PLoS ONE: klinisk-patologisk betydning og prognostiske værdi af DNA Methyltransferase 1, 3a og 3b Udtryk i sporadisk Epithelial æggestokkene Cancer

Abstrakt

Ændret DNA methylering af tumorsuppressorgen initiativtagere spiller en rolle i humane carcinogenese og DNA methyltransferaser (DNMTs) er ansvarlige for det. Denne undersøgelse havde til formål at bestemme afvigende ekspression af DNMT1, DNMT3a, og DNMT3b i godartede og ondartede æggestokkene tumorvæv for deres tilknytning til klinisk-patologisk betydning og prognostisk værdi. I alt 142 ovariecancer og 44 godartede tumorer i æggestokkene blev rekrutteret til immunhistokemisk analyse af deres udtryk. Dataene viste, at ekspression af DNMT1, DNMT3a, og DNMT3b blev observeret i 76 (53,5%), 92 (64,8%) og 79 (55,6%) af 142 tilfælde af ovariecancer væv hhv. Af de alvorlige tumorer, DNMT3a proteinekspression var betydeligt højere end i benigne tumor prøver (

P

= 0,001); DNMT3b var marginalt signifikant nedreguleret i æggestokkene sammenlignet med de godartede tumorer (

P

= 0,054); DNMT1 udtryk har ingen statistisk forskel mellem ovariecancer og godartede tumorvæv (

P

= 0,837). De mucious tumorer, ekspressionen af ​​DNMT3a, DNMT3b, og DNMT1 var ikke forskellig mellem ondartede og godartede tumorer. Desuden blev DNMT1 udtryk forbundet med DNMT3b udtryk (

P

= 0,020, r = 0,195). DNMT1 ekspression blev associeret med patienternes alder, menopause status, og tumorlokalisering, mens DNMT3a ekspression blev associeret med histologiske typer og serum CA125-niveauer og DNMT3b ekspression var forbundet med lymfeknudemetastaser. Desuden patienter med DNMT1 eller DNMT3b udtryk havde en tendens til bedre overlevelse end dem med negativ udtryk. Co-ekspressionen af ​​DNMT1 og DNMT3b var signifikant associeret med en bedre samlet overlevelse (

P

= 0,014). Dataene fra denne undersøgelse forudsat de første beviser for differentiel ekspression af DNMTs proteiner i kræft i æggestokkene væv og deres foreninger med klinisk-patologiske og overlevelsesdata i sporadiske ovariecancerpatienter

Henvisning:. Bai X, Song Z, Fu Y, yu Z, Zhao L, Zhao H, et al. (2012) klinisk-patologisk betydning og prognostiske værdi af DNA Methyltransferase 1, 3a og 3b Udtryk i sporadisk Epithelial kræft i æggestokkene. PLoS ONE 7 (6): e40024. doi: 10,1371 /journal.pone.0040024

Redaktør: M.Carolina Elias, Instituto Butantan, Laboratório Especial de Toxinologia Aplicada, Brasilien

