PLoS ONE: Transkriptomet Profiler af Carcinoma-in-situ og invasive ikke-småcellet lungekræft, som afsløret af SAGE

Abstrakt

Baggrund

Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) præsenterer som en progressiv sygdom spænder præcancerøse, preinvasive, lokalt invasive og metastatiske læsioner. Identifikation af biologiske veje reflekterende af disse progressive stadier, og afvigende udtrykte gener forbundet med disse veje, vil tænkes forbedre terapeutiske tilgange til denne ødelæggende sygdom. Salg

Metode /vigtigste resultater

Gennem konstruktion og analyse af SAGE biblioteker, har vi bestemt transkriptom profiler til preinvasive carcinoma-in-situ (CIS) og invasive pladecellekræft (SCC) i lunge, og sammenlignet disse med udtryk profiler genereret fra både bronkieepitel, og præcancer metaplastisk og dysplastiske læsioner ved hjælp af

Ingenuity Pathway analyser

. Ekspression af gener, der er forbundet med epidermal udvikling, og tab af ekspression af gener, der er forbundet med mucociliære biologi, er fremherskende elementer i CIS, stort set deles med forstadier til kræft. Derudover ekspression af gener, der er forbundet med miljøfremmede stofskifte /afgiftning er en bemærkelsesværdig funktion i CIS, og er i vid udstrækning opretholdt i invasiv cancer. Gener relateret til væv fibrose og akutte fase immunrespons er karakteristiske for den invasive SCC fænotype. Desuden data præsenteres her tyder på, at væv remodeling /fibrose indledes i de tidlige stadier af CIS. Desuden er denne undersøgelse viser, at ændring i kopi-nummer status repræsenterer en plausibel mekanisme for differentieret genekspression i CIS og invasive SCC.

Konklusioner /Betydning

Denne undersøgelse er den første rapport af stor- skalere ekspression profilering af CIS af lungen. Uvildige udtryk profilering af disse preinvasive og invasive læsioner giver en platform for yderligere undersøgelser af molekylærgenetiske begivenheder relevante for tidlige stadier af skællede NSCLC udvikling. Derudover up-regulerede gener opdaget ved ekstreme forskelle mellem CIS og invasiv cancer kan have potentiale til at fungere som biomarkører for tidlig påvisning

Henvisning:. Lonergan KM, Chari R, Coe BP, Wilson IM, Tsao MS, Ng RT, et al. (2010) Transkriptomet Profiler af Carcinoma-in-situ og invasive ikke-småcellet lungekræft, som afsløret af SAGE. PLoS ONE 5 (2): e9162. doi: 10,1371 /journal.pone.0009162

Redaktør: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, USA

Modtaget: Oktober 4, 2009; Accepteret: 7 januar 2010; Publiceret: 11 feb 2010

Copyright: © 2010 Lonergan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af midler fra Genome Canada /Genome British Columbia, canadiske Cancer Society Research Institute (CCS # 20485) og den canadiske Institutes of Health Canada (MOP200113 og MOP 86.731). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft skønnes at påføre den højeste kræft dødelighed i USA i 2009 [1]. Molekylær målrettede terapier rettet mod signaltransduktionsveje aktive i cellulær proliferation, differentiering, apoptose, og angiogenese, er blevet anvendt til behandling af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), men med varieret og ofte skuffende resultater [2], [ ,,,0],3], [4], [5], [6]. Som den samtidige målretning af multiple signalveje har vist forbedringer i kliniske respons [6], yderligere kendskab til biologiske veje er involveret i udvikling lungecancer, sammen med identifikation af afvigende udtrykte gener i disse pathways, ville forventes at lette udviklingen af ​​hidtil ukendte terapeutisk intervention [7], [8].

