PLoS ONE: SD-208, en roman Protein kinase D Inhibitor, blokke prostatakræft Cell Proliferation og tumorvækst in vivo ved at inducere G2 /M Cell Cycle Arrest

Abstrakt

Protein kinase D (PKD) har været impliceret i mange aspekter af tumorigenese og progression, og er en ny molekylært mål for udviklingen af ​​anticancerterapi. Trods nylige fremskridt i udviklingen af ​​potente og selektive PKD småmolekylære inhibitorer, tilgængeligheden af ​​

in vivo Salg aktive PKD inhibitorer forbliver sparse. I denne undersøgelse beskrives opdagelsen af ​​en hidtil ukendt PKD lille molekyle inhibitor, SD-208, fra en målrettet kinase inhibitor bibliotek skærmen, og syntesen af ​​en række analoger til at undersøge struktur-aktivitetsforhold (SAR) vs. pKD1. SD-208 viste en smal SAR profil, var en ATP-konkurrence pan-PKD hæmmer med lav nanomolær styrke og var celle aktiv. Målrettet hæmning af PKD ved SD-208 resulterede i potent hæmning af celleproliferation, en effekt, der kunne vendes ved overudtrykt pKD1 eller PKD3. SD-208 blokerede også prostatakræft celleoverlevelse og invasion, og standsede celler i G2 /M-fasen af ​​cellens cyklus. Mekanistisk, blev SD-208-induceret G2 /M anholdelse ledsaget af en stigning i niveauet af p21 i DU145 og PC3 celler såvel som forhøjet phosphorylering af Cdc2 og Cdc25C i DU145 celler. Vigtigst, SD-208 givet oralt i 24 dage signifikant ophævet væksten af ​​PC3 subkutan tumor xenografter i nøgne mus, som blev ledsaget af reduceret proliferation og øget apoptose og nedsat ekspression af PKD biomarkører herunder survivin og Bcl-XL. Vores undersøgelse har identificeret SD-208 som en ny effektiv PKD lille molekyle hæmmer, viser det terapeutiske potentiale af målrettet hæmning af PKD for prostatakræft behandling

Henvisning:. Tandon M, Salamoun JM, Carder EJ, Farber E, xu S, Deng F, et al. (2015) SD-208, en roman Protein kinase D Inhibitor, blokke prostatakræft Cell Proliferation og tumorvækst

In Vivo

ved at inducere G2 /M Cell Cycle Arrest. PLoS ONE 10 (3): e0119346. doi: 10,1371 /journal.pone.0119346

Academic Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, UNITED STATES

Modtaget: Juli 25, 2014 Accepteret: 19 Jan 2015; Udgivet: 6 marts 2015

Copyright: © 2015 Tandon et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af National Institutes of Health give R01CA129127, R01CA142580, og Oversea Hong Kong og Macao Scholars Forskningssamarbejde Fund af NSFC i Kina ( Grant # 81.328.020). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Medforfatter Qiming Jane Wang er en PLoS ONE Editorial Board medlem. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE Redaktionelle politikker og kriterier.

Introduktion

Prostatakræft er den mest almindelige mandlige malignitet i de vestlige lande [1] og den anden hyppigste årsag til kræft dødsfald i USA, hvilket repræsenterer 29% af alle mandlige kræftdødsfald [2]. Mens lokaliseret sygdom kan behandles med et par modaliteter, det metastatiske etape er palliativ snarere end terapeutiske og der er i øjeblikket ingen effektive behandlinger. Protein kinase D (PKD) er en familie af allestedsnærværende serin-threoninproteinkinase, der hører til Ca

2 + /calmodulin-afhængig proteinkinase superfamilien [3]. De tre isoformer af PKD (pKD1 /PKCμ [4], PKD2 [5] og PKD3 /PKCν [6]) er vidt udbredt i en række forskellige væv, og er homologe i struktur og funktion. PKDs aktiveres af proteinkinase C’er (PKC’er) gennem phosphorylering af to konserverede serinrester i aktiveringssløjfen af ​​kinasedomænet. For pKD1, aktivering involverer PKC-medieret phosphorylering ved Ser

738 og Ser

742 i aktiveringssløjfen, efterfulgt af autophosphorylering ved Ser

910, der overfører fuld aktivering [7,8].