Modtaget: 8. februar 2012; Accepteret: 30. maj 2012; Udgivet: 29 juni, 2012 |

Copyright: © 2012 Bai et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr 30.873.097 og nr 30.973.559) og Videnskab og Teknologi Institut for Liaoning-provinsen (nr 2010225001). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epigenetisk ændring af det genomiske DNA henviser til funktionelt relevante modifikationer af genomet, som påvirker genekspression, men ikke indebærer en ændring i nukleotidsekvensen, som spiller en vigtig rolle i human carcinogenese. Sådanne modifikationer indbefatter DNA-methylering, kromatin remodellering og histon varianter, og den epigenetiske funktion af ikke-kodende RNA [1]. Blandt disse DNA methylering er en kovalent modifikation af DNA, der spiller en vigtig rolle i oprettelsen genekspression programmer under udvikling [2]. Ikke desto mindre unormal DNA-methylering også spille en vigtig rolle i udviklingen human cancer, og de fleste cancerceller viser en global hypometylering af genomet, der inducerer abnorm ekspression af gener, men en lokal hypermethylering der tavsheder tumorsuppressorgener [1], [3]. I pattedyr er DNA-methylering etableret og hovedsagelig vedligeholdes af tre DNA-methyltransferaser (DNMTs), nemlig DNMT1, DNMT3a, og DNMT3b. Den foretrukne mål for DNMT1 er hemi-methylerede DNA [4], [5] og dette protein fungerer som en “vedligeholdelse” methyltransferase og det primære enzym ansvarlig for kopiering methylering mønstre efter DNA-replikation. Det lokaliserer at replikation foci og interagerer med spredning celle (PCNA) [6]. I modsætning hertil DNMT3a og DNMT3b er afgørende for tidlig fosterudvikling og ansvarlig for de novo methylering [7]. Overekspression af disse tre DNMTs er blevet rapporteret i forskellige maligniteter og forbundet med dårlig overlevelse forskellige cancere, herunder lunge, lever, og cervixcancer og lymfomer [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18]. I modsætning til kræft-associerede genmutationer, amplificeringer og sletninger, DNA methylering er potentielt reversibel. Således har DNMTs blevet undersøgt som et mål for re-ekspressionen af ​​tumorsuppressorgener og tilbageførsel af maligne fænotyper i forskellige maligniteter [19]. Senest antisense-oligonukleotider rettet DNMT gener, for eksempel MG98, synes at være effektiv i prækliniske studier og har nu indgået klinisk fase I og fase II-undersøgelser [20], [21].

epitelovariecancer er den sjette førende kræft hos kvinder i hele verden, og den anden mest almindelige gynækologisk kræft, der tegner sig for ca. 4% af alle kvindelige kræftformer [22], [23]. På grund af manglende tidlige advarselstegn og effektive screening-værktøjer, størstedelen af ​​patienterne er til stede med sene stadier af sygdommen [24]. Epitelovariecancer er den mest dødbringende gynækologiske malignitet og de fem-års overlevelse er under 25% for patienter diagnosticeret med stadie III – IV sygdomme [25], [26]. Ligner andre maligniteter, afvigende methylering af DNA på CpG-øer er også en vigtig mekanisme til ovarieudvikling kræft. Prækliniske studier viste, at de-methylering agenter var i stand til at vende modstanden af ​​æggestokkene kræftceller til platin [27], [28], hvilket fører til at bruge DNMT hæmmere i kliniske forsøg med ovariecancer [29], [30], [31], [32]. Men der er ingen data om undersøgelse af DNMT proteiner i kræft i æggestokkene væv data, selv om to tidligere undersøgelser har rapporteret ekspression af DNMT mRNA i æggestokkene kræft cellelinjer og små vævsprøver [33], [34]. I denne undersøgelse, vi samlet 142 tilfælde af epitelial ovariecancer prøver og 44 tilfælde af godartede tumorer i æggestokkene til påvisning af DNMT1, DNMT3a, og DNMT3b protein udtryk for at fastlægge den rolle, DNMT proteiner i æggestokkræft og klinisk betydning.

Resultater

Patient Kendetegn

i denne undersøgelse har vi rekrutteret vævsprøver fra 186 æggestokkene tumor prøver til evaluering af DNMTs proteinekspression. De klinisk-patologiske data fra patienterne er vist i tabel 1. Kort fortalt, gennemsnitsalderen af ​​patienterne på kirurgi var 53 år (varierende fra 20 til 74 år). 27 (23,3%) patienter havde lymfeknude-metastaseret sygdom på tidspunktet for kirurgi og 110 (77,5%) patienter havde serøs karcinom som den vigtigste histologisk diagnose efterfulgt af mucinøs carcinoma (8,5%), clear cell carcinoma (~5.6%) og udifferentieret carcinom (~5.6%). De serumniveauer af CA125, CA199, og CEA var forhøjet før operation, men ingen af ​​patienterne modtaget nogen neo-adjuverende kemoterapi. Opfølgende data var tilgængelige for 85 patienter. Middelværdien og median samlet overlevelse (OS) var 56,1 og 41,0 måneder, henholdsvis med en 95% konfidensinterval på 45,3 til 66,9 og 33,2 til 48,8 måneder. Middelværdien og median sygdomsfrie overlevelse (DFS) var 46,6 og 26,0 måneder, henholdsvis med en 95% konfidensinterval på 36,4 til 56,9 og 14,6 til 37,4 måneder. I de 44 godartede tumorer, 31 var serøse og 13 mucinøs.

