PLoS ONE: LINE-1 methylering Niveauer i leukocyt DNA og Risiko for Renal Cell Cancer

Abstrakt

Formål

leukocyt globale DNA methylering niveauer er i øjeblikket betragtes som biomarkører for kræft modtagelighed og har blevet associeret med risiko for flere kræftformer. I denne undersøgelse, vi havde til formål at undersøge sammenhængen mellem lange afbrudt nukleare elementer (LINE-1) methylering niveauer, som biomarkør for global DNA methylering i blod celle-DNA, og renal celle kræft risiko.

Eksperimentel Design

LINE-1 methylering af bisulfit omdannet genomisk DNA isoleret fra leukocytter blev kvantificeret ved pyrosekventering målt i tre eksemplarer, og gennemsnittet for 4 CpG sites. I alt 328 RCC tilfælde og 654 kontroller frekvens-matchede (02:01) på alder (± 5 år), køn og studiecenter, fra en stor case-kontrol undersøgelse foretaget i Central- og Østeuropa blev evalueret.

Resultater

Line-1 methylering niveauer signifikant højere i RCC sager med en median på 81,97% (interkvartile interval [IQR]: 80,84-83,47) sammenlignet med 81,67% (IQR: 80,35-83,03) blandt kontroller ( p = 0,003, Wilcoxon). Sammenlignet med den laveste LINE-1 methylering kvartil (Q1), de justerede yderste periferi for at øge methylering kvartiler var som følger: OR (Q2) = 1,84 (1,20-2,81), OR (Q3) = 1,72 (1,11-2,65) og OR ( Q4) = 2,06 (1,34-3,17), med en p-trend = 0,004. Foreningen var stærkere blandt rygere (p-trend 0,001) end tidligere eller aldrig rygere (p-interaktion = 0,03). For at eliminere muligheden for selektionsbias blandt kontroller, forholdet mellem LINE-1 methylering og rygning blev evalueret og bekræftet i en sag, der kun analyser, så godt.

Konklusioner

Højere niveauer af LINE -1 methylering synes at være positivt forbundet med RCC risiko, især blandt rygere. Yderligere undersøgelser ved hjælp af både post- og pre-diagnostisk genomisk DNA berettiget til at bekræfte resultater og vil være nødvendigt at afgøre, om de observerede forskelle ske før, eller som følge af carcinogenese

Henvisning:. Liao LM, Brennan P, van Bemmel DM, Zaridze D, Matveev V, Janout V, et al. (2011) LINE-1 methylering Niveauer i leukocyt DNA og risiko for renalcellecarcinom. PLoS ONE 6 (11): e27361. doi: 10,1371 /journal.pone.0027361

Redaktør: Bernard W. Futscher, The University of Arizona, USA

Modtaget: 27. juni, 2011; Accepteret: 14 Oktober 2011; Udgivet: November 4, 2011

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Intramural Research Program for National Institutes of Health, National Cancer Institute, Division of Cancer Epidemiologi og Genetik (Bethesda , MD, USA). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Region-specifikke hypermethylering og global hypometylering af DNA er forbundet med carcinogenese [1]. Aberrant DNA hypermethylering tendens til at forekomme i CpG-rige promotorregioner og er forbundet med transkriptionel inaktivering af gener, såsom tumorsuppressorgener [2]. I modsætning hertil hele genomet DNA hypometylering forekommer primært i repetitive sekvenser af DNA, såsom heterochromatic regioner og retrotransposoner [3]. Flere undersøgelser har observeret en sammenhæng mellem methylering niveauer af leukocyt DNA og risiko for blære, bryst og tarmkræft [4], [5], [6], [7]. Men sammenhængen mellem globale methylering niveauer og nyrecellecancer (RCC) er endnu ikke blevet evalueret. Salg

