit sekventering

behandlet med bisulfit genomisk DNA blev amplificeret af primerne anført i S2 tabel. PCR-produkterne blev klonet ind i Topo TA kloning kittet (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) eller T-stumpe PCR kloning Kit (Solgent, Daejeon, Korea). Fem tilfældigt valgte kloner blev sekventeret og justeret ved hjælp QUMA (Kvantificering værktøj til Methylering Analysis).

Gene silencing af shRNA

De lentivirale shRNA ekspressionsplasmider målrettet DNMT1 blev genereret ved at klone oligonukleotider i pLKO. 1 puro vektor. Sekvenserne af hårnåle målretning DNMT1 er: GCCGAATACATTCTGATGGATCTCGAGATCCATCAGAATGTATTCGGC (TRCN0000021890) og GCCCAATGAGACTGACATCAACTCGAGTTGATGTCAGTCTCATTGGGC (TRCN0000021891). Kontrollen scrambled shRNA udtrykkende plasmid blev opnået fra Addgene med følgende hårnål sekvens: CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG. Til emballering, blev pCMV-dR8.2 dvpr og pCMV-VSVG anvendes, som begge blev indkøbt fra Addgene (Cambridge, MA, USA). Produktionen af ​​virale partikler og transduktion af målceller blev gennemført efter pLKO.1 protokol fra Addgene. Supernatanter fra 293T-celler transficeret med den shRNA og pakkevektorer blev opsamlet 48 og 72 timer efter transfektion efterfulgt af koncentrering af virusset. Koncentreret virus blev anvendt til infektioner i nærvær af 8 ug /ml polybren. En dag efter infektion, puromycin (1 ug /ml) blev anvendt i 4 dage for at vælge transducerede celler, som blev høstet for realtime PCR-analyse.

Kloning af SOCS overudtrykker retrovirale konstrukter

konstruktioner til overudtrykker SOCS1, SOCS3, og SOCS5 blev fremstillet ved kloning af SOCS1, SOCS3, og SOCS5 ORF i pLNCX2 retroviral vektor (Clontech). De SOCS1 og SOCS3 gener af mus oprindelse blev venligst stillet til rådighed fra Dr. Cacalano NA (UCLA, Californien).

Bam

HI fragment indeholdende SOCS1 cDNA mærket med Myc ved C-terminalen eller SOCS3 cDNA mærket med flag på C-terminalen blev subklonet i

Bgl

II site af pLNCX2. Kloner med korrekt orientering blev screenet med

Eco

RI fordøjelse og derefter bekræftet ved sekventering. Den SOCS5 genet af museoprindelse blev købt fra Openbiosystems (MMM1013-9202191) og amplificeret med sense (5′-AAACTCAGATCTACCATGGATGGATAAAGTGGGGAAAATG-3 ‘) og antisense (5′-AGATATGGATCCCTCGAGCTACTACTTATCGTCATCATCTTTATAATCGATCTTTGCCTTGACTGGTTCTC-3’) primere. En

Bgl

II og

Sal

jeg fragment indeholdende SOCS5 med FLAG ved C-terminalen blev subklonet i

Bgl

II og

Xho

I stedet for pLNCX2 retroviral vektor.

virus produktion og etablere stabile celler

SOCS overekspression retrovirusvektorer og emballage plasmider, pCMV-Gag-Pol og pCMV-VSVG blev cotransficeret ind i 293T celle. Supernatanter fra 293T celler blev opsamlet 48 og 72 timer efter transfektion efterfulgt af koncentration af retrovirus og anvendt til at inficere HeLa-celler i nærvær af 8 ug /ml polybren. En dag efter infektion blev G418 (200 ng /ml) anvendes, indtil stabile kolonier dannet. Kolonierne blev samlet til at kontrollere SOCS overekspression og anvendes til klongenicitetsassayet.