Differential ekspression af DNMT Proteiner med malignt og Benign æggestokkræft

Differentiel udtryk for DNMT proteiner i maligne og benigne tumorer i æggestokkene ifølge histologisk type er opsummeret i tabel 2. især ekspressionen af ​​DNMT3a protein var signifikant højere end for godartede tumorvæv (Mann-Whitney U-test test,

P

= 0,001; tabel 2), men forskellen blev ikke observeret i mucious tumorer (Mann-Whitney U-test test,

P

= 0,813; tabel 2). Mens DNMT3b protein blev påvist i 64 (58,2%) af de 110 serøse kræfttilfælde og 22 (71,0%) af de 31 serøse godartede tumorer, hvilket indikerer, at DNMT3b ekspression i ovariecancere var lavere, men ikke signifikant end godartede tumorer (Mann- Whitney U-test test,

P

= 0,054; tabel 2), men forskellen blev ikke observeret i mucious tumorer (Mann-Whitney U-test test,

P

= 0,536; tabel 2 ). I modsætning hertil udtryk for DNMT1 protein var ikke signifikant forskellig mellem i cancer og æggestokkene godartede tumor prøver enten i alvorlige eller i mucious tumorer (Mann-Whitney U-test test, serøs:

P

= 0,837; mucious:

P

= 0,315 tabel 2). Repræsentative ekspressionsmønstre for immunhistokemisk farvning af DNMTs i ovariecancer og godartede tumorvæv blev vist i figur 1 og figur 2. Dernæst vi associeret ekspression af disse tre DNMT proteiner i de ovariecancer væv ved hjælp Spearman rang korrelation test. Dataene viste, at ekspressionen af ​​DNMT1 var signifikant associeret med DNMT3b (r = 0,195,

P

= 0,020; tabel 3), men ikke med DNMT3a protein (r = 0,130,

P

= 0,122 ; tabel 3) eller mellem DNMT3a og DNMT3b proteiner (r = 0,152,

P

= 0,071;. tabel 3)

Repræsentative eksempler på negative (A, E, i) , svagt positive (B, F, J), moderat positive (C, G, K), og stærkt positive (D, H, L) immunfarvning for DNMT3a, DNMT3b, og DNMT1 udtryk vises henholdsvis; Pile viser banen udvidet. Forstørrelse: x 400; forstørrede steder:. × 1000

Repræsentative eksempler på negative (A, E, I), svagt positive (B, F, J), moderat positive (C, G, K), og stærke positive (D, H, L) immunfarvning for DNMT3a, DNMT3b, og DNMT1 udtryk vises henholdsvis. Forstørrelse:. × 400

associering mellem Angivelse af DNMT Proteiner og klinisk-patologisk parametre

Efter detekteret udtryk for disse tre DNMT proteiner ved hjælp af immunhistokemi, vi er forbundet deres udtryk med klinisk-patologisk data fra patienterne. Vores data viser, at DNMT1 ekspression blev signifikant associeret med alderen og menopausen tilstand af patienterne og med tumorlokalisering. Ekspression af DNMT1 protein i den ældre ( 53 år) eller postmenopausale patienter var højere end for yngre patienter (Pearson Chi-Square test,

P

= 0,028, tabel 4) eller præmenopausale patienter (Pearson chi- Square test,

P

0,000; tabel 4). Desuden udtryk for DNMT1 protein var højere i de patienter, hvis tumor forekom i én side end patienter, hvis tumor forekom i begge sider (Pearson Chi-Square test,

P

= 0,010; tabel 4). Men der var ingen signifikante associationer til stede mellem DNMT1 immunoreaktivitet og tumorstørrelse, lymfeknude metastaser, klinisk fase, histologisk type, CA125, eller CA199,.

Desuden var der en signifikant sammenhæng mellem DNMT3a og serum CA125 niveau (Pearson Chi-Square test,

P

= 0,044; tabel 4). Ekspression af DNMT3a protein var 69,1% i serøs karcinom, som var højere end den for mucinøs carcinom (33,3%) og clear cell carcinoma (50%) (Fishers eksakte test,

P

= 0,027; tabel 4). Men der var ingen sammenhæng mellem DNMT3a immunreaktivitet og andre kliniske patologiske parametre, som vist i tabel 4.

Desuden afslørede data, DNMT3b ekspression blev signifikant associeret med lymfeknude metastaser af kræft i æggestokkene (Pearson Chi-Square test,

P

= 0,027; tabel 4). Selv om der ikke er statistisk signifikant, ekspressionen af ​​DNMT3b protein syntes at være forbundet med høj grad af serum CA199 (Pearson Chi-Square test,

P

= 0,061; tabel 4).

Køben- udtryk for DNMT1 og DNMT3a var signifikant associeret med overgangsalderen tilstand (Pearson Chi-Square test,

P

= 0,008; tabel 4) og placering af tumor (Pearson Chi-Square test,

P

= 0,036; tabel 4), mens co-ekspression af DNMT1 og DNMT3b var signifikant associeret med overgangsalderen tilstand (Pearson Chi-Square test,

P

= 0,001; tabel 4) og placering af tumor (Pearson chi- Square test,

P

= 0,015; tabel 4). Co-ekspressionen af ​​DNMT1 og DNMT3b blev også signifikant associeret med serum CA199 niveauer (Pearson Chi-Square test,

P

= 0,013, tabel 4).

Foreningen af ​​DNMT Protein Expressions med overlevelse af patienterne Salg

Efter at vi associeret ekspression af DNMT protein med overlevelsen af ​​de patienter, der anvender Kaplan-Meier-analyse (figur 3). Navnlig, men det ikke er væsentligt anderledes, patienter med DNMT udtryk havde en tendens til forbedret overlevelse end dem med negativ ekspression, modsatte af resultaterne fra tidligere undersøgelser i andre typer af cancer [8], [13], [17], [18 ], [35], [36]. I vores prøver, DNMT1 udtryk marginalt forbundet med forbedret OS (

P

= 0,084;. Figur 3A) og DFS (

P

= 0,186;. Figur 3D); og det gjorde DNMT3b. Desuden blev co-ekspression af DNMT1 og DNMT3b signifikant associeret med forbedret samlet overlevelse sammenlignet med andre prøver (kun DNMT1 eller DNMT3b udtryk eller begge negative) (

P

= 0,014, Fig. 4C). Univariate analyse af den potentielle prognostiske effekt af kliniske og histopatologiske parametre identificeret klinisk fase, hvor tumor og serum CA125 niveau som markant eller marginalt signifikant associeret med kortere OS og DFS (tabel 5).

Survival kurver viser, at selv om der ikke var nogen statistisk signifikans, patienter med DNMT1 udtryk havde en tendens til forbedret samlet overlevelse (a) og sygdomsfri overlevelse (D) end dem med negativ udtryk, og det gjorde DNMT3b (C og F). Men der er ingen signifikant forskel mellem DNMT3a udtryk og den samlede overlevelse eller sygdomsfri overlevelse (B og E).

P

-værdi fås fra log-rank test.

Survival kurver viser, at co-ekspression af DNMT1 og DNMT3b var signifikant associeret med forbedret samlet overlevelse sammenlignet med negative prøver (

P

= 0,014, fig. 3E).

P

-værdi fås fra log-rank test.

Efterfølgende multivariat Cox regressionsmodeller ved hjælp af klinisk fase, tumor størrelse, placering af neoplasi, DNMT1 og DNMT3b co -expression viste, at kun klinisk fase (OS,

P

= 0,022, RR = 6,977, 95% CI: 1.322~36.822, DFS,

P

= 0,026, RR = 4,686, 95% CI: 1.207~18.196) forblev som en selvstændig prognostisk faktor (tabel 6)

undergruppe analyse af associering mellem DNMT Expressions og den kliniske effekt af de patienter

Yderligere analyse blev udført med. henviser til DNMTs ekspression i undergrupper af patienter med forskellige klinisk-patologiske parametre, såsom alder, menopause tilstand, tumorstørrelse kliniske stadium, lymfeknudemetastase, og placering af tumoren. Vores data viser, at ekspressionen af ​​DNMT1 protein blev forbundet med forbedret DFS i patienter med større størrelse af tumorer (DFS,

P

= 0,027, figur S1). Angivelse af DNMT1 syntes at være en beskyttende faktor i patienter, hvis tumor forekom i begge sider, men det er ikke statistisk signifikant (OS,

P

= 0,139, figur S1) (DFS,

P

= 0,269, figur S1); modsatte af resultaterne fra patienter, hvis tumor forekom i enkelt side (OS,

P

= 0,429, figur S1) (DFS,

P

= 0,210, figur S1). I modsætning hertil DNMT3a protein niveauer undladt at vise nogen foreninger med patient overlevelse (

P

0,05, figur S2). DNMT3b udtryk var forbundet med langvarig OS hos ældre patienter (

P

= 0,011, figur S3), postmenopausale patienter (

P

= 0,019, figur S3), og patienter, hvis tumor forekom i begge sider (

P

= 0,022, figur S3). Ekspression af DNMT3b protein også marginalt forbundet med længerevarende DFS hos postmenopausale patienter (

P

= 0,098; Figur S3) og patienter, hvis tumor forekom i begge sider (

P

= 0,097; Figur S3).

diskussion

i den foreliggende undersøgelse, vi for første gang immunhistokemisk bestemt udtryk for DNMT1, DNMT3a, og DNMT3b proteiner i godartede og ondartede æggestokkene tumorvæv. Dataene viste, at DNMT3a ekspression var højere i ovariecancer end den, godartede tumorer, hvilket var i overensstemmelse med de tidligere undersøgelser i andre typer af cancer [15], [37], [38]. Selv om adskillige tidligere undersøgelser har vist, at ekspressionsniveauer af DNMT3b mRNA [8], [9], [39], [40] og protein [13], [40], [41] blev forøget i en række forskellige maligne tumorer , vores aktuelle data vist lavere ekspression af DNMT3b i æggestokkene cancervæv sammenlignet med godartet tumor. I denne undersøgelse fandt vi også, at der ikke var nogen forskel i ekspression af DNMT1 protein mellem æggestokkene benigne og maligne væv. Det er behageligt at en tidligere undersøgelse rapportering, at der ikke var nogen forskel i DNMT1 mRNA-ekspression blandt normale ovarievæv, primær ovariecancer, og gentagelse af kræft i æggestokkene væv [33]. En anden rapport viste, at ekspressionen af ​​DNMT1 mRNA-niveauer i kræft i æggestokkene HeyA8 og HeyC2 cellelinjer var højere end for normale ovarieepitelceller [34]. Vores nuværende undersøgelse konstateres første gang ekspression af DNMT proteiner i ovariecancer ved sammenligning med de godartede væv; således yderligere undersøgelse er nødvendig for at analysere ændret ekspression af DNMT proteiner i ovariecancer med sammenligningen med normale ovariale væv. I nogen aktiviteter, på grund af de komplekse mekanismer, der er ansvarlige for regulering af DNMT udtryk og funktioner DNMTs i carcinogenese, bør den ændrede udtryk og effekter af DNMTs yderligere undersøgt i kræft i æggestokkene, selv om deres afvigende udtryk viste sig at være på grund af methylering af deres gen initiativtagere i forskellige kræftformer, såsom gliomer og embryonale væv [42], [43]. Imidlertid mutation og tab af ekspression af p53-protein førte til overekspression af DNMT1 i leukæmi, kolorektal cancer og lungecancer [44]. Desuden er microRNA også involveret i reguleringen af ​​DNMT udtryk [45], [46]. Borderline epitelial tumor var en betydelig og vigtig gruppe af epitelial tumor i æggestokkene. Vi har også indsamlet borderline epiteliale tumorer, men antallet af borderline tumorer findes i vores undersøgelse var kun 6, så vi ikke analyseret borderline epiteliale tumorer i denne undersøgelse, og vi vil fortsætte med at indsamle mere borderline tumorer for fremtidig undersøgelse.