Long afbrudt nukleare elementer (LINE-1) er ikke-lang-terminal-repeat (ikke-LTR) retrotransposoner der udgør omkring 17% af det humane genom, med ~500,000 elementer normalt dispergeret gennem det humane genom [3], [8]. LINE-1 elementer er typisk stærkt methylerede i normale væv, mens LINE-1 hypometylering er blevet rapporteret i cancervæv [9]. Kvantificering af CpG methylering inden LINE-1 elementer er en billig high-throughput assay, der har været flittigt brugt som en proxy for global cytosin methylering (5MeC) niveauer [10], [11]. Flere case-kontrol-undersøgelser har antydet, at LINE-1 methylering niveauer, der måles i leukocyt DNA kunne være en potentiel biomarkør for kræft modtagelighed og genomisk ustabilitet; dog er forholdet mellem LINE1 og andre biomarkører for global methylering status som Alu [12] først lige begyndt at blive udforsket i store veldesignede studier af kræft risiko [13], [14], [15], [16]. Desuden relationer mellem methylering niveauer i målvæv og ikke-invasivt indsamlede proxy væv DNA-prøver er heller ikke godt forstået.

Forekomsten af ​​RCC, den mest almindelige malignitet af nyrekræft, varierer på verdensplan [17], med nogle af de højeste satser, der forekommer i Central- og Østeuropa [18], [19]. Cigaretrygning, fedme og forhøjet blodtryk er veletableret risikofaktorer for RCC, men disse udgør kun en anslået 50% af tilfældene [19]. At udforske potentielle indflydelse af global methylering som en risikofaktor for RCC, vi sammenlignet LINE-1 methylering niveauer i leukocyt DNA i en delmængde af RCC sager og kontroller indskrevet i et multi-center case-kontrol undersøgelse. Vi undersøgte potentielle effekt modifikation af fælles kimcellelinjesekvenser polymorfier og kendte RCC risikofaktorer. Endelig

VHL

gen inaktivering i RCC tumorvæv er ofte (op til 91%) observeret.

VHL

ændring, enten gennem promotor hypermethyleringsassocierede eller sekvensændringer, betragtes som en tidlig og hyppig begivenhed i nyre og har været brugt som en biomarkør for renal tumor heterogenitet. Derfor blev LINE-1 methylering niveauer evalueret blandt heterogene case undergrupper til at undersøge, om risikoen for at få en bestemt type af

VHL

ændring i tumor-DNA kan modificeres af globale methylering niveauer i genomisk DNA.

Resultater

et flertal af undersøgelsens deltagere var fra Tjekkiet, med en lidt større andel blandt sager. Tilfælde var mere tilbøjelige end kontroller til at have en højere BMI (p = 0,07) og har en lavere indtag grøntsag (p = 0,01; tabel 1). Udlodning af alder, rygning status og selvrapporteret hypertension var sammenlignelige mellem tilfælde og kontroller.

Brug lineære regressionsmodeller, vi evaluerede bidrag af udvalgte deltager egenskaber hypotese at være forbundet med LINE-1 methylering niveauer blandt kontroller (n = 654; tabel 1). Blandt kontroller, mænd havde statistisk signifikant højere LINE-1 methylering niveauer (median = 81,89%) end kvinder (median = 81,29%; p = 0,0003). Personer, der rapporteres at have forhøjet blodtryk blev også forbundet med statistisk signifikante højere LINE-1 methylering niveauer (median = 82,03%) end dem, der ikke gjorde (median = 81,46%, p = 0,04). En væsentlig forskel mellem centre blev også påvist blandt kontroller (p = 0,01), som vi vil korrigere for i vores modeller. Ingen tydelige tendenser i LINE-1 methylering niveauer ved alder, rygning status, blev der påvist BMI eller grønt indtag blandt kontroller. Fordelingen af ​​LINE-1% 5MeC blandt sager er også i tabel 1 til sammenligning