PKD spiller en vigtig rolle i mediering mitogene signalering og er blevet vist at forstærke GPCR-induceret celleproliferation gennem MEK /ERK /RSK pathway [9]. Ny dokumentation viser involveringen af ​​PKD i vigtige signalveje som regulerer tumorcelleproliferation såsom β-catenin, androgenreceptor, mTORC1-S6K1, og MAPK i forskellige tumorcellelinier modeller [10-15]. Kollektivt denne mekanistiske fodaftryk demonstrerer en vigtig rolle PKD i cancer, der giver grundlaget for målretning PKD hjælp småmolekylære inhibitorer til cancerterapi.

I de seneste år er udviklingen af ​​småmolekylære inhibitorer, der er rettet mod PKD familien har avancerede betydeligt [15-19]. Efter opdagelsen af ​​den første potent, selektiv, og celle-aktive lille molekyle inhibitor CID 755.673 fra vores gruppe [20,21] vi instrueret betydelig indsats på at forbedre dets styrke og selektivitet ved kemiske modifikationer. Mens vi udviklet kundeemner med meget forbedret potens og selektivitet, såsom kb-NB142-70 [20,22],

in vivo

effektivitet og anvendelighed af denne klasse af inhibitorer fortsat begrænset [23]. En nylig undersøgelse udnytte målrettede biblioteker af små organiske kinase hæmmere har også identificeret en ny ATP-konkurrencedygtige 4 azaindol stillads, og et sæt af pyrazolopyrimidin småmolekyleinhibitorer med lav nanomolær potens for

in vitro

hæmning af PKD, der potent blokeret prostatacancerceller spredning og vækst [18,24,25]. Trods de enorme indsats mod udviklingen af ​​potente og selektive PKD lille molekyle-inhibitorer til kræftbehandling, er der stadig stor efterspørgsel efter effektiv

in vivo

-Active PKD lille molekyleinhibitorer stand til at udvikle sig til præklinisk udvikling, og yderligere ind i den kliniske ansøgning.

i den foreliggende undersøgelse, vi identificeret SD-208 som et nyt ATP-konkurrence PKD lille molekyle inhibitor

in vitro

in vivo

. I prostatacancerceller, viste vi, at SD-208 undertrykte signifikant tumorcelleproliferation ved målrettet hæmning af PKD og blokeret tumorcelleinvasion. En mekanistisk undersøgelse antydede, at SD-208 ophævet cancercelleproliferation gennem induktion G2 /M cellecyklusstandsning ved at øge cyclin-afhængig kinase inhibitor (CDKI) -p21 niveauer og modulering af aktiviteten af ​​Cdc25C /Cdc2-vejen. Endvidere SD-208 blokerede PC3 prostatacancer celleproliferation og vækst af tumor xenografter i nøgne mus, der korrelerer til nedsat Bd-XL og survivin. Vi genererede også en række analoger af SD-208 ved kemisk syntese, og evalueret deres hæmmende profil, viser en smal SAR for denne bly struktur. Vores resultater således karakterisere SD-208 som et strukturelt ny PKD lille molekyle-hæmmer, der væsentligt ophæver prostatakræft celledeling

in vitro

in vivo

.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev udført i henhold til Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved University of Pittsburgh retningslinjer og dyret protokollen og undersøgelse blev godkendt af University of Pittsburgh Institutional Animal Care og User Udvalg (protokol nummer: 11.120.102).