Carcinoma-in-situ (CIS) i lungerne, er preinvasive læsioner af skællede NSCLC, ofte forbundet med histologiske, cytologiske, og genetiske afvigelser, og progression til invasiv cancer typisk ensues [9], [10], [11], [12]. Da disse minut læsioner er optimalt synlige i de centrale luftveje ved fluorescerende bronkoskopi eller LIFE (lunge-imaging fluorescerende endoskopi) [13], [14], eksperimentelle og kliniske studier er sjældne (figur 1). Selv om mange udtryk profilering undersøgelser er blevet rapporteret for avancerede fase lungetumorer [15], [16], tidlig fase (CIS og lokalt invasive) læsioner stort set uudforsket. Molekylær genetisk analyse af preinvasive læsioner, fri for baggrundsstøj i forbindelse med almindeligt studerede avancerede tumorer, er afgørende for at identificere vigtige gener og tilsvarende molekylære veje underliggende tidlige begivenheder i neoplastisk transformation og kræft udvikling. En forståelse af disse tidlige aberrationer er afgørende for hurtig terapeutisk intervention for denne ødelæggende sygdom.

bronkoskopi hjælp A. hvidt lys til detektion af CIS-læsioner (angivet med pil), eller B. LIFE (lunge-forestille fluorescerende endoskopi ) til detektion af CIS læsioner (angivet med pil). C. Histologisk sektion identificerer en CIS læsion i bronkieepitel, præget af omfattende skællede lagdeling.

Storstilet genekspressionsstudier ofte anvender microarray teknologi. Nylige undersøgelser understreger værdien af ​​skræddersyede arrays, med target udvælgelse baseres på forudgående kendskab til genekspression, mere nøjagtigt at afspejle transkriptomet af vævet af interesse; specifikt anvendes til studiet af NSCLC [17]. SAGE (serial analyse af genekspression) tilbyder en sekvens-baseret, ikke-forspændt tilgang til omfattende transkriptom analyse, med ingen forudgående kendskab til ekspression kræves [18]. Desuden oplysninger indhentet fra SAGE analyse potentielt bidrager til udformning af mere hensigtsmæssige mikroarrays for målrettet forskning og diagnostiske formål.

I en tidligere undersøgelse, beskrev vi de transcriptomes af røg-beskadigede bronkieepitel og lungeparenkym via SAGE [19]. Her udvide vi vores analyse til det uudforskede preinvasive stadie i udviklingen lungekræft, og præsentere den første rapport af store udtryk profilering af carcinoma-in-situ af lungen. Derudover beskriver vi transcriptomes for invasiv pladecellekræft (SCC), og præcancer metaplastisk og dysplastiske (PC) læsioner, der er afledt af konstruktion og analyse af flere SAGE biblioteker, der kulminerede i mere end 22 megabaser af sekvens information. Gennem udnyttelse af

Ingenuity Pathway Analyse

, vi har identificeret gener, der er forbundet med epidermal udvikling og miljøfremmede metabolisme /afgiftning som dele af SNG-læsioner, og gener, der er forbundet med immunrespons og væv remodeling /fibrose som bestanddele af invasive SCC. Derudover fandt vi gener forbundet med mukociliær differentiering skal nedreguleret i både CIS og PC læsioner. Vi diskuterer de potentielle relevans af disse transkriptionelle afvigelser til de tidlige stadier af udvikling lungekræft, og præsentere en visning af CIS transkriptomet hidtil ukendt.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Denne undersøgelse blev godkendt af University of British Columbia-British Columbia Cancer Agency Research Ethics Board (UBC-BCCA REB). Skriftligt samtykke blev opnået fra alle fag.

Prøver

bronchieepithelceller (BE) børstning prøver blev beskrevet tidligere [19]. Biopsiprøver inkluderet præcancerøse (PC) læsioner (metaplasi, dysplasi), carcinoma in situ (CIS) læsioner, og invasiv pladecellecarcinom (SCC) tumorvæv. PC og CIS prøver blev opnået ved autofluorescerende bronkoskopi (figur 1). Alle biopsier (undtagen dem, der anvendes i konstruktion af biblioteker cis-3, SCC-5, og SCC-6) blev opsamlet i RNA

senere

® [Applied Biosystems (Ambion Inc., Canada)] og opbevaret ved – 85 ° C. Biopsi anvendes i konstruktion af biblioteket CIS-3 blev indlejret i OCT medium og opbevaret ved -85 ° C. Til konstruktion af biblioteker SCC-5 og SCC-6, blev RNA isoleret fra tumorvæv fra otte individer efter guanidiumisothiocyanat og phenol /chloroform ekstraktion. Alle emner, der bidrager til denne undersøgelse var enten tidligere eller nuværende rygere (tabel 1).