Samlet set median LINE-1 methylering niveauer signifikant højere i RCC sager 81,97%. (Interkvartile område: 80,84-83,47) sammenlignet til 81,67% (interkvartile område: 80,35-83,03) blandt kontroller (p = 0,003, Wilcoxon, tabel 1). Sammenlignet med personer i den laveste LINE-1 methylering kvartil blev individer i den højeste kvartil forbundet med en 2-fold øget risiko for RCC (p for trend = 0,004; tabel 2). Den justerede OR for RCC i forbindelse med en stigning i den samlede LINE-1 methylering 1% var 1,10 (95% CI: 1,03-1,19; p = 0,008). Methylering varieret lidt over hver af de fire bindingssteder for CpG sekventerede, med den laveste median% 5MeC observeret ved den fjerde locus (median på tilfælde: 78,4%, kontrol: 78,2%) og de højeste niveauer på første locus (median på tilfælde: 85,4 %, kontrollerer: 84,8%). Sammenlignet med kontroller, sager havde statistisk signifikant højere% 5MeC ved hvert locus (p-værdier fra dog blev lignende opadgående tendenser observeret ved de andre tre loci (locus 2: OR = 1,07, 95% CI: 0,99-1,14; locus 3: OR = 1,06, 95% CI: 1,00-1,13; locus 4: OR = 1,05, 95% CI: 0,99-1,11)

i analyser stratificeret ved at ryge status, den øgede risiko med den højeste LINE-1% 5MeC kvartil (Q4) var mere udtalt blandt rygere (OR

Q4 = 6,48, 95% CI: 2,68-15,67; p-trend 0,0001) end blandt tidligere eller aldrig rygere (p-interaktion = 0,03; figur 1). En positiv association med RCC risiko blev ligeledes begrænset til rygere tværs individuel loci (tabel S1). For yderligere at undersøge samspillet mellem rygning og høj LINE-1% 5MeC (Q2-Q4), gennemførte vi en sag kun analyse for at sikre, at foreningen ikke skyldtes en kontrol serie, der ikke var repræsentativ for studiepopulationen med hensyn til rygning status. Sammenlignet med RCC sager, der var aldrig rygere, blev positive afvigelser fra multiplikativitet observeret for RCC sager, der var enten tidligere (IOR = 1,83, 95% CI: 0,69-4,83) eller nuværende rygere (IOR = 2,47, 95% CI: 0,91-6,70 ; p-trend = 0,06). Dette tyder på, at forholdet mellem øget global methylering og RCC er stærkere blandt rygere end aldrig rygere. I begge analyser, rygning status og LINE-1 methylering niveauer syntes at ændre bidrag anden risikofaktor. Yderligere stratificerede analyser efter køn, BMI, grønt indtag, og selvrapporteret hypertension medførte ikke nogen signifikante forskelle (data ikke vist).

Odds ratio og 95% konfidensintervaller for sammenhængen mellem LINE-1 methylering niveauer og RCC, justeret for køn, alder, center, BMI, forhøjet blodtryk og grønt.

for at vurdere, om fælles variation i udvalgte gener involveret i en-carbon og tobak stofskifte ændret den observerede association gennemførte vi stratificerede analyser af syv funktionelle varianter i fem gener (

MTHFR, MTR, Tyms, GSTM1

og

GSTTI

). To genetiske varianter,

MTHFR

c.1298A C og

MTR c.2756A G,

syntes at påvirke sammenhængen mellem LINE-1 methylering niveauer og RCC risiko (tabel 3). Vi observerede en stærk positiv tendens mellem LINE-1 methylering kvartiler og RCC risiko blandt dem, der udføres mindst én kopi af C mindre allel af

MTHFR

c.1298A C (p-trend = 0,0009; p- interaktion = 0,15). Øget risiko med højere niveauer af LINE-1 methylering var begrænset til dem med AA-genotypen af ​​

MTR c.2756A G

(p-trend = 0,004; p-interaktion = 0,19) og ikke var signifikant blandt dem bærer mindst én kopi af den mindre allel. Ingen af ​​disse varianter viste statistisk signifikante vigtigste virkninger, som tidligere er blevet offentliggjort [20].