Cell kultur og reagenser

Menneskelig prostata carcinoma PC3, blev DU145 og LNCaP celler opnået fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrkes i henhold til den producentens anbefaling. Alle cellelinier blev dyrket ved 37 ° C, 5% CO

2 i en fugtig atmosfære. Hams F-12 og MEM var fra Cellgro (Manassas, VA) og andre kultur materialer var fra Invitrogen (Life Technologies, Carlsbad, CA). Kinase aktivt rekombinant GST-mærket humant protein kinase D1 (pKD1) blev opnået fra Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY). DMSO blev indkøbt fra Sigma (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Rekombinant PKCa, PKCδ, og CAMKIIα blev opnået fra SignalChem (Richmond, BC, Canada). ATP blev indkøbt fra Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ). HDAC5 substratpeptid blev syntetiseret ved Biobasic Canada Inc. (Markham, ON). Myelin basisk protein 4-14 blev købt fra AnaSpec Inc. (Fremont, CA). En farmakologisk aktiv kinase inhibitor bibliotek blev indkøbt fra Tocris Bioscience (Minneapolis, MN).

Syntese af SD-208 analoger

Vi besluttede at kemisk modificere 5-chlor-2-fluorphenyl (

zone 1

) og

para

-aminopyridine (

zone 2

) dele med SD-208 til at undersøge bidrag disse sidekæder til pKD1 hæmning (tabel 1 og S1 fig.). Nærmere oplysninger om syntese er beskrevet i

Støtte oplysninger

.

Docking af SD-208

Denne undersøgelse blev foretaget som tidligere rapporteret [25]. Den strukturelle homologi model af pKD1 s kinasedomænet (rester 587 til 835) blev genereret ved hjælp af I-TASSER server. Sybyl-X 2.1 Surflex-Dock software udført docking af SD-208 ind pKD1 s kinase domæne. Programindstillinger blev konfigureret under de efterfølgende parametre. Alle hydrogenatomer var til stede i både homologien model samt SD-208. Det docking område var begrænset inden for rammerne af ATP-bindingssted, som omfatter følgende rester: Ala

610, Lys

612, Met

659, Glu

660, Lys

661, Leu

662, Hans

663, Glu

710, Leu

713, og Cys

726. Tyve yderligere startende konformationer blev bedømt for SD-208 og alle bindende modes blev vurderet. Molekylær modellering blev præsenteret ved hjælp PyMOL.

In Vitro

Radiometrisk PKD Inhibitor Screening Assay

En

in vitro

radiometriske PKD kinase blev anvendt til at screene et lille bibliotek med 80 kommercielt tilgængelige kinaseinhibitorer, Tocriscreen kinaseinhibitor samling (Tocris Biosciences, Minneapolis, MN), for pKD1 inhiberende aktivitet ved 1 uM koncentration [24].

In Vitro

Radiometrisk protokol er beskrevet i

Støtte oplysninger

.

Western blot analyse

LNCaP og DU145 prostatacancerceller blev opretholdt i RPMI 1640, mens PC3 celler blev holdt i Hams F-12-medium, suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1000 enheder /L penicillin og 1 mg /ml streptomycin i 5% CO

2 ved 37 ° C. En Western blot-analyse blev udført som tidligere beskrevet [10]. Primære antistoffer målrettet pS

916-pKD1 (human pS

910-pKD1) (Millipore), PS

744/748-pKD1 (human pS

738/742-pKD1), pKD1, pHsp 27 , Hsp 27, p21, cyclin A2, p-Cdc2, Cdc2, cyklin B1, p-Cdc25C, Cdc25C, Survivin, Bd-XL, Akt og pS

473-Akt (Cell Signaling Technology), PKD2 (Abcam), cyclin D1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX), blev GAPDH (Enzo Life Science, Farmingdale, NY) og tubulin (Sigma), der anvendes til blotting.