Western blot-analyse

Celler blev lyseret med SDS-prøvebuffer (125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 4% SDS , 15% glycerol og 0,004% bromphenolblåt) og derefter kogt i 10 min. Proteinindhold blev målt med BCA Protein Assay Reagent (Intron). Lige store mængder cellelysat blev separeret ved SDS-polyacrylamidgeler, overført til en nitrocellulosemembran, immunoblottet og påvises ved kemiluminescens under anvendelse af ECL påvisningsreagenser. Anti-myc, anti-actin og peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer blev købt hos Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA, USA) og anti-FLAG-antistof var fra Sigma Chemical Co.

klongenicitetsassayet

klonogen overlevelse blev defineret som cellers evne til at opretholde klonogenisk kapacitet og til at danne kolonier. Kort beskrevet blev celler høstet fra eksponentielle fase kulturer ved trypsinisering, talt og podet for kolonidannelse. På den følgende dag blev gammastråling leveres ved anvendelse af en dual-kilde

137Cs enhed i en dosis på 3,2 Gy /min med en GC-3000 Elan strålerøret (MDS Nordion, Ontario, Canada). Efter 14 dage blev kolonier farvet med 0,4% krystalviolet (Sigma Chemical Co.). Kolonierne blev talt og grupper af 30 celler blev betragtet som kolonier. Udpladningseffektiviteten (PE) repræsenterer procentdelen af ​​celler udsået at vokse ind kolonier under en specifik kultur betingelse for en given cellelinie. Overlevelsen fraktion, udtrykt som en funktion af bestråling, blev beregnet som følger: Survival fraktion = kolonier optalt /(celler podet × PE /100). Vi gentog forsøgene fem gange for at sikre reproducerbarhed.

Statistisk analyse

Data er angivet som middel ± SD. Den parrede Students

t

-test blev udført, og

s

-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

SOCS udtryk profil incervical kræft celler

for at afsløre den mulige rolle SOCS i livmoderhalskræft udvikling og spredning af kræft, udtryk for SOCS1, SOCS3, og SOCS5 blev undersøgt i flere humane livmoderhalskræft cellelinjer, CaSki, HeLa, ME-180, og SiHa. MRNA-niveauet af SOCS1 (Fig 1A), SOCS3 (fig 1B), og SOCS5 (Fig 1C) var signifikant lavere i alle cervicale cancerceller testet end i normalt cervix væv og den normale colon (CCD-18Co) eller lunge fibroblast (CCD -18Lu, WI-38) cellelinjer,

Ekspression af SOCS1 (A), SOCS3 (B), og SOCS5 (C) genet blev undersøgt ved QRT-PCR i normal cervix (N Cx) væv, tre normale fibroblast cellelinjer (CCD-18Co, CCD-18Lu, WI-38) og livmoderhalsen cancer cellelinjer (CaSki, HeLa, ME-180, SiHa). Expression niveau af normale kontrolprøver markeret som åben bar og livmoderhalsen kræftcelle lukket bar. Stjerne (*), statistisk signifikant (

s

0,05)

For at bekræfte, at den lavere ekspression af SOCS1, SOCS3, og SOCS5 i livmoderhalskræft celler er et generelt fænomen. observeret i humane tumorer, blev immunhistokemisk farvning af SoCs proteiner udføres i humant livmoderhalskræft væv og i det omkringliggende normale væv som kontrol (figur 2). Alle tre SOCS proteiner blev farvet mørkere i normal (N) væv sammenlignet med tumor (T) område. Alle disse resultater førte til den konklusion, at SOCS1, SOCS3, og SOCS5 udtryk ishigher i normalt væv end i livmoderhalskræft, og støtter muligheden for, at nedregulering af SOCS kan bidrage til tumorigenese eller vedligeholdelse af livmoderhalskræft.

Expression niveau af SOCS1 (a), SOCS3 (B), og SOCS5 (C) i tumor (T) og tilstødende normal (N) epitelial celle i et bortopereret patientprøve blev sammenlignet.

DNA methylering analyse af SOCS gen promoter

for at bestemme om DNA methylering bidrager til nedregulering af SOCS proteiner i livmoderhalskræft, blev en methylering-specifik PCR (MSP) assay udføres. SOCS1 udtryk var korreleret med differential DNA methylering kun CaSki, HeLa, og ME-180-celler (Fig 3A). Den SOCS1 promotoren i SiHa cellen blev ikke methyleret i denne region, selvom SOCS1 transkription blev nedreguleret i SiHa-celler til en lignende levelas andre cervix cellelinier. I modsætning hertil blev intet DNA methylering påvist i SOCS3 og SOCS5 promotorregion, i det mindste i CpG-beriget region undersøgt i dette forsøg, at alle cervical cancer cellelinjer (Fig 3A).

(A) Methyl -specifik PCR-analyse. Behandlet med bisulfit genomisk DNA blev amplificeret med ikke-methylerede (U) eller methylerede (M) DNA-specifikke primere. (B-D) bisulfit sekventering af SOCS1 (B), SOCS3 (C), og SOCS5 (D). Umethylerede CpG websted i forstærket promotor-regionen var viste som en åben cirkel og methyleret CpG som en lukket kreds.

For at bekræfte MSP resultat, promotoren regioner SOCS1, SOCS3, og SOCS5 gener omfattende CpG øer blev klonet og fem uafhængige kloner blev sekventeret (fig 3B-3D). Umethylerede CpG sites er angivet med en åben cirkel og methylerede bindingssteder for CpG er angivet med en udfyldt cirkel. DNA-methylering blev påvist i SOCS1 genpromotoren i CaSki, HeLa og ME-180-celler, men ikke i SiHa (Fig 3B), der matcher MSP resultat (Fig 3A). I CaSki og HeLa, den methylerede region SOCS1 næsten lig med umethyleret region, mens det i ME-180 celler meste af promotor-regionen blev methyleret. Methyleret CpG steder blev ikke påvist i SOCS3 og SOCS5 promotorer i livmoderhalskræft cellsor normale celler (Fig 3C og 3D), hvilket faldt sammen med MSP eksperimentet (figur 3A).

Hæmning af DNA hypermethylering genskaber SOCS1 udtryk

for at bestemme, om DNA-methylering af SOCS1 promotor bidrager til nedregulering af SOCS1 genekspression

in vivo

, behandling med 5-azaC blev anvendt til at hæmme DNMT1 (fig 4). I CaSki (Fig 4A) og HeLa (Fig 4B), blev SOCS1expression tydeligt forøget efter 5-azaC behandling. SOCS1 ekspression i ME-180 blev let øget ved behandling med DNMT1 hæmmer (fig 4C), muligvis på grund tothe højere methylering af SOCS1 genpromotor i ME-180-celler (Fig 3A og 3B) end i de andre cellelinjer. SOCS3 og SOCS5 udtryk blev ikke påvirket af 5-azaC behandling, støtte den tidligere resultat (figur 3), at DNA methylering er ikke involveret i nedregulering af SOCS3 og SOCS5. Dette resultat blev bekræftet af shRNA-medieret knock-downof DNMT1 (Fig 4D-4F). RNA-interferens (RNAi) er den vej, ad hvilken lille interfererende RNA (siRNA) eller korte hårnål RNA (shRNA) anvendes til at inaktivere ekspression af målgener [14]. SOCS1 ekspression blev forøget med hæmning af DNMT1 mens SOCS3 og SOCS5 udtryk øget lidt. Disse resultater, sammen med MSP og bisulfit sekventering resultater tyder på en mulighed for, at andre reguleringsmekanismer end hypermethylationare vigtigt for at styre SOCS udtryk.

CaSki (A, D), HeLa (B, E), og ME-180 (C, F) blev celler behandlet med 10 pM 5-azacytosin (5-Aza) i 72 timer (AC) eller inficeret med kontrol lentivirus (shSCR) eller lentivirus udtrykker shRNA målretning DNMT1 (shDNMT1) (DF). Knock-down af DNMT1 og SOCS genekspression blev undersøgt med QRT-PCR. Stjerne (*), statistisk signifikant (

s

0,05)

histonacetylering regulerer SOCS1 og SOCS3 genekspression

histondeacetylering er et velkendt. epigenetisk regulering mekanisme, vi testet for en forening med nedregulering af SOCS genekspression. Behandling af Trichostatin A (TSA), en selektiv inhibitor af klasse I og familier II pattedyr histon deacetylase (HDAC) af enzymer, øget SOCS1 genekspression i CaSki, HeLa, og SiHa men ikke mig-180 celler (figur 5A). SOCS3 genekspression blev også udvundet i CaSki og SiHa celler efter TSA behandling (Fig 5B). Imidlertid blev ekspressionen af ​​disse gener ikke påvirket af TSA i WI-38, en normal kontrol lunge fibroblastcellelinie. Disse resultater antyder, SOCS1 og SOCS3 nedjusteres af HDAC i flere cervical cancer celler. Dette er den første rapport, SOCS ekspression påvirkes af ikke blot hypermethylering men også histondeacetylering i faste tumorceller. I modsætning hertil blev SOCS5 genekspression ikke ændres overhovedet ved HDAC-inhibering i WI-38 eller i nogen af ​​de livmoderhalskræft testede celler (Fig 5C). Yderligere undersøgelser er nødvendige for at karakterisere de mekanismer undertrykker SOCS genekspression i livmoderhalskræft.

Normale lunge fibroblastceller (WI-38) og cervical cancer-celler blev behandlet med 0, 100, eller 200 nM TSA i 16 timer og SOCS1 (A), SOCS3 (B), og SOCS5 (C) genekspression blev målt med QRT-PCR. Stjerne (*), statistisk signifikant (

s

0,05).

Overekspression af SOCS1 eller SOCS3 udstyre radioresistance til HeLa-celler

For at undersøge de biologiske virkninger af forøget SOCS genekspression i cervicale cancerceller, blev adskillige HeLa-celler etableret ved infektion med retrovirus overudtrykker SOCS genet. Ekspression af det eksogene SOCS genet i neomycin-resistente HeLa-celler blev bekræftet ved Western blotting (Fig 6A). Der var ingen signifikant forskel observeret i celle proliferation eller levedygtighed mellem mock eller SOCS-overudtrykker HeLa-celler (data ikke vist). Som SOCS1 og SOCS3 har været involveret i reaktion på stråling i glioblastom [11], blev der klonogene assays udført for at vurdere mulige bidrag SOCS genekspression til radioresponsivity. Som vist i figur 6, overekspression af SOCS1 eller SOCS3 gøre HeLa-celler mere resistente over for stråling end kontrolceller (fig 6b). Imidlertid blev radiosensitivitet af HeLa-celler, der overudtrykker SOCS5 ikke ændret.

SOCS1, SOCS3 eller SOCS5 overekspression HeLa-celler blev etableret under anvendelse pLNCX2 retroviral vektor og overekspression blev bekræftet ved Western blot-analyse (A). En klonogene assay blev udført efter udsættelse for den angivne dosis af stråling i SoCs-overudtrykkende celler (B). Værdier er middel ± standardafvigelse for tredobbelte brønde for hver dosis punkt. Stjerne (*), statistisk signifikant (

s

0,05)

Diskussion

SOCS er en stor superfamilie af proteiner, der generelt betragtes som antagonister af cytokin -inducerede Janus-aktiveret kinase-STAT signalering. Dog er SOCS involveret i reguleringen af ​​yderligere signalveje, herunder phosphatidylinositol 3-kinase og ERK MAPK [15]. Undersøgelser vedrørende SOCS og livmoderhalskræft er få i antal. SOCS1may spille en rolle i reguleringen af ​​niveauerne af E7-proteinet af human papillomavirus, og påvirker deres transformerende potentiale [16]. De observerede IFN-γ behandling til HeLa og CaSki cellelinier resulterede i en reduktion af E7-protein. Kamio et al. viste overekspression af SOCS1 reduceret proliferationshastighed i både HeLa og CaSki cellelinjer. De bekræftede også SOCS1 undertrykt DNA-syntesen ved at observere reduceret inkorporering af BrdU [16]. Men i det aspekt af immunresponset, SOCS1 inaktivering forbedret ekspressionsniveauerne af proinflammatoriske cytokiner, såsom interleukiner, TNF-a, IFN-γ resulterer i forøget antigenpræsentation af dendritiske celler [17]. Derfor foreslår vi, at nettoeffekten af ​​SOCS1 undertrykkelse går ugunstig for værterne. Vores resultater tyder også den mulighed, at SoCs proteiner fungerer som tumorsuppressorer. SOCS1, SOCS3, og SOCS5 ekspression var lavere i cervical cancer end omgivende normale væv (figur 2), og mRNA-niveauer af SoCs gener var lavere i cervikale cancercellelinier end i normale cervix væv eller fibroblastcellelinier (Fig 1). Det er tidligere blevet rapporteret, at markant undertrykkelse af transskription af SoCs gener resulterede fra DNA hypermethylering i promotorregionen [6,7,9]. En lang liste af hypermethyleret gener er en fælles kendetegn for alle typer af human cancer. Selv om mange tumorsuppressorgener er bragt til tavshed ved hjælp af DNA methylering under carcinogenese, nedregulering af SOCS3 og SOCS5 var ikke afhængig af DNA hypermethylering (fig 3 og 4). En anden epigenetiske gen silencing mekanisme, histon hypoacetylation, medierer SOCS1 nedregulering i CaSki, HeLa, og SiHa-celler og SOCS3downregulation i CaSki og SiHa-celler (Fig 5). SOCS5 genekspression blev ikke ændret på alle ved inhibering af DNA-methylering eller histonacetylering. Som Gene silencing indebærer ofte en kombination af DNA methylering og kromatin histonacetylering undersøgte vi også kombinationen effekt af 5-Aza og TSA på SOCS1 udtryk i ME-180 celle. Der blev imidlertid ingen signifikant stigning i SOCS1 ekspression observeret (data ikke vist). Epigenetisk regulering af SOCS gener i livmoderhalskræft celler blev sammenfattet i S3 tabel. Det er værd at huske på, at vi analyserede epigenetisk SOCS genregulering kun i fire etablerede livmoderhalsen kræft cellelinjer og yderligere bekræftelse er nødvendig, om denne regel mekanisme gælder for primær livmoderhalsen kræft.

Vores data viser, at ændret udtryk for SOCS1or SOCS3 påvirket stråling respons af cervikale cancerceller. Overekspression af SOCS1 og SOCS3 forbedret overlevelse cellen efter ioniserende stråling (figur 6). SOCS1 er en vigtig aktivator af p53 og DNA beskadigelse respons [18]. Fordi SOCS1 kræver SOCS boksen at danne et kompleks med ATM, v-Abl- eller Pim kinase-medieret phosphorylering potentielt kunne interferere med denne interaktion og blokere p53-aktivering. Derfor fremgår det, at afvigende phosphorylering med onkogene kinaser kan forstyrre tumorsuppressoren aktiviteter SOCS1 med mindst to forskellige mekanismer: (1) phosphoryleret SOCS1 ville ikke være i stand til at inhibere JAK /STAT pathway og til at interagere med ATM og fremme p53 aktivering [18]. (2) SOCS3improves celle survivalin glioblastom [11], men handlede som en chemosensitizer i anaplastisk kræft i skjoldbruskkirtlen [19]. Keratinocyt-specifikke overekspression af SOCS3 førte til forkrøblede sår-margin epitel og augmented den inflammatoriske reaktion af oprullede keratinocytter ved en stigning i kemokin (MIP-2) og inflammatorisk enzym (COX-2 og iNOS) ekspression [20]. COX-2 bidrager til metastaser af livmoderhalskræft ved at fremme autokrine eller parakrin VEGF udtryk på både primære og metastatiske steder [21]. Det er derfor rimeligt at antage, at SOCS3 generelt fungerer som en celle overlevelsesfaktor, undtagen i anaplastisk kræft i skjoldbruskkirtlen. Men SOCS1 handlet som en strålingssensibiliserende i glioblastom celler [11]. Det afbrød omdannelsen af ​​normale cervikale epiteler i neoplastiske celler gennem en E7-protein, som en tumorsuppressor. På den anden side, SOCS1 inhiberede apoptose af ø-transplantater på grund af caspase 3 og apoptose-inducerende faktor veje i bugspytkirtlen hos rotter [22], hvilket indikerer, at, i overensstemmelse med vore data, det fremmer celleoverlevelse.

Wild -type livmoderhalskræft cellelinjer viste undertrykt udtryk for SOCS1, SOCS3, og SOCS5. Både DNA-methylering og histondeacetylering kan bidrage til nedregulering af SOCS 1, 3, 5 gener i cervicale cancerceller. Genvinding af SOCS1 og SOCS3 genekspression reducerede radiosensitivitet af HeLa-celler. Det forekommer usandsynligt, at funktionen af ​​SOCS1 og SOCS3 i solide tumorer handle ensartet i én retning

in vivo

.

Støtte Information

S1 Table. Primer liste og PCR betingelse for MSP

doi:. 10,1371 /journal.pone.0123133.s001

(DOCX)

S2 Table. Primer liste bruges til bisulfit sekventering

doi:. 10,1371 /journal.pone.0123133.s002

(DOCX)

S3 Table. Oversigt over epigenetisk regulering af SOCS gener i livmoderhalskræft celler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0123133.s003

(DOCX)