PLoS ONE: Karakterisering af differentielt udtrykte gener involveret i Pathways associeret med gastrisk Cancer

Abstrakt

For at udforske mønstre af genekspression i gastrisk kræft, i alt 26 parrede mavekræft og noncancerous væv fra patienter blev inkluderet til genekspression microarray analyser. Limma metoder blev anvendt til at analysere de data, og gener blev anset for at være væsentligt forskelligt udtryk, hvis den False Discovery Rate (FDR) værdien var 0,01,

P

-værdi WAS 0,01 og fold ændring (FC) var 2. Efterfølgende blev Gene Ontology (GO) kategorier anvendes til at analysere de vigtigste funktioner i de differentielt udtrykte gener. Ifølge Kyoto Encyclopedia of Gener og database genomer (Kegg), fandt vi veje signifikant associeret med den differentierede gener. Gene-loven netværk og co-ekspression netværk blev bygget henholdsvis baseret på forholdet mellem de gener, proteiner og forbindelser i databasen. 2371 mRNA og 350 lncRNAs betragtes som væsentligt differentielt udtrykte gener blev udvalgt til yderligere analyse. GO kategorier, sti analyser og Gene-loven netværk viste en konsistent resultat, at up-regulerede gener var ansvarlige for tumorigenese, migration, angiogenese og mikromiljø dannelse, mens ned-regulerede gener var involveret i stofskiftet. Disse resultater af denne undersøgelse give nogle nye resultater på kodning RNA’er, lncRNAs, stier og co-ekspression netværk i mavekræft, som vil være nyttigt at vejlede yderligere undersøgelser og målrette behandling for denne sygdom

Henvisning:. Li H Yu B, Li J, Su L, Yan M, Zhang J, et al. (2015) Karakterisering af forskelligt udtrykte gener involveret i Pathways associeret med gastrisk cancer. PLoS ONE 10 (4): e0125013. doi: 10,1371 /journal.pone.0125013

Academic Redaktør: Francisco J. Esteban, University of Jaen, Spanien

Modtaget: November 9, 2014 Accepteret: 6 Marts 2015; Udgivet: 30 April, 2015

Copyright: © 2015 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer. Alle microarray-filer er tilgængelige fra NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) database (tiltrædelse nummer “GSE65801” https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE65801).

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af tilskud til analyse fra National Natural Science Foundation of China [No. 81172324, No. 91229106, nr 81272749, og nr 81372231], Videnskab og Teknologi Kommissionen for Shanghai kommune [No. 13ZR1425600], og de vigtigste projekter i National Science Teknologi Pillar Program Kina (nr 2014BAI09B03). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft (GC) er en af ​​de mest almindelige kræftformer i verden, og forekomsten er særlig høj i det østlige Asien, især i Kina. Ca. 952 tusind nye tilfælde af mavekræft blev diagnosticeret på verdensplan i 2012, og halvdelen af ​​dem fandt sted i Østasien (især i Kina) [1]. I Kina er de fleste patienter med GC diagnosticeret på et sent tidspunkt med dårlig prognose. Derfor belyse de molekylære mekanismer bag GC progression er afgørende for at identificere centrale biomarkører og udvikling af effektive målrettede behandlinger.

I det seneste årti, har genekspression microarrays blevet et fælles værktøj til at undersøge gentranskriptet niveauer i kræftforskning. Microarray data anvendes til en bred vifte af analyser, såsom uovervåget klyngedannelse, klassificering, differentiel ekspression analyse, og ekspression kortlægning af kvantitativ egenskab [2] loci. Det handler ikke kun hjælper til at identificere centrale dysfunktionelle gener i kræft, men giver genom-dækkende oplysninger om genekspression på én gang samt [3,4]. I denne undersøgelse har vi udført en genom-dækkende undersøgelse af ekspressionen af ​​lncRNAs og mRNA’er fra parrede prøver af primære mavekræft væv og noncancerous væv, at profilere de differentielt udtrykte lncRNAs og kodende RNA’er. Undersøgelse af disse data vil give værdifulde oplysninger om den mekanisme af carcinogenese og tillade opdagelsen af ​​vigtige gener, som kan virke som fremtidige mål for anti-cancer terapi.