In vitro Radiometrisk PKC og CAMKIIα kinaseanalyse

PKC kinaseassay blev udført ved co-inkubering 1 uCi [γ-

32P] ATP, 20 uM ATP, 50 ng oprenset PKCa eller PKCδ og 5 ug myelin basisk protein 4-14, 0,25 mg /ml bovint serumalbumin, 0,1 mg /ml phosphatidylcholin /phosphatidylserin (80/20%) (1 uM), 1 pM phorbol dibutyrat i 50 pi kinasepuffer indeholdende 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 4 mM MgCl

2 og 10 mM β-mercaptoethanol. For CaMK assayet blev 50 ng CAMKIIα og 2 ug syntide-2 substrat i 50 pi kinasepuffer inkuberet med 0,1 mM MgCl

2, 1 pCi af [γ-

32P] ATP, 70 uM ATP. 0,5 mM CaCI

2 og 30 ng /pl calmodulin blev præinkuberet i 15 minutter på is og derefter tilsat i kinasereaktionen. Reaktionerne blev inkuberet ved 30 ° C i 10 minutter og 25 pi af reaktionen blev spottet på Whatman P81-filterpapir. Filtrerpapiret blev vasket 3 gange i 0,5% phosphorsyre, lufttørret og talt ved anvendelse af Beckman LS6500 MP scintillationstæller. Salg

MTT assay Salg

PC3-celler blev podet i plader med 96 brønde (3000 celler /brønd) og lodes binde natten over. Celler blev derefter inkuberet i medier indeholdende 0.7-100 pM inhibitorer i 72 timer. 50 pi 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid methyl thiazolyl-tetrazolium (MTT) opløsning ved 2 mg /ml koncentration blev tilsat til hver brønd og inkuberet i 4 timer ved 37 ° C . Derefter blev medierne fjernet og 200 pi DMSO blev tilsat til hver brønd. Pladen blev blandet ved omrystning i 5 minutter, og den optiske densitet blev bestemt ved 570 nm.

Subkutan prostatatumorxenograftmodel Study

athymiske ncr-nu /nu-mus (4-6 uger gamle) (NCI, Frederick, MD) blev injiceret subkutant med 1,4 x 10

6 PC3 celler i 100 pi medier. Tre dage efter inokulering, når tumorer blev palpable, blev musene randomiseret i følgende grupper (5 mus pr gruppe); (A) køretøj (kontrol) 1% (vægt /volumen) methylcellulose administreret ved oral gavage to gange daglig; (B) SD-208 60 mg /kg suspenderet i 1% methylcellulose administreret ved oral gavage to gange dagligt, i 21 dage. Legemsvægt blev målt to gange ugentligt. Tumorer blev målt i to dimensioner hver 2 til 3 dage ved skydelærer og tumor volumen blev beregnet som

V Hotel (mm

3) = (

L x B

2) /2. Tumoren mængder blev sammenlignet på hvert tidspunkt mellem grupper ved hjælp af uparret t-test og en

s

værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Fireogtyve dage efter inokulering blev mus aflivet ved CO

2 inhalation og tumorer blev udskåret. Alle dyr blev udført i overensstemmelse med en Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved University of Pittsburgh.

immunhistokemisk (IHC) Farvning af tumorvæv

Formalin-fikseret og paraffin indlejret snit blev farvet som tidligere beskrevet [10]. Kort beskrevet blev snit deparraffinized af xylen og rehydreret reducere gradienter af ethanol. Antigen genfinding blev udført ved ulmende objektglassene ved nær kogepunktet i 30 minutter i 10 nmol /l natriumcitrat (pH 6,0), efterfulgt af afkøling til stuetemperatur. Vævssnit blev derefter farvet med Ki-67 (Genetex, Irvine, CA) og spaltet caspase-3 (cellesignalering Technology, Beverly, MA) antistoffer ved 4 ° C natten over og derefter inkuberet med biotinyleret gede-anti-kanin-antistof (Vector Laboratories, Logan, UT). Glassene blev derefter udviklet ved hjælp Vectastain ABC Standard kit og AEC Reagent (Scytek Labs, Logan, UT). Vævene blev endelig modfarvet med hematoxylin. I alt 10 felter blev undersøgt og talt fra hver behandlingsgrupper i et blindet måde.