Desuden er vores aktuelle undersøgelse yderligere associeret relevansen af ​​tre DNMT protein udtryk med klinisk-patologiske træk fra æggestokkene kræftpatienter. Dataene viste, at DNMT1 udtryk var positivt korreleret med patienternes alder, dvs. DNMT1 protein blev udtrykt mere i ældre patienter, data fra som var i overensstemmelse med den af ​​lymfom [13]. Desuden blev DNMT1 protein udtrykt mere hos postmenopausale patienter end hos præmenopausale patienter. Desuden viste vores data, at ekspression af DNMT1 protein var relevant med lokaliseringen af ​​tumoren. Men til dato, vi ved ikke, hvorfor disse skete eller konsekvenserne af disse foreninger. Derudover fandt vi også, at ekspressionen af ​​DNMT1 var højere i den ensidige ovariekræft end i bilateral ovariecancer, hvilket kan indikere forskellen af ​​den ensidige og bilaterale kræft i æggestokkene med hensyn til biologiske egenskaber, genetik, og mekanismen. En tidligere undersøgelse har rapporteret, at DNMT1 udtryk var forbundet med lymfeknude metastaser i bugspytkirtlen kræft [17], men vi fandt ikke en sådan sammenslutning i kræft i æggestokkene.

Desuden er vores nuværende undersøgelse viste, at DNMT3a udtryk var forbundet med histologisk type, f.eks, ovarie- serøs carcinoma udtrykte højere niveauer af DNMT3a protein. DNMT3a udtryk var positivt associeret med serum CA125 niveau, mens DNMT3b udtryk var forbundet med lymfeknude metastaser og serum CA199 niveau, som er nyt og blev ikke rapportere før.

Med hensyn til overlevelse forudsigelse ved hjælp af forskellige DNMT udtryk, tidligere undersøgelser viste, at overekspression af DNMT1 eller DNMT3b var forbundet med en dårlig prognose i kræft i lungerne [15], lever [18], [35], og pancreas [17], lymfom [13] og andre maligniteter. I kræft i æggestokkene, vores nuværende undersøgelse viste en anden tendens i DNMT foreninger med prognose, dvs den samlede overlevelse (OS) og sygdomsfri overlevelse (DFS) i æggestokkene kræftpatienter var bedre med udtryk for DNMT1 og DNMT3b proteiner i forhold til patienterne uden ekspression af DNMT1 og DNMT3b proteiner. Desuden co-ekspression af DNMT1 og DNMT3b proteiner blev også signifikant associeret med forbedret OS. Desuden viste vores yderligere resultater at DNMT3a i forskellige undergrupper af patienter med kræft i æggestokkene havde ingen effekt på overlevelse status, selvom DNMT1 udtryk viste bedre OS og DFS hos patienter med store tumorer end i patient med mindre tumorer. Den tilsvarende gælder for DNMT3b ekspression i ældre patienter, postmenopausale patienter og patienter med bilaterale tumorer positive. Disse helt forskellige data fra den aktuelle undersøgelse tyder forskellige biologiske egenskaber æggestokkræft fra andre kræftformer. Men der er behov for, fremtidig undersøgelse for at bekræfte vores aktuelle fund.

I en række kræftformer, blev DNMT1, DNMT3a, og DNMT3b rapporteret at være stærkt udtrykt og forbundet med dårlig prognose. Hypermethylering af nogle tumor undertrykke genpromotorer (GTS), der påvirker prognosen kan delvist forklare den dårlig prognose i forbindelse med patienter med DNMT overekspression [47], [48], [49], [50], selv om methylering af de fleste genpromotorer gør ikke ‘ t har høj korrelation med ekspression af DNMTs [35], [51]. Det er imidlertid ukendt, hvorfor høj ekspression af nogle af disse DNMTs var forbundet med bedre prognose af patienter med ovariecancer. Tidligere undersøgelser viste, at methylering af DNA CpG ø i tumorvæv ikke var den eneste del af hypermethyleringen af ​​gener, der hypometylering forekom også i nogle regioner af genomisk DNA, og at unormal hypometylering i humane genom påvirket prognose for patienter med prostatacancer, levercancer cancer, og gliom [52], [53], [54]. Ligesom andre kræftformer, ovariecancerceller viser også en global hypometylering i genomet og en lokal hypermethylering af tumorsuppressorgen promotorer [55]. To tidligere undersøgelser anvendte methylering chip som high-throughput metode til screening gen hypermethylations der kan påvirke prognosen for patienter med ovariecancer [56], [57] og fandt, at en højere grad af CpG ø metylering er forbundet med reduceret progressionsfri- patient overlevelse (PFS). Mens andre undersøgelser rapporteret, at promotor hypermethylering var involveret i DNA-skader reparation gener i kræft i æggestokkene og i forbindelse med forbedret prognose for patienter gennem øget følsomhed for kemoterapi [58], [59]. Desuden viste de seneste undersøgelser, at DNMT inhibitor var kun i stand til delvist at vende platin modstand hos patienter med ovariecancer [32]. En anden undersøgelse evaluerede aktiviteten og tolerabiliteten af ​​en demethylering agent fazarabin (Ara-AC) hos patienter med kræft i æggestokkene, og ingen komplette eller partielle responser blev observeret i de 19 patienter [29]. Taget helt, vores aktuelle undersøgelse viser, at mekanismen og kliniske betydning af ændret udtryk for DNMTs i ovariecancer kunne evalueres yderligere.

Materialer og metoder

vævsprøver

Tissue prøver fra 186 patienter med tumorer i æggestokkene blev rekrutteret fra Kirurgisk afdeling Onkologisk og General Surgery, Kina Medical University-Affiliated første og anden Hospitaler mellem 2002 og 2010. Ud af 186 sager, 142 sager blev histologisk bekræftet som æggestokkene epitelcarcinoma og 44 sager var godartede tumorer i æggestokkene. Ingen af ​​vores patienter havde nogen familie historie af kræft. Patienterne blev kirurgisk iscenesat i henhold til gældende FIGO (International Federation of Gynækologer og obstetrikere klassifikationssystem). Histologisk diagnose blev nået på grundlag af kriterierne af World Health Organization. Vores undersøgelse var knyttet til et andet klinisk forsøg, som vi opnåede informeret samtykke fra alle deltagere. Fordi dette forsøg var omkring DNMT inhibitor, og vi ønsker at kende klinisk-patologisk betydning og prognostisk værdi DNMT udtryk i sporadisk kræft i æggestokkene. Så vi gerne tilføje denne undersøgelse om DNMT udtryk. Vi kaldt til hver patient, forklarede vores undersøgelse, og opnåede informeret samtykke. Når vi kaldes, en notar var til stede og vil give vidnesbyrd, og vi fik mobiltelefonen kort besked, som vi krævede deltagere, der samtykke undersøgelsen til at sende til os. Fordi tiden var begrænset, og nogle deltagere var ude af hospitalet, så det er vanskeligt at opnå skriftlig tilladelse. Instituttet Forskning Medical Ethics Committee of China Medical University behandlet og godkendt godkendelsesproceduren. Endelig opnåede vi mundtlige samtykke fra 186 patienter.

Immunhistokemi

Formalin-fikserede og paraffin-indlejrede vævsprøver blev skåret i 4-um tykke snit og monteret på poly-L-lysin-coatede objektglas. Til immunhistokemisk farvning blev snittene afparaffineret i xylen, rehydreret i en serie af alkohol, og vasket i ledningsvand. Snittene blev derefter kogt i 10 mM natriumcitratbuffer, pH 6,0, i 10 minutter i en autoklave i antigen-genvinding. Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret ved inkubering af sektionerne i 3% H

2O

2 ved 37 ° C i 20 min. derefter blev snittene blokeret for at undgå ikke-specifik binding ved tilsætning af en 10% normalt gedeserum ved 37 ° C i 30 minutter og derefter inkuberet i 4 ° C natten over med det polyklonale antistof mod DNMTs (DNMT1, sc-20701, 1: 200 fortynding DNMT3a, sc-20703, 1:200 fortynding DNMT3b sc-130.740, 1:100 fortynding Santa Cruz Biotechnology, USA). Specificiteten af ​​antistoffer var blevet bekræftet ved hjælp af Western blot-analyse (data ikke vist). I den næste dag blev sektionerne vasket fem gange med 0,01 mol /l phosphatbufret saltvand (PBS; pH 7,4) i 15 min og derefter inkuberet med et biotinyleret sekundært antistof i 30 minutter ved 37 ° C i mørke. Efter dette blev sektionerne inkuberet med et streptavidin peberrodsperoxidase opløsning i yderligere 30 minutter (LSAB kit, Dako, Glostrup, Danmark), vasket i PBS og farvet med DAB (3, 3-diaminobenzidin). Endelig blev snittene modfarvet med Mayers hematoxylin, dehydreret, og monteret. Negative kontroller blev kørt parallelt, og blev genereret af PBS erstatte anti-DNMTs antistof.

Evaluering af Immunhistokemi

De immunfarvet sektioner blev revideret og scorede uafhængigt af to efterforskere, der var blindet til patienternes klinisk-patologiske karakteristika. De nukleare udtrykte DNMTs er den funktionelle type DNMT proteiner; Derfor blev kun nukleare positivitet for DNMTs proteiner evalueret ved brug semikvantitative scorende kriterier for farvningen intensitet (0, negativ, 1, svag, 2, moderat og 3, alvorlig) og andelen af ​​positive celler (0, negativ; 1, positiv i ≤10%; 2, positiv i 10% og ≤50%; 3, positiv i 50% og ≤80%; 4, positiv i 80% af tumorcellerne). De to scoringer blev ganget for hver enkelt sag og udtrykket blev gradueret som: negativ, score = 0; svag ekspression, score = 1-4; moderat udtryk, score = 5-8; og stærke udtryk, score = 9-12.

Statistisk analyse

Sammenligning af DNMT udtryk score mellem prøverne blev analyseret ved anvendelse af Mann-Whitney U-test. Spearman rank korrelation test blev udført for at analysere sammenhængen mellem DNMT udtryk. Korrelationer mellem klinisk-patologiske faktorer og DNMTs udtryk blev analyseret ved hjælp af Chi-square (X

2) test eller Fishers Exact Sandsynlighed Test. Overlevelse af patienterne ifølge DNMT udtryk blev analyseret ved anvendelse af Kaplan-Meier-kurve analyse med log-rank test. Cox regressionsanalyse blev anvendt til den multivariate analyse. Statistisk signifikans blev defineret som

P

0,05. Alle statistiske tests blev udført ved hjælp af SPSS softwarepakke (SPSS 11.5 Inc, Chicago, IL, USA).

Støtte Information

Figur S1.

Kaplan-Meier overlevelsesanalyse af association mellem DNMT1 udtryk og OS og DFS i forskellige undergrupper.

doi: 10,1371 /journal.pone.0040024.s001

(TIF)

Figur S2.

Kaplan-Meier overlevelsesanalyse af association mellem DNMT3a udtryk og OS og DFS i forskellige undergrupper.

doi: 10,1371 /journal.pone.0040024.s002

(TIF)

Figur S3.

Kaplan-Meier overlevelsesanalyse af association mellem DNMT3b udtryk og OS og DFS i forskellige undergrupper.

doi: 10,1371 /journal.pone.0040024.s003

(TIF)

Tak

Vi vil gerne takke Dr. Hua Chang og Stål Liu fra Kirurgisk Afdeling Onkologi og General Surgery, Kina Medical University-Affiliated første og anden Hospitaler for hjælp til vævsprøver kollektion.