Metoder og Materialer

Etisk erklæring

skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle deltagere. Undersøgelsen blev godkendt af Human Research Ethics Committee of Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine.

Vævsprøver

Væv blev taget fra primære gastriske carcinomer fra ubehandlede patienter, som gennemgik D2 radikal gastrektomi i Shanghai Ruijin Hospital. For hver cancervæv, blev en parret noncancerous vævsprøve opsamlet fra den tilgrænsende region på samme tid. Størrelsen af ​​hver prøve var omkring 0,1 cm

3. Alle prøver blev anbragt i RNAlater inden for 15 minutter efter udskæring og opbevaret i flydende nitrogen indtil RNA-ekstraktion. I denne undersøgelse blev 32 parrede væv indsamles til microarray og 26 parrede prøver blev indskrevet i det næste trin analyse af GO, sti og netværk efter kvalitetskontrol ved hjælp af 3D-Principal komponent analyse (3D-PCA) og Cluster analyse.

microarray eksperimenter

Agilent SurePrint G3 Menneskelig GE 8x60K Microarray (design ID: 028.004) blev anvendt i denne undersøgelse. Total RNA blev isoleret og forstærkes ved hjælp af en lav Input Quick Amp Mærkning Kit, One-farve (Cat # 5190-2305, Agilent teknologier, US). Derefter blev de mærkede cRNA’er oprenset ved RNeasy mini kit (Cat # 74106, QIAGEN, Tyskland).

Baseret på producentens instruktioner, blev hvert objektglas hybridiseret med 600 ng Cy3-mærket cRNA ved anvendelse af en Gene Expression Hybridisering Kit (Cat # 5188-5242, Agilent teknologier, US) og vasket af Gene Expression vaskebuffer Kit (Cat # 5188-5327, Agilent teknologier, US).

En Agilent Microarray Scanner (Cat # G2565CA, Agilent teknologier, US) og Feature Extraction software 10.7 (Agilent teknologier, US) blev anvendt til at scanne hvert dias med de samme indstillinger, der er vist som følger, Dye-kanal: Grøn, Scanningsopløsning = 3 um, 20bit. De rå data blev normaliseret ved fraktilestime algoritmen, Gene Spring Software 11.0 (Agilent teknologier, US) (detaljeret i S5 tabel).

Limma

Lineære modeller og empiriske Bayes metoder blev anvendt til at analysere dataene i denne undersøgelse. De resulterende

P

-værdier blev justeret ved hjælp af BH FDR algoritme. Der var tre standarder for os at overveje, at et gen var signifikant forskelligt udtryk, var 0,01 og fold ændring var 2. (Detaljeret i S5 tabel)

GO kategori

Vi udførte Gene Ontology (GO) analyser for at analysere funktionen af ​​differentielt udtrykte gener i vores microarray efter den fordelingsnøgle funktionelle klassificering af Det Nationale Center for Biotechnology Information (NCBI). Generelt Fishers eksakte test og

χ

2 test blev anvendt til at klassificere GO kategori, og den falske opdagelse sats (FDR,) blev beregnet til at korrigere

P

-værdi (

N

k

refererer til antallet af Fishers test

P

-værdier mindre end

χ

2 test

P

-værdier). Den berigelse Re blev givet ved: Re = (

n

f

/

n

) /(

N

f

/

N

) i de vigtigste kategorier (

N

f

er antallet af differentierede gener i den særlige kategori,

n

er det samlede antal gener inden for samme kategori,

n

f

er antallet af differentierede gener i hele microarray, og

N

er det samlede antal gener i microarray) (detaljeret i S5 tabel)

Pathway analyser

Pathway anmærkninger af den differentierede exressed gener blev opnået fra Kegg (http: //www .genome.jp /Kegg /). Pathway kategorier med en FDR 0,01 blev markeret. Den berigelse af væsentlige veje blev givet ved: berigelse = /, som hjalp os med at finde mere betydningsfulde veje i vores undersøgelse (

n

g

er antallet af differentierede gener inden for bestemt vej,

n

en

er det samlede antal gener i samme vej,

N

g

er antal differentierede gener, som har mindst én bane kommentering, og

N

en

er antallet af gener, som har mindst én bane annotation i hele microarray.) (detaljerede i S5 tabel).

Gene-loven netværk

Ifølge Kegg database, kan man gen involveret i flere veje eller interagere med flere andre gener. Alle gen-gen interaktioner blev samlet sammen for at bygge Gene-loven netværk baseret på den differentierede veje, som hjalp os med at afsløre de signalveje og centrale regulatoriske gener i GC.

Co-udtryk netværk

Gene co-ekspression Network blev bygget efter det normaliserede signal intensitet af specifikke udtryk gener. Degree centrale er defineret som antallet af links én node har en anden, der bestemmer den relative betydning af gener. Hvad mere er, blev k-kerner anvendes som en metode til at forenkle grafen topologi analyser. Core regulatoriske faktorer (gener), der har de højeste grader forbinde mest tilstødende gener og opbygge strukturen i netværket (nærmere beskrevet i S5 tabel).

Real-time kvantitativ PCR

Total RNA blev udtrukket fra væv under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Den kvantitative real-time polymerasekædereaktion (PCR) blev udført ved anvendelse SYBR-green PCR Master Mix i en Fast Real-time PCR 7500 System (Applied Biosystems). Primerne for de 10 gener blev vist i S4 tabel. PCR reaktioner blev udført ved 50 ° C i 2 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. ACt blev beregnet ved at fratrække Ct af β-actin RNA (kontrol) fra Ct af RNA’et af prøven, hhv. ΔΔCt blev derefter beregnet ved at fratrække ACt af kontrollen fra ACt af prøven. Fold ændring blev beregnet af ligning 2-ΔΔCt.

Statistisk analyse

SPSS-software 19 og Microsoft Excel 2010 blev brugt til at analysere dataene. Ekspressionsniveauer mellem cancervæv og tilstødende noncancerous væv blev analyseret ved parret-sample t-test.

P

-værdier under 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Microarray analyser

I alt 42,405 menneskelige gener blev profileret i vores undersøgelse af anvendelse af en Agilent G3 Humant GE 8x60K microarray. Vi har afgivet vores datasæt i lageret af “Gene Expression Omnibus”, og tiltrædelsen nummer var “GSE65801” (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE65801). Vi brugte lineære modeller og empiriske Bayes metoder til at analysere data (se metoder). Der var 2371 mRNA og 350 lncRNAs betragtes som de differentielt udtrykte gener ved limma for det næste trin analyse (figur 1A).

A) Volcano plot viser den differentierede gener (røde prikker) i udtrykket microarray (

P

-værdi 0,01, FDR 0,01). B) Clustering Heatmap viser differentierede lncRNAs. Hver kolonne repræsenterer en prøve, og hver række repræsenterer én differentialespærre lncRNA. C) Clustering Heatmap viser differentierede mRNA. Hver kolonne repræsenterer en prøve, og hver række repræsenterer én differentialespærre mRNA.

Blandt alle 2371 differential mRNA, der er 1142 mRNA nedreguleret og 1229 mRNA opreguleret i vores observation på ændringer af genekspression mellem gastrisk cancer og kontrol væv (fig 1C). De fleste af de differentielle mRNA’er har vist sig at være korreleret med carcinogenese og metastase i de fleste typer cancer (tabel 1). Generne såsom GKN2, PGC, MUC6, Chia, PSCA og FBP2 var blandt top 20 down-regulerede gener, mens KLK8, SFRP4, INHBA, CLDN1, CST1, FAP, SPP1, OLFM4, og KRT17 var blandt de øverste 20 op -regulated gener (tabel 1). Men nogle gener såsom HOXC9, FNDC1, STRA6, KCNE2, PGA3 og KCNJ16 ikke er blevet rapporteret i mavekræft, og deres roller forbliver ukendt (Tabel 1).

Desuden fandt vi 193 nedreguleret lncRNAs og 156 opreguleret lncRNAs blandt i alt 350 differentielle lncRNAs baseret på profileringen (fig 1B). De fleste af de lncRNAs ikke har fået en officiel navne og deres funktioner forbliver ukendt. Imidlertid har nogle rapporteret at spille kritiske roller i kræft, såsom H19, GUCY1B2, MEG3 og AKR7L (tabel 2).

I vores tidligere rapport [36], fold ændring (FC) af H19 i 74 mavekræft versus parrede noncancerous væv var 6,015, med en

P

-værdi på 0,017. Dette resultat var i overensstemmelse med data fra H19 (Absolute FC = 6,06) i denne microarray analyser. Desuden overekspression af H19 bidrager til spredning, migration, invasion og metastase af mavekræft.

Gene ontologi kategorier

Alle differentielt udtrykte gener blev klassificeret i forskellige funktionelle kategorier efter den Gene Ontology (GO) projekt for biologiske processer. Baseret på vores microarray data, analyser GO tilkendegivet, at 208 GO vilkår blev beriget (

P

0,01, FDR 0,01) (S1 tabel). De primære GO kategorier for 170 opreguleret GO vilkår blev fokuseret på celleadhæsion, angiogenese, flercellede organisme udvikling, axon vejledning, skelettet udvikling, kollagen fibril organisation, positiv regulering af angiogenese, sårede og negativ regulering af celleproliferation (Fig 2A) . De vigtigste GO kategorier for down-regulerede gener var fordøjelse, xenobiotiske metaboliske proces, transmembrane transport, ion transport, lille molekyle metaboliske proces, negativ regulering af vækst, glutathion metaboliske proces, cellulære respons på cadmium-ion og metaboliske proces (Fig 2B).

A) De signifikante GO kategorier for up-regulerede gener. B) De væsentlige GO kategorier for down-regulerede gener.

P

-værdi 0,01 og FDR. 0,01 blev brugt som en tærskel for at tilmelde betydelige GO kategorier

Ifølge den differentierede gener og funktioner, vi bygget en GO Tree at udforske samspillet mellem alle de forskellen GO kategorier. Mangfoldigheden i disse kategorier, når man sammenligner cancerøse og kontrol væv foreslog, at gastrisk cancer kan være forbundet med betydeligt opreguleret cellemigration, celleproliferation, angiogenese, celle-celle-adhæsion og celleoverfladereceptor signalveje, mens cellemetabolisme processer og ion transmembrantransport er nedreguleret (figur 3).

Røde prikker repræsenterer up-regulerede GO kategorier og grønne prikker repræsenterer nedreguleret GO kategorier.

Pathway analyser

pathway analyser blev anvendt til at identificere de betydelige veje er forbundet med de differentielt udtrykte gener ifølge Kegg. Der var 32 opreguleret veje og 31 ned-regulerede veje baseret på vores data (figur 4). Desuden vejen profilering var i overensstemmelse med resultaterne for de GO kategorier i kræftrelaterede biologiske funktioner. Vores data viste nogle differentierede gener meget opreguleret som foreslået deres involverede veje blev activiated. For eksempel blev SFRP4, WNT11, FZD2, MYC stærkt udtrykt i cancer væv, der repræsenterer Wnt-vejen blev activiated og BCL2A1, ICM1, TNFSF14 i NF-KB-vejen var stærkt udtrykt så godt. De fleste af de kræftrelaterede signalveje som JAK /STAT, Wnt, NF-KB, PI3K, mTOR, pindsvin og Notch veje blev aktiveret i mavekræft sammenlignet med noncancerous væv baseret på vores data (S2 tabel). De op-regulerede veje, der blev fokuseret på celleadhæsion, transkriptionel dysregulering, carcinogenese og differentiering blev korreleret med tumorogenesis og metastase (Fig 4A). Men de ned-regulerede veje var, generelt ansvarlig for metabolisme (Fig 4B).

A) Top-ranking up-regulerede veje identificeret af Kegg. B) Top-ranking nedreguleret veje identificeret af Kegg. Differential veje er opført i henhold til

P

-værdi 0,01 og FDR 0.01.C) Pathway-loven netværk viser interaktionen af ​​differentierede veje. De røde prikker repræsenterer up-regulerede veje og grønne prikker repræsenterer ned-regulerede veje.

Gene-loven netværk

Baseret på GO kategorier og sti analyse, et gen kan være involveret i flere veje eller interagere med flere andre gener. Vi samles den differentierede gener og opbygget et netværk af samspillet mellem differentielt udtrykte gener. En høj grad protein regulerer eller reguleres af mange andre proteiner, hvilket indebærer en vigtig rolle i Gene-Act netværk (S3 tabel). Den glutathion S-transferase (GST) familie, cytochrom P450 (CYP) familie, UDP glucuronosyltransferase 2 (UGT2) familie, epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) familie og cAMP-afhængig protein kinase katalytisk beta (PRKACB) var på kernen i gen-gen interaktion netværk. De kan spille vigtige roller i netværket, fordi de besad den stærkeste grad (grad 25) centralities (gen-gen interaktioner) (figur 5). Det er blevet rapporteret, at GST, EGFR og PRKACB er ansvarlige for signaltransduktionsveje involveret i tumorvækst og differentiering i forskellige typer af cancere [42,43].

røde prikker repræsenterer opregulerede gener og grønne prikker repræsenterer nedreguleret gener. Pilene angiver forbindelsen og lovgivningsmæssige forhold mellem to gener. Gener, der har flere forbindelser med andre gener har en højere grad score.

Gene co-ekspression netværk

Vi producerede et gen co-ekspression netværk baseret på de differentielt udtrykte gener, proteiner og protein-kompleks i kræft væv og noncancerous (kontrol) væv, henholdsvis. Sammenlignet med kontrollen, forbindelserne mellem gener i cancer væv var mindre, hvilket antydede, at de fleste af de fysiologiske gen-gen interaktioner og bindinger i normale væv var blevet brudt eller tabt i cancervæv (Fig 6A og 6B). Generne med høj grad og k-kerne, som betyder, at de besad de fleste af de interaktioner med andre geneswere kendt som centrale gener i samspillet netværk (Fig 6B), herunder TRO, GPR124, TIMP2, EMCN, SLIT3, HTRA1, SPARC, LAMA4 og MEOX2 (tabel 3). De var ansvarlige for cellesignalering, vedhæftning, angiogenese, migration, vækst og metastase.

A) Co-udtrykte gener og deres netværk i noncancerous væv. B) Co-udtrykte gener og deres netværk i mavekræft. Jo større værdien af ​​K-score, jo stærkere de differentielt udtrykte gener co-udtrykkes. Omfanget af K-score er fra 1 til 21 normalt væv, men fra 1 til 5 i kræftvæv.

Bekræftelse af microarray resultater ved qPCR

Vi udførte kvantitativ real-time PCR (qPCR) på 6 up-regulerede gener (COL1A, BGN, SPP1, Melk, IGFBP4, SPARC) og 4 ned-regulerede gener (PGC, SST, MT1X, S100P) at kontrollere vores data i gastrisk cancer væv (tumor) og noncancerous væv (Normal). Udtrykket forhold mellem disse 10 gener (Tumor /Normal) fra qPCR er i overensstemmelse med dem fra microarray (S4 tabel). Det foreslog data fra differentierede gener udtryk fra microarray var pålidelige. Hvad mere er, har vores hold blevet arbejdet på nogle af de differentierede gener såsom PHF10 [55], CEACAM6 [56], SFRP1 [57], SOX11 [58], CLDN1 [59] for at undersøge deres udtryk og funktioner i gastrisk kræft og resultaterne perfekte bevist vores microarray data.

diskussion

microarray gen-udtryk analyser af mavekræft er tidligere blevet anvendt til at forudsige diagnostiske markører [60], og at identificere genekspression mønstre forbundet med prognosen [ ,,,0],61,62], men det har ikke været brugt til at afsløre molekylære samspil mellem lncRNAs og mRNA i GC. I denne undersøgelse har vi analyseret 26 mavekræft væv med parrede noncancerous væv og profileret generne differentielt udtrykt efter deres GO kategorier, veje, Gene-Act netværk og co-ekspression netværk.

genekspressionen resultater blev opnået ved anvendelse af en Agilent G3 Humant GE 8x60K microarray, som ikke kun omfatter transkriptomet databaser til mRNA-mål, men omfatter også prober for lncRNAs (lange ikke-kodende RNA’er). Med kombinationen af ​​mRNA og lncRNAs, kan det udføre to eksperimenter på en enkelt microarray og forudsige lncRNA funktion og interaktion med mRNA’er. Analyserne viste et sæt gener, der var differentielt udtrykte mellem mavekræft og normalt væv. Nogle af dem er tidligere blevet rapporteret i gastriske eller andre kræftformer. For eksempel udtryk for gastrokine-2 (GKN2) var signifikant nedreguleret eller fraværende i gastrisk cancer cellelinjer, gastrisk intestinal metaplasi og tumorvæv. Overekspression af GKN2 bidrog til celleproliferation, migration og invasion af mavekræft og anholdt cellecyklus ved G1-S overgangsfase [6]. I modsætning hertil niveauer af ekspression af inhibin beta A (INHBA) var signifikant højere i kræftvæv end i det tilstødende normale slimhinde, og det betragtes som en selvstændig prognostisk faktor i gastrisk kræft [22]. Desuden opdagede vi nogle nye gener, såsom TMEM184A, PSAPL1, KIAA1199, CLRN3 og FNDC1, som ikke er blevet rapporteret i mavekræft tidligere, og deres roller i kræft forbliver ukendt.

En af fordelene ved vores genekspression microarray analyse er, at det repræsenterede ekspressionen af ​​lncRNAs og mRNA’er således at både kunne undersøges sammen. Vores tidligere rapportere om rolle lncRNA H19 og dets netværk i GC [36] var baseret på denne microarray data. de fleste af de lncRNAs såsom DRD5, FMO6P, SNAR-A3 og TPRXL viste imidlertid, i vores microarray ikke er blevet identificeret og har brug for yderligere undersøgelser for at afklare deres roller i mavekræft.

Baseret på vores genekspression profilering data, generne og deres funktioner aktiveres i gastrisk cancer var ansvarlige for proliferation, adhæsion, migrering og metastase, hvilket var i overensstemmelse med resultaterne fra pathway analyser. Interessant opdagede vi, at de fleste af de kræftrelaterede signalveje rapporteret tidligere såsom Notch, mTOR og Hedgehog blev aktiveret i GC baseret på vores data. Disse resultater understøtter det synspunkt, at heterogenitet er karakteristisk for GC. Sammenligning af co-ekspression netværk mellem normale væv og kræft foreslog, at udtrykket, funktioner og vekselvirkninger mellem flertallet af fysiologiske gen gik tabt eller beskadiget på mavekræft, mens spredning, migration og metastase unormalt blev forbedret. Disse interessante resultater matcher egenskaberne for kræft, såsom anaplasia og dedifferentiering. Disse differentielt udtrykte gener involveret i signalveje fungeret som vigtige gener i co-ekspression netværk kan være potentielle mål for anti-cancer terapi eller diagnostiske markører i fremtiden.

Støtte Information

S1 Table. Pathway analyser af differentierede gener

Doi: 10,1371 /journal.pone.0125013.s001

(XLSX)

S2 Table. GO analyser af differentierede gener

Doi: 10,1371 /journal.pone.0125013.s002

(XLSX)

S3 Table. Gene-loven netværk af differentierede gener

Doi: 10,1371 /journal.pone.0125013.s003

(XLSX)

S4 Table. Primere og verifikation

doi: 10,1371 /journal.pone.0125013.s004

(DOCX)

S5 Table. Metoder og materialer

doi: 10,1371 /journal.pone.0125013.s005

(DOCX)

Tak

Vi vil gerne takke Dr. Fred Bogott på Austin Medical Center , University of Minnesota, og Dr. Joshua Liao på Hormel Institute, Austin of Minnesota, for deres engelske redigering af dette manuskript. Vi vil gerne takke de finansieringskilder til støtte for denne undersøgelse. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China [No. 81172324, No. 91229106, nr 81272749, og nr 81372231], Videnskab og Teknologi Kommissionen for Shanghai kommune [No. 13ZR1425600], og de vigtigste projekter i National Science Teknologi Pillar Program Kina (nr 2014BAI09B03).