Immunopræcipitation og p-PKD2 kinaseanalyse

PKD2 blev immunpræcipiteret ved inkubering 500 ug totale cellelysater fra tumor eksplantater med protein A /G sepharose-perler (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) preconjugated med anti-PKD2 antistof (GeneTex, Irvine, CA.) natten over ved 4 ° C under konstant rotation. Immunkomplekserne blev derefter pelleteret og vasket med vaskebuffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM natriumchlorid og 1% Triton X-100). Lige mængder af immunkompleks blev derefter underkastet PKD kinaseassay, som beskrevet i supplement protokol. Kort fortalt blev assayet udført ved co-inkubation 20 pi immunpræcipiteret PKD2 med 25 pM ATP, 0,2 pi [γ-

32P] ATP (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Boston, MA) og 1,2 uM en 25 a.a. HDAC-5-peptid som substrat [26] i et endeligt volumen på 50 pi. Reaktionen fik lov at forløbe ved 30 ° C i 10 minutter. En alikvot af reaktionsblandingen blev derefter spottet på p81 papir, vasket i 5% phosphorsyre og talt.

celleproliferationsassay and Cell Cycle Analysis

Proliferation af PC3-celler blev målt ved at tælle antallet af levedygtige celler efter farvning med trypanblåt som tidligere beskrevet [10]. Cellecyklusanalyse blev udført som beskrevet [22]. Kort fortalt blev PC3-celler behandlet med de passende forbindelser ved 30 pM i 72 timer, og derefter fikseret i 70% iskold ethanol natten over, efterfulgt af mærkning med propidiumiodid. De mærkede celler blev analyseret ved anvendelse af et FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA).

Matrigel Invasion assays Salg

Matrigel invasion assay blev udført som beskrevet tidligere [21,22] (se

Støtte Information

for flere detaljer).

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev gennemført med GraphPad Prism-software 5.0. En

s

værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Identifikation af SD-208 som en ny PKD lille molekyle hæmmer

Vi har udført en skærm af PKD lille molekyleinhibitorer på Tocriscreen kinase inhibitor samling af 80 kemisk forskelligartede kinaseinhibitorer ved 1 uM koncentration under anvendelse af en

in vitro

radiometrisk PKD kinaseassay. Med en cut-off sat til ≥ 50% inhibering af total pKD1 kinaseaktivitet blev 16 forbindelser identificeret som primære hits. Blandt dem, SD-208 undertrykte 82% af pKD1 aktivitet ved 1 uM koncentration (data ikke vist) og blev yderligere vurderet for hæmning af pKD1, 2 og 3 i en 10-punkts koncentrationskurve ved hjælp af radiometrisk PKD kinase assay [21]. Som vist i fig. 1A, SD-208 inhiberede pKD1, 2 og 3 med en IC

50 af 106,87 ± 6,6 nM (n = 9), 93,54 ± 2,7 nM (n = 9), og 105,3 ± 2,6 nM (n = 9) , henholdsvis. Brug af LNCaP-prostatacancerceller som modelsystem, effekten af ​​SD-208 på 12-myristat-13-acetat (PMA) -inducerede endogen pKD1 aktivering blev undersøgt som tidligere beskrevet [10,22]. Som vist i fig. 1B-C, behandling af LNCaP-celler med 10 nM PMA i 20 min induceret robust pKD1 aktivering, påvist ved øget pKD1 aktiveringssløjfen phosphorylering ved Ser

738/742 tillagt ved PKC og C-terminale autophosphorylering ved Ser

910 . Forbehandling med stigende koncentrationer af SD-208 koncentrationsafhængigt inhiberede autophosphorylering ved Ser

910 af pKD1 med en IC

50 af 17,0 ± 1,5 pM (fig. 1C). I modsætning hertil PKC-afhængig trans-phosphorylering ved Ser

738/742 var upåvirket af SD-208, hvilket indikerer, at SD-208 direkte ophævet pKD1 katalytisk aktivitet uden at blokere opstrøms PKC-medieret pKD1 trans-phosphorylering. Således SD-208 er strukturelt forskellige pan-PKD-inhibitor, der fremkalder målrettet inhibering af pKD1 kinaseaktivitet i prostatacancerceller.