SAGE bibliotek konstruktion og sekvens behandling

Med undtagelse af konstruktionen af ​​biblioteker SCC-5 og SCC -6, hver prøve (biopsi eller bronkial børstning som tidligere beskrevet [19]) blev hentet fra RNA

senere

® (eller OLT for biblioteket CIS-3), og homogeniseres i lysis /binding opløsning. For biblioteker SCC-5 og SCC-6 blev RNA poolet fra fire eksemplarer i tilsvarende mængde, og ~19 ug af total RNA blev nedsænket i lysis /binding opløsning og anvendes til fremstilling af hvert bibliotek. De resulterende lysater blev anvendt direkte til SAGE bibliotek konstruktion ifølge MicroSAGE protokol, med

NLA

III som forankringsdelen enzym og

Bsm

FI som tagging enzym (www.ncbi.gov/SAGE ). Denne fremgangsmåde viste sig at give meget reproducerbare SAGE biblioteker [19]. I gennemsnit, 10

5 SAGE tags, undtagen linker og duplikere ditags’ene, blev sekventeret per bibliotek; alle rå SAGE data er blevet deponeret hos GEO (tabel 1). For normalisering blev tag tæller skaleret til 10

6 tags for hvert bibliotek, dvs som tags per million (TPM).

Cluster analyse

For at vurdere graden af ​​lighed mellem lungen SAGE-biblioteker dannet i denne undersøgelse (to PC biblioteker, fem CIS biblioteker og seks invasive SCC biblioteker) og dem, der genereres i en tidligere undersøgelse (14 BE biblioteker og to lungeparenkym biblioteker), blev anvendt klyngeanalyse. Til denne analyse blev de 300 mest rigelige tags bevaret fra hvert bibliotek, hvilket giver en flettet liste over 1128 unikke tags. Dataene blev derefter logge

10 transformeret og grupperet med

Genesis

, ved hjælp af en gennemsnitlig-kobling algoritme og en Euklidisk afstand metrisk [20]. For tags med tællinger af nul, blev dataene ikke transformerede, og blev bevaret som nul.

Differentiel ekspressionsanalyse

Medmindre andet er angivet, blev differentiel genekspression defineret af en minimal tre-fold forskel (afrundet til en decimal) i de gennemsnitlige normaliserede tag tæller (TPM) mellem to datasæt, der sammenlignes. Desuden blev en minimal gennemsnitlig normaliseret tag optælling af 40 TPM kræves i overudtrykkende datasæt. Tag-til-gen-kortlægning blev i henhold til SAGE Genie databasen, den 17. september, 2009-version [21] (cgap.nci.nih.gov/SAGE). Som den nyeste udgivelse af SAGE Genie ikke automatisk tilpasse til mitokondrie udskrifter, vi udnyttet en manuel kortlægning tilgang til at identificere disse udskrifter.

Dataanalyse

datasæt differentielt udtrykte gener blev analyseret primært gennem brug af

Ingenuity Pathway Analyse

(IPA), version 8.0 (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).

Funktionel analyse af hele datasæt

identificerede de biologiske funktioner og /eller sygdomme, der var mest betydningsfulde til datasættet. Gener fra datasæt, som var forbundet med biologiske funktioner og /eller sygdomme i Ingenuity Pathways Knowledge Base blev anset for analysen (IPA berettiget kortlagt id’er).

Canonical pathway analyse af hele datasæt

identificerede veje fra IPA bibliotek af kanoniske veje, der var mest væsentlige for datasæt, baseret på gener i datasættet, der var forbundet med en kanonisk vej hos opfindsomhed Pathways Knowledge Base.

Toksicitet liste analyse af hele datasæt

identificerede de Tox lister fra IPA bibliotek af Tox lister, der var mest betydningsfulde til datasættet. Gener fra datasæt, som var forbundet med en liste blev anset for analysen. For hver af disse analyser, betydningen af ​​sammenhængen mellem generne i datasættet og den tildelte biologiske funktion og /eller sygdom /kanonisk vej /toksicitet liste, blev målt ved Fischers eksakte test for at beregne en p-værdi til at bestemme sandsynligheden for, at foreningen blev forklaret ved en tilfældighed alene.

Mine Veje

er en grafisk repræsentation af de biologiske sammenhænge mellem genprodukter, som understøttes af mindst en reference fra litteraturen, fra en lærebog, eller fra kanonisk information lagret i opfindsomhed Pathways Knowledge Base. Gener vises ved hjælp af forskellige former, der repræsenterer den funktionelle gruppe af genet produkt som angivet i legenden inden for de specifikke tal.

RNA isoleret fra kliniske prøver

For kvantitativ RT-PCR-analyse, RNA matched tumor og normal lungeparenkym blev indsamlet fra resekterede væv. Kort fortalt blev flere sektioner af hver tumor skåret, med den første og sidste i en serie farvet med H tiltrædelse GSE3708), der genereres i en tidligere undersøgelse [19 ], [37], blev analyseret af klyngeanalyse hjælp af en gennemsnitlig-kobling algoritme. De øverste 300 mest rigelige tags blev bevaret fra hvert bibliotek, og analyse blev baseret på 1128 unikke tags i alt. I dendrogram, gren længde betegner afstand. B-D. IPA funktionel analyse af de mest udbredte gener i BE, CIS, og invasive cancer datasæt. Tag-til-gen tilknytninger til de øverste 300 mest rigelige tags fra BE, CIS, og SCC datasæt, blev brugt til IPA kerne analyse, som består af 220, 231, og 233 IPA berettiget kortlagt id’er hhv. De tre sæt data blev vist sammen under anvendelse af IPA core sammenligninger, og de fem vigtigste funktioner inden

fysiologisk system udvikling og funktion

er vist for hver af de tre datasæt. Dataene i B sorteres efter højeste betydning i BE dataene i C sorteres efter højeste betydning i CIS, og dataene i D sorteres efter højeste betydning i invasiv SCC. Den orange linje angiver tærskelværdien betydning, indstillet fra en p-værdi på 0,05. For en komplet liste over de tags /kortlagt id’er anvendes til denne analyse se tabel S1.

Opfindsomhed pathway analyse.

For at karakterisere og sammenligne de bronchieepithelceller og kræft transcriptomes, vi computated gennemsnitlige normaliserede tag tæller for BE (14 biblioteker), CIS (5 biblioteker), og invasive SCC (6 biblioteker) datasæt, og efterfølgende valgt den mest udbredte 300 unikke tags fra hvert datasæt til analyse (tabel S1). Tags kortlægning til mitokondrie-kodede gener og ribosomale protein gener, blev fundet på lignende frekvenser inden for top 300 mest rigelige tags på tværs af alle tre datasæt af BE, CIS, og SCC på ~8% og -18%, hhv. Vi brugte det centrale analyse element i

Ingenuity Pathway Analyse

(IPA) for at kategorisere disse gener efter biologiske funktioner. Kun de molekyler, der har mindst en funktionel annotation i IPA Knowledge Base kvalificere sig til analyse, og omfattede 220 (BE), 231 (CIS), og 233 (SCC) Ipa støtteberettigede gener. Disse analyser viser, at gener inden for kategorien af ​​

Hår og hud udvikling og funktion

er stærkt udtrykt i CIS transkriptom i forhold til både BE og SCC, og gener inden for kategorierne

Hæmatologisk System udvikling og funktion

og

Cell Immune Trafficking

er stærkt udtrykt i SCC transkriptomet forhold til både BE og CIS. Derfor er høj ekspression af gener, der er forbundet med epidermal udvikling identificeret her som et karakteristisk træk ved CIS transkriptom, og høj ekspression af gener, der er forbundet med cellulære bevægelse som et karakteristisk træk ved SCC transkriptomet. Se figur 2B-D for et resumé af disse analyser.

Et bemærkelsesværdigt træk ved både CIS og SCC datasæt er overflod af tags kortlægning til den konstante region af immunglobulin tunge kæder. Faktisk SAGE tag for IGHG1 er den mest rigelige tag i både SNG og de invasive kræft datasæt (tabel S1). Selv om det er muligt, at ekspression af disse immunglobulinkæder stammer infiltrerer lymfevæv og omgivende stroma har tidligere undersøgelser demonstreret ekspression af tung kæde konstante og variable regioner af immunglobuliner i brystkræft epitelceller [38], [39], [40], og ekspression af IgG tunge og lette kæder i forskellige epitelcancerceller herunder lunge SCC [41]. Disse immunglobulinkæderne kan repræsentere kræft celle autoantistoffer, og stimulere væksten i en autokrin /parakrin måde [40]. Interessant nok til overflod af tags kortlægning tung immunoglobulinkæde transkripter i CIS preinvasive læsioner i lungen, i modsætning til den relativt lave påvisning i både BE og præcancer metaplastisk og dysplastiske læsioner (se nærmere i de efterfølgende tabeller), tyder på, at opregulering af disse udskrifter kan have relevans for initiering af NSCLC.

Genekspression skifter fælles for carcinoma-in-situ og forstadier til kræft

Overgang fra en sund bronkieepitel til invasiv cancer menes at fortsætte via progression af histologiske og genetiske abnormiteter: BE til PC til CIS til SCC, hvor PC repræsenterer forstadier til kræft (skællede metaplasi og dysplasi). Squamous metaplasi er en forbigående komponent af normal sårheling af de bronchiale epitel, og typisk løser til en re-opdelte epitel sammensat af pseudostratified cilierede og sekretoriske celler, genoprette bronkial funktion [42]. (Anvendelse af udtrykket PC her indebærer ikke en obligatorisk progression til kræft, men snarere refererer til læsioner /abnormaliteter, der på trods af sjældne progression til kræft, betragtes som forløbere for kræft.) Omvendt SNG læsioner demonstrerer en lav regression frekvens med en høj forekomst af progression til invasiv cancer [43], [44] og er kendetegnet ved en mere omfattende lagdeling af squamous celletyper i forhold til PC [9], [11], [12]. Ved at identificere genekspression skifter fælles for både PC og CIS i forhold til BE, vi fokusere på de genetiske begivenheder, der opstår tidligt og varer ved igennem til CIS. I overensstemmelse med vores udvælgelseskriterier (minimal tre gange forskel i den gennemsnitlige normaliserede tag overflod, minimal gennemsnitlig normaliseret tag overflod af 40 TPM i over-udtrykkende datasæt) blev 868 SAGE tags fundet at være tilsvarende udtrykkes forskelligt i PC og CIS i forhold til BE, bestående af 190 opreguleret tags og 678 nedreguleres tags (figur 3A).

Kriterier for differentiel genekspression blev defineret som en minimal tre-fold forskel i normaliserede middelværdier mærkeantallene, og med en minimal gennemsnitlig tag overflod af 40 TPM i over-udtrykkende datasæt. Up-pile angiver opregulerede genekspression ændringer; ned-pilene angiver nedreguleret genekspression ændringer; numeriske værdier refererer til antallet af differentielt udtrykte tags. Områder af aflytning afspejler genekspression ændringer i fælles mellem de to datasæt. A. Expression ændringer i carcinoma-in-situ og forstadier til kræft i forhold til BE. B. Expression ændringer i kræft datasæt i forhold til både bronkieepitel og forstadier datasæt. BE: bronchieepithelceller; PC: præcancer; CIS: carcinoma-in-situ; SCC:.. Invasiv pladecellekræft

opreguleret udtryk ændringer

Ca. 35% af de tags opreguleret i CIS i forhold til BE (190 ud af 529 tags) var fundet at være almindeligt opreguleret i PC læsioner, og ca. 25% af tags opreguleret i PC læsioner i forhold til BE (190 ud af 754 tags) fandtes at være tilsvarende opreguleret i CIS (figur 3A). Se tabel S2 for en beskrivelse af disse tags up-reguleret i både PC og CIS. IPA funktionel analyse (baseret på 143 berettiget kortlagt ID’er) viser, at ca. 35% af disse almindeligt opreguleret gener er associeret med epidermal udvikling og associerede lidelser, som beskrevet i tabel 3. Ud over de gener, der er beskrevet i tabel 3, en anmeldelse af litteraturen identificeret andre gener i den PC /CIS opreguleret datasæt at være forbundet med epidermal udvikling, herunder SBSN, CNFN, CRCT1, yderligere medlemmer af lille prolin-rige familie af proteiner (SPRR2E og SPRR3), og yderligere medlemmer af den S100A familien af ​​calcium-bindende proteiner. Mange af disse gener er kodet enten inden for epidermal differentiation kompleks (EDC) locus på 1q21 [45], [46] eller inden en konserveret locus på 19q13 [47] og angiver bestanddele af forhornede celle kuvert, en struktur, der giver barriere beskyttelse til epidermis og intern epitel som reaktion på fornærme eller skade [48], [49].

IPA vej grafisk repræsentation af de gener almindeligt opreguleret i CIS og PC i forhold til BE, præsenteres i figur 4. i betragtning af de molekylære interaktioner identificeret af IPA, funktionelle foreninger blandt desmosom cadheriner og catenins er fremtrædende inden for PC /CIS opreguleret datasæt. Desmosomer er intercellulære adhæsionsmolekyler junctions, der giver mekanisk integritet til epitelet, og undersøgelser viser, at desmosom cadheriner modulere keratinocytdifferentiering og epidermal morfogenese [50]. Denne analyse antyder også, at en signaleringskaskade medieret af medlemmer af 14-3-3-familien af ​​proteiner, kan være aktive her. 14-3-3 sigma (SFN) medierer keratinocytdifferentiering og lagdeling af epidermis [51]. Den vej diagram antyder også, at særlige aspekter af keratinocyt terminal differentiering kan medieres af AP-1 transkriptionsfaktor FOSL2, som kan have en yderligere rolle i ekstracellulær matrix remodellering. Faktisk FOSL2 er blevet identificeret som en formidler af lungefibrose [52]. En overvejelse af gener forbundet med transskription faktor HIF1A i PC /SNG læsioner, antyder en remodeling /profibrotic reaktion på hypoxiske vækstbetingelser [53], [54], [55]. Faktisk er en funktionel sammenhæng mellem hypoxi og fibrose dokumenteret i litteraturen [56], [57], [58]. Ekspression af andre gener identificeret her, såsom NCF1 (den regulatoriske underenhed af NADPH oxidase), og hæm katabolisk enzym HMOX1, tyder også på et oxygen stress respons og vævsremodellering /fibrose [59], [60], [ ,,,0],61], [62]. Det bemærkes, at yderligere IPA analyse identificeret

Nedsat Fibrose /Nedsat Stellate Cell Aktivering

14-3-3-medieret signalering

som væsentlige kategorier inden

Canonical Pathways

, og identificeret

Nedsat fibrose

som den mest betydningsfulde kategori inden

Toksicitet Lister

(data ikke vist).

155 gener (IPA kortlagt iD’er) er repræsenteret ud af 190 SAGE tags op -regulated i både CIS og PC i forhold til BE. (Se tabel S2 for tag data.) Gene produkter er placeret i henhold til subcellulære lokalisering. Kun direkte forbindelser (dvs. direkte fysisk kontakt mellem to molekyler) mellem de enkelte genprodukter er vist for klarhed præsentation; linjer angiver protein-protein bindende interaktioner, og pile henvises til “handlinger på” interaktioner såsom proteolyse, udtryk, og protein-DNA /RNA-interaktioner. Gener forbundet med epidermal udvikling (se tabel 3) er fremhævet.

Yderligere analyse af Gene ontologi hjælp af

INDSAMLING

annotation værktøjet [63], på samme måde identificeret epidermal udvikling som en fremtrædende komponent af transkriptomet af almindeligt up-regulerede gener i CIS og pc læsioner, i forhold til BE (Figur S1A, tabel S3).

nedreguleret udtryk ændringer.

de fleste tags down- reguleret i CIS i forhold til BE, viste sig at være almindeligt nedreguleret i PC læsioner (678 tags ud af 904 tags), og omvendt (678 tags ud af 912 tags nedreguleret i PC i forhold til BE) (figur 3A) .