Fordi

VHL

gen inaktivering er en hyppig tidlig begivenhed i RCC, som er blevet brugt til at definere molekylære undergrupper af renal kræftformer [21], vi udforsket, om global methylering var forbundet med en bestemt delmængde af RCC sager defineret af den mekanisme, gennem hvilken

VHL

gen inaktivering i tumor DNA opstår. Vi definerede RCC undergrupper som havende

VHL

gen inaktivering via epigenetiske mekanismer (promoter hypermethylering), genetiske mekanismer (ændringer i kodende sekvens, der ville resultere i en ændret protein (dvs. missense mutationer, sletninger, indsættelser, splejsningssite mutationer) eller vildtype tumorer (dem uden observerbare

VHL

inaktivering). Blandt en delmængde af RCC sager, som var tilgængelige på data

VHL

promotor methylering eller genetisk ændring status i somatisk væv (n = 144 ), risikoen for at få en ændring i

VHL

steg med stigende kvartiler af methylering (OR

Q2 = 1,26, 95% CI: 0,34-4,64; OR

Q3 = 1,62, 95% CI : 0,42-6,18 og OR

Q4 = 2,57, 95% CI:.. 0,68-9,72; p-trend = 0,12) Selvom der er behov suggestive, flere tilfælde fuldt ud at evaluere denne forening

diskussion

Denne undersøgelse vurderede rolle LINE-1 methylering i perifert blod DNA som en proxy for global methylering i renal tumorvæv. i vores undersøgelse, højere LINE-1% 5MeC var forbundet med en øget risiko for RCC. Højere LINE-1% 5MeC niveauer syntes at være en stærkere risikofaktor for udvikling af RCC i rygere end i tidligere eller aldrig rygere. Hertil kommer, resultater fra vores undersøgelse tyder på en mulig interaktion mellem LINE-1 methylering og

MTHFR

c.1298A Cand

MTR c.2756A . G

med RCC

foreningen vi observerede i kontrast til, hvad der er blevet observeret i andre kræft epidemiologiske undersøgelser. Global DNA hypometylering i tumorvæv har længe været observeret, men varierer meget inden for og mellem forskellige typer af kræft [7], [22]. Global DNA hypometylering af leukocyt-DNA, målt ved% 5MeC indhold, har været forbundet med øget risiko kræft i flere nylige tilfælde-kontrol-studier, herunder en stor case-kontrol studie af blærekræft [4], [6], [7]. I flere tilfælde-kontrol studier, har lavere niveauer af LINE-1 blevet associeret med øget risiko for testikelkræft tumorer [14], og gastrisk [13], hoved og hals [16], og blærekræft [15]. Men en lille undersøgelse for brystkræft fandt ingen forskel i% 5MeC LINE-1 niveauer mellem cases og kontroller, men en betydeligt lavere% 5MeC niveauer blandt sager [5]. Denne samme undersøgelse bemærkede også, at niveauet af% 5MeC og% 5MeC LINE-1 (begge målt i leukocyt DNA) ikke korrelerer godt [5].

er tilgængelige på konsekvenserne af den globale DNA methylering niveauer i begrænsede data renale tumorer og er vanskelige at sammenligne på grund af forskellige metoder til vurdering af methylering. Så vidt vi ved, data er ikke tilgængelige på sammenhængen mellem globale methylering status i serum og nyrevæv. Blandt promoter methylering studier, en undersøgelse rapporterede, at promotor methylering tilstand af

Wnt

gener målt i serum generelt matches af tilsvarende renale tumorprøver [23], mens andelen af ​​sager, hvor promotor methylering af specifikke cancer-relaterede gener påvist i serum matches med methylering af den samme markør i tumorer varierede fra 0 til 60% [24]. Enkelte studier har registreret øget global methylering i RCC væv. Arai et al. rapporterede, at genom-dækkende DNA methylering profiler, herunder Global hypermethylering, bestemt ud fra tilstødende normale nyrevæv var stærkt forbundet med aggressivitet af den tilsvarende RCC [25]. En lille undersøgelse af Minardi et al. konstateret en betydelig stigning i den globale methylering i tumorvæv med stigende grad af RCC [26]. To eksperimentelle undersøgelser har beskrevet

LINE

-1 methylering status i RCC vævsprøver. Chalitchagorn et al. viste, at LINE-1 methylering varierede betydeligt mellem forskellige vævstyper, men ikke observeret nogen forskel i

LINE

-1 hypometylering niveauer mellem RCC og nyrevævet [9]. En anden undersøgelse observeret et fravær af hypometylering af LINE-1-sekvenser på tværs af forskellige stadier og kvaliteter af RCC, som var i modsætning til andre urothelial karcinomer [27]. Samlet set viser disse undersøgelser antyder, at RCC kan mangle den typiske association med DNA-methylering observeret i andre cancere; Men i betragtning af varierende vurderingsmetoder anvendes, er der behov for yderligere undersøgelser.

Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse for at finde en forening med højere snarere end lavere LINE-1 methylering niveauer (målt i leukocyt DNA) og risikoen for kræft. Phokaew et al. observerede sporadiske forekomster af hypermethylering i LINE-1 loci blandt kræft cellelinjer [28]. Specifik hypermethylering af LINE-1 er også blevet rapporteret i den unormale overvækst og differentiering af placenta væv [29]. Selvom LINE-1 methylering niveauer forventes at give en hurtig og nem vurdering af globale methylering, er kun en tredjedel af genomisk DNA-methylering skønnes at forekomme i repetitive elementer [11]. Det er også muligt, at RCC har en usædvanlig forhold til methylering inden repetitive elementer i forhold til andre former for kræft. Endelig indtil vores resultater replikeres der også stadig den mulighed, at foreningen vi observeret kunne skyldes tilfældigheder. Den observerede association vises noget robust og konsistent på tværs af vores analyser tyder på, at disse resultater ikke var skyldes tilfældigheder; Men denne konklusion kræver replikation i en anden undersøgelse befolkning.

I vores evaluering af indikatorer for LINE-1 methylering niveauer i leukocyt DNA, køn var den eneste egenskab, som var stærkt forbundet med variation i niveauer. Hannerne havde signifikant højere LINE-1 methylering niveauer end hunnerne, hvilket er i overensstemmelse med andre undersøgelser [14], [15], [16], [30], [31], [32], [33]. Self-reported hypertension var også forbundet med højere LINE-1 methylering niveauer, men er ikke tidligere blevet evalueret i publicerede undersøgelser. Alder er generelt anses for at være omvendt forbundet med øget global methylering [34]; Men alder var ikke korreleret med LINE-1 methylering niveauer i vores undersøgelse eller i flere tidligere undersøgelser [9], [16], [31], [32], [35], [36]. Rygning har været forbundet med både promoter hypermethylering og genomisk hypometylering i tumor-DNA [16], [37]. Men vi ikke observere en sammenhæng mellem rygning status og LINE-1 methylering niveauer i leukocyt DNA, hvilket er i overensstemmelse med resultater fra andre undersøgelser [15], [16], [31], [32]. Den manglende sammenhæng mellem LINE-1 methylering niveauer i blodet med forskellige karakteristika i vores undersøgelse var generelt svarer til, hvad der er blevet observeret i andre studier; dog skal det bemærkes, at vores kontrol ikke kan være repræsentativ, da de var hospitals-baserede kontroller.

Rygning tidligere er blevet knyttet til de globale methylering niveauer i tumorvæv [16], [37]. Baseret på data fra vores undersøgelse og andre, men der synes ikke at være en veldefineret forhold med hensyn til genomisk DNA isoleret fra blod [15], [16], [31], [32]. I betragtning af de modstridende data om sammenhængen mellem rygning og methylering niveauer, er det muligt, at virkningen af ​​rygning carcinogener på status for methylering kan være forskellig for forskellige vævstyper. I vores data, at risikoen forbundet med højere% 5MeC af LINE-1 ser ud til at blive styrket i de nuværende rygere, hvilket tyder på en interaktion mellem rygning og LINE-1 hypermethylering. Det skal bemærkes, at tidligere rapporter fra denne undersøgelse population ikke har overholdt en rygning hovedvirkning, formentlig på grund af en vis kilde til kontrol selektionsbias [38]. Men vi gjorde opmærksom på, at blandt de tre højeste kvartiler af LINE-1, blev aktuel rygning forbundet med en stigning i RCC risiko sammenlignet med aldrig rygere. At beskæftige sig med forspændingen, vi gennemført en case-kun analyse, som minimerer enhver potentiel selektionsbias fra brugen af ​​hospitals-baserede kontroller. Disse resultater blandt sager var ens og bekræftede, at de nuværende rygere, der er stærkt methylerede inden LINE-1 har en højere risiko for RCC end aldrig rygere, der er stærkt methylerede. Flere potentielle mekanismer for, hvordan rygning påvirker DNA methylering status eksisterer, såsom indirekte gennem øget systemisk inflammation eller dobbelt streng-break skade, eller direkte gennem ændret ekspression af DNA metyltransferaser, men den nøjagtige mekanisme er dårligt forstået [39].

Som gener involveret i én-carbon-metabolisme er blevet forbundet med globale methylering niveauer og RCC, gennemførte vi sonderende analyser brug af foreliggende genotypedata at vurdere, om polymorfismer modificeret associationen mellem LINE-1 methylering niveauer og RCC risiko. I den foreliggende undersøgelse, resultater fra to genetiske varianter

MTHFR

c.1298A Cand

MTR c.2756A G

var uanstændige. Andre undersøgelser af global methylering og kræft har ikke observeret nogen mærkbare forskelle i risiko kræft ved disse varianter [4], [13], [15].

Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse for at evaluere LINE- 1 methylering niveauer i leukocyt DNA og risiko for RCC. Selv om en delmængde af det fulde case-kontrol undersøgelse blev valgt, denne undersøgelse har tilstrækkelig statistisk styrke til at påvise foreninger og de var ikke anderledes for gruppen som helhed. En begrænsning er, at denne case-kontrol undersøgelse omfattede hospital-baserede kontroller og DNA fra sager blev indsamlet før behandling endnu post-diagnose. Vi har ikke afsløre væsentlige forskelle i LINE-1 methylering niveauer ved sygdomsgrupper blandt kontroller, eller ved scenen og kvalitet af sager. Dette antyder, at sygdomsprogression er mindre tilbøjelige til at have påvirket vores resultater. Sagen kun analyse gennemført, elimineret den potentielle selektionsbias, der opstår ved brug af hospitals-baserede kontroller, og støttet foreningen observeret i den lagdelte analyse. Selvom LINE-1 methylering niveauer anses for at være en proxy for den globale DNA methylering samlet, de to foranstaltninger er ikke helt udskiftelige og kan måle forskellige aspekter af global methylering. Uanset hvad, har mange undersøgelser vist, at brugen af ​​LINE-1 methylering niveauer i blodet kan give en nyttig markør for sygdom og ville tilbyde en enkel, noninvasiv metode til at identificere personer med risiko for RCC.

Sammenfattende vores resultater tyder på, at LINE-1 methylering niveauer i leukocyt DNA er positivt forbundet med risiko for RCC og kan tjene som en biomarkør for RCC modtagelighed. Undersøgelse af, om den globale methylering i genomisk DNA afspejler epigenetiske ændringer i nyrevæv er nødvendigt yderligere at fremkalde rolle epigenetik og RCC. For at løse disse spørgsmål, vil fremtidige undersøgelser i prospektivt indsamlede DNA-prøver være nødvendigt, samt undersøgelser designet til at løse den tilsyneladende samspil mellem methylering status og tobaksrygning relateret til RCC risiko.

Materialer og Metoder

Etik Statement

undersøgelsen protokol den blev godkendt af relevante etiske komitéer og institutionelle anmeldelse bestyrelser alle deltagende centre, det Internationale Agentur for kræftforskning (IARC), og det amerikanske National Cancer Institute (NCI) i US National Institutes of Health. Alle forsøgspersoner og deres læger forudsat skriftligt informeret samtykke.

Undersøgelse Befolkning

De central- og østeuropæiske Renal Cancer Study (CEERCC) er et hospital-baseret case-kontrol undersøgelse af nyrekræft (1097 tilfælde og 1.555 kontroller), som blev gennemført i syv centre i Øst- og Centraleuropa (Moskva, Rusland; Bukarest, Rumænien, Lodz, Polen og Prag, Olomouc, Ceske Budejovice og Brno, Tjekkiet). Studiepopulationen er tidligere blevet beskrevet [40]. Kort fortalt nydiagnosticerede og histologisk bekræftet tilfælde af nyrekræft, men ikke nyrebækken (ICD-0-2 kode C64) i alderen 20 og 79 år blev rekrutteret fra 1999 gennem 2003. Uddannet medicinsk personale anmeldt medicinske journaler og ekstraheres oplysninger om dato og en fremgangsmåde til diagnosticering, histologisk klassificering, tumor stadium og kvalitet. Støtteberettigede kontroller blev valgt fra patienter indlagt på samme hospital som sager for forhold relateret til rygning eller urogenitale sygdomme (undtagen for benign prostatahyperplasi) og var frekvens-matchede til sager om alder, køn, og studiecenter. Ingen enkelt sygdom består mere end 20% af kontrolgruppen. Alle rekrutteret tilfælde og kontrol var kaukasisk. Responsrater på hvert center varierede fra 90,0 til 98,6% for sager og 90,3-96,1% for kontrol. Standardiserede livsstil og mad frekvens spørgeskemaer blev administreret i person af uddannet personale [38], [41].

Blodprøver blev opsamlet og opbevaret ved -80 ° C og efterfølgende sendes til National Cancer Institute (NCI). Genomisk DNA blev ekstraheret fra fibrinlag ved standard phenol chloroform-fremgangsmåden ved NCI laboratoriet. For at evaluere den globale methylering, valgte vi en delmængde af RCC sager og kontroller med en stor mængde tilgængelige DNA (≥10 mg) og data om

VHL

status ved hjælp af følgende matchende kriterier. Kontroller blev tilfældigt udvalgt og frekvens-matchede (2:1) på alder (± 5 år), køn og studiecenter (om muligt) for at opnå tilstrækkelig effekt (90% for at detektere en mindre på 1,80). Alle emner i denne undersøgelse forudsat skriftligt informeret samtykke. Denne undersøgelse blev godkendt af de institutionelle anmeldelse bestyrelser på NCI, Internationale agentur for kræftforskning (IARC), og hver deltagende center.

Genotypning

genotypebestemmelse blev udført ved NCI Core Genotypebestemmelse Facility . Følgende funktionelle enkelt nukleotid polymorfier (SNP) inden tre gener blev behandlet i denne undersøgelse på grund af deres rolle i at yde forstadier nødvendige for DNA-syntese og reparation, samt DNA methylering: 5,10 methylentetrahydrofolat reduktase (

MTHFR

; c.1298A C,

c.677C T)

, 5-methyltetrahydrofolate-homocystein methyltransferase (

MTR, c.2756A G

), og thymidylatsyntetase (

Tyms ; Ex8 + 157C T, Ex8 + 227A G

). Glutathion S-transferase mu 1 (

GSTM1

) og glutathion S-transferase theta 1 (

GSTT1

) sletninger blev også udvalgt på grund af tidligere foreninger med risiko for RCC og deres rolle i fase II stofskifte . Specifikke eksperimentelle metoder er blevet beskrevet tidligere (https://snp500cancer.nci.nih.gov) [20], [42].

Kvantificering af LINE-1 methylering Niveauer

LINE-1 methylering niveauer blev kvantificeret ved anvendelse af en pyrosekventering assay ved EpigenDx (Worcester, MA) [43], [44], [45]. Vores analyse er designet til at undersøge status for methylering på fire CpG steder i promoteren af ​​LINE-1 region (GenBank #: M80343, -605, -593, -590 og -583 bp fra ATG af ORF1) [16], [46]. Kort fortalt, 500 ng af leukocyt DNA blev bisulfat behandlede og oprenset ved anvendelse af Zymo DNA-methylering Kit (Zymo forskning, Orange, CA). Bisulfat behandlede DNA blev oprenset og elueret i 20 pi elueringspuffer. Hver 50 pi PCR indeholdt 10X PCR-buffer, 3,0 mM MgCl

2, 200 uM dNTP’er, 0,2 uM primere, 1,25 U DNA-polymerase (Hotstar, Qiagen Inc., Alameda, CA) 1,25 U, og ~ 10 ng bisulfit omdannede DNA . Polymerasen blev aktiveret ved inkubering ved 95 ° C i 10 minutter efterfulgt af 34 cykler ved 95 ° C for 15sec, 45 ° C i 30 sek og 72 ° C i 30 sek. Reaktionen fik derefter lov til at udvide i 5 minutter ved 72 ° C. En universel biotinyleret primer blev anvendt i den første PCR-reaktion for at muliggøre isolering af amplikonet, efterfulgt af denaturering og frigivelse af en enkelt streng produkt til pyrosekventering [47]. PCR-produkter (10 pi) blev sekventeret ved anvendelse af Pyrosequencing PSQ96 HS System (Pyrosequencing Qiagen) ifølge producentens instruktioner (Pyrosequencing Qiagen). Status for methylering ved hver af 4 loci blev analyseret individuelt som et T /C SNP hjælp QCpG software (Pyrosequencing Qiagen). Methylering status på alle fire loci midles sammen for at give en samlet procent 5MeC status. En prøve pyrogram indgår som supplerende data (Figur S1). Procent DNA methylering inden LINE-1 blev målt i tre eksemplarer.

Statistiske Analyser

Tredobbelte LINE-1 5MeC målinger blev gennemsnit sammen. Individuelle kørsler med 7,5% bisulfit uomdannede cytosin værdier og prøver med en variationskoefficient (CV) 10% blev udelukket fra vores analyser (n = 19). Vi har udført en følsomhedsanalyse, udelukke personer med CV 5%. Denne udelukkelse resulterede ikke i en signifikant forskel i risikoestimater med mindst 10% og dermed disse patienter forblev i analyserne. Efter disse undtagelser, var tilgængelige på 982 prøver (328 RCC tilfælde og 654 kontroller) data. Forskelle mellem cases og kontroller blev testet for signifikans ved hjælp af Wilcoxon signed rank test. For at identificere potentielle determinanter for LINE-1 methylering niveauer, og /eller faktorer, der kan ændre sammenhængen mellem LINE-1 methylering niveauer og renal kræftrisiko blev lineære regressionsmodeller anvendt til at evaluere forskelle blandt kontroller i relation til udvalgte egenskaber. Fordelingen af ​​LINE-1 gennemsnitlig% 5MeC blandt kontroller blev anvendt til at bestemme cut point for kvartiler. For at vurdere sammenhængen mellem LINE-1 methylering niveauer og RCC, logistiske regressionsmodeller, korrigeret for de matchende faktorer, status tobak, BMI, grønt indtag og selvrapporteret hypertension, blev anvendt til at estimere odds ratio (OR) og 95% konfidensintervaller (95% CI). Tests for trend blev beregnet ved at modellere en variabel kodet 0, 1, 2 og 3 for hver kvartil. Vi har også modelleret LINE-1 som en kontinuerlig værdi. For at evaluere potentielle effekt modifikation af LINE-1 methylering, stratificerede analyser ved at ryge status, køn, BMI, grønt indtag, selvrapporteret hypertension og udvalgte SNP’er blev gennemført. Fælles funktionelle varianter inden

MTHFR, MTR, Tyms, GSTM1

og

GSTT1

blev evalueret for association med LINE-1 methylering. Den homozygote store allel blev kodet som referent gruppe og de heterozygote og homozygote mindre allel genotyper blev kombineret sammen på grund af et lille antal forsøgspersoner homozygote for de mindre alleler. En sag, der kun analyse vurdere samspillet mellem rygning og LINE-1 methylering niveauer blev også udført for at give et skøn over effektmodifikation (interaktion ELLER: IOR), som ikke ville blive påvirket af valg fordomme blandt vores kontrol. De IORs repræsenterer afgang af det fælles effekt af rygning og LINE-1 methylering fra den, der forventes under en multiplikativ model på RCC risiko. Alle analyser blev udført ved anvendelse af SAS-version 9.1. (SAS Institute, Cary, NC).

Støtte Information

figur S1. Salg Sample pyrogram demonstrerer LINE-1 methylering niveauer.

doi: 10,1371 /journal.pone.0027361.s001

(DOC)

tabel S1. Salg Stratificerede Analyser ved rygning status og individuel LINE-1 positionen. Odds ratio og 95% konfidensintervaller for sammenhængen mellem LINE-1 methylering niveauer og RCC, justeret for køn, alder, center, BMI, forhøjet blodtryk og grønt

Doi:. 10,1371 /journal.pone.0027361.s002 Hotel (DOC)