A. Bestemmelse af PKD kinase aktivitet

in vitro

. Inhibering af rekombinant human pKD1, 2 og 3, undersøgt i nærværelse af 10 forskellige koncentrationer af SD-208 ved et

in vitro

radiometrisk PKD kinaseassay. IC

50-værdier blev beregnet som middelværdi ± SEM af mindst tre uafhængige forsøg med tredobbelte bestemmelser ved hver koncentration forbindelse i hvert eksperiment. Dataene blev afbildet som en funktion af inhibitorkoncentration og en repræsentant graf er vist. B. SD-208 hæmmede PMA-induceret pKD1 aktivering i prostatacancerceller. LNCaP-celler blev forbehandlet med forskellige doser af inhibitorer i 45 minutter, efterfulgt af PMA-stimulering ved 10 nM i 20 minutter. Cellelysater blev udsat for immunblotting for p-S

910-pKD1 og p-S

738/742-pKD1. Tubulin blev udslettet som lastning kontrol. Eksperimentet blev gentaget tre gange, og de repræsentative blots er vist. C. Bestemmelse af cellulære IC

50. Western blots fra ‘B “blev kvantificeret under anvendelse af densitometrianalyse. Dataene blev afbildet og IC

50 værdier blev afledt fra koncentration-responskurver ved anvendelse af GraphPad. En af de tre koncentrations-respons-kurver er vist. D. SD-208 er en ATP-kompetitiv kinaseinhibitor. PKD1 kinase aktivitet blev målt som en funktion af stigende koncentrationer af ATP i nærvær af varierende koncentrationer af SD-208. Lineweaver-Burke afbildninger af data er vist. Data præsenteret var middelværdien ± S.E. af tre uafhængige forsøg med tredobbelte bestemmelser på hvert datapunkt i hvert forsøg. E-F. Selektivitet af SD-208 mod relaterede kinaser. Inhibering af PKCa (B) eller PKCδ (C) blev bestemt ved 10 nM, 100 nM, 1 pM, og 10 uM. Som kontroller, PKC inhibitor GF109203X hæmmede kraftigt PKCa og PKCδ aktivitet. Data er middelværdien ± SEM af to uafhængige forsøg. G. Inhibition af CAMKIIα blev målt ved radiometriske CaMK kinase assay. Data er den gennemsnitlige ± S.E. af to uafhængige forsøg med tredobbelte bestemmelser på hvert datapunkt i hvert forsøg. Statistisk signifikans blev bestemt ved anvendelse af uparret t-test. ns, ikke signifikant signifikant; *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P. 0,001

SD-208 var en ATP-kompetitiv inhibitor med høj selektivitet for PKD løbet nært beslægtede kinaser

For at få et bedre indblik i tilstanden af handling til SD-208, vi undersøgt virkningerne af stigende koncentrationer af ATP på pKD1 hæmning. Lineweaver-Burk plots blev frembragt ved at plotte den reciprokke værdi af reaktionshastigheder (1 /v) mod den reciprokke værdi af ATP-koncentrationer (1 /[ATP]) på forskellige forbindelseskoncentrationer. Punkterne blev monteret ved lineær regression. Som vist fig. 1D, alle linjer konvergeret på Y-aksen, hvilket indikerer, at SD-208 var en ATP-kompetitiv inhibitor. Dernæst vi bestemt specificiteten af ​​SD-208 for PKD ved at undersøge deres aktivitet for de klassiske og nye PKC isoformer hjælp PKCa og PKCδ. Ingen signifikante inhibitoriske aktiviteter for PKC-isoformer blev påvist på 0,1 og 1 um og for PKCa ved 10 uM (fig. 1 E-F). Den potente PKC-hæmmer GF109203X blev testet som en positiv kontrol, og det potent og koncentration-afhængigt hæmmet PKCa og PKCδ. Høj sekvenshomologi af PKD med CaMK familien førte os til at undersøge hæmning af CAMKIIα ved SD-208. Som illustreret i fig. 1G, SD-208 udviste ingen aktivitet på CAMKIIα op til 10 uM. Tilsammen indikerer disse data, at SD-208 er en meget specifik inhibitor for PKD i forhold til andre nært beslægtede kinaser, herunder PKC’er og CAMKs.

Synthesis, SAR-analyse, og modellering af SD-208 og dets analoger

Vores tilgang til de syntetiske studier, som beskrevet detaljeret i S1 fig., var baseret på to zoner af substitution i SD-208, hvor 2-fluor-5-chlorbenzen betegner zone 1 og 4-aminopyridin betegner zone 2 ( fig. 2). Brug af pteridin kerne som en syntetisk platform, vi var interesserede i at udforske de udskiftninger knyttet til smeltet pyrimidinring, specielt til at identificere de SAR bidrag fra fluorerede og klorerede substituenter i zone 1 og pyridinringen i zone 2. Den sekundære amin i zone 2 blev bevaret, fordi aminosyrerne substitutioner alfa til nitrogenatomer i heterocykliske ofte er impliceret i proteinkinase hængsel binding [27,28]. Som følge heraf kan den sekundære amin bevise afgørende for aktivitet.

2-Zone model for SD-208 analog syntese.

Vores SAR undersøgelse i første omgang fokuseret på vigtigheden af ​​substituenterne på den aromatiske ring i zone 1 (tabel 1). Elektrontætheden af ​​den aromatiske ring i SD-208 er faldet elektronegativitet fluoratomet [29,30]. Desuden kan klor bidrage til dipol-dipol vekselvirkninger i proteinet bindende kløft [31]. Fjernelse af halogenerne fra benzenringen (5a-d) førte til en signifikant nedsat aktivitet. I modsætning hertil installation af elektrontiltrækkende grupper, såsom fluor (5e-g) og trifluormethyl (5h) gendannet aktivitet, men kun når zone 2 bestod af 4-aminopyridin (5e, h). Interessant nok blev kun 4-aminopyridin tolereres i zone 2. Derfor er vores forsøg forbedre opløseligheden med piperazin (5j) og 2-morpholinoethyl (5 g) substituenter undladt at bevare pKD1 inhiberende virkninger. Overraskende, selv en regioisomer, 3-aminopyridin (5d, f), ikke blev tolereret. Denne observation tyder på, at nitrogenet i pyridinringen kan være involveret i vigtige hydrogenbindende interaktioner, men kun i et specifikt rumligt arrangement. Yderligere diversificering af zone 1 med 3,5-dichlor-substituenter (5i) ikke genoprette aktivitet. Dette understøtter yderligere vigtigheden af ​​elektron-gruppe, da klor er mindre elektronegativt end fluor. Ændring positionerne af substituenter på benzenringen i 2,5-difluor- (5e) og 3-trifluormethyl- (5h) -analoger konserveret aktivitet. Dette resultat indikerer, at positionen af ​​substituenterne på denne aren ikke kan være kritisk, så længe den funktionelle gruppe er tilstrækkelig elektrontiltrækkende.

I forbindelse med denne SAR analyse anvendte vi vores pKD1 homologimodel [25] til rationelt undersøge et formodet bindende tilstand af SD-208 i det aktive site af pKD1. Almindeligt blandt ATP-kompetitive hæmmere, blev SD-208 er vist i fig. 3A til at interagere med hængselregionen gennem hydrogen bindingsdannelse mellem aminosyren rygraden i Leu

662 og dens pteridin kerne. Desuden blev en potentielt kritisk hydrogenbinding observeret med kvælstof fra 4-aminopyridin og den ladede sidekæde af Lys

612. En lignende interaktion blev også rapporteret i andre kendte pKD1 hæmmere [18]. Vores SAR-analyse understøtter endvidere forestillingen om, at kvælstof fra de 4-aminopyridin fungerer som en værdifuld hydrogenbindingsacceptor. Ablation af denne binding afsløret et markant fald i pKD1 inhibering. Endvidere vises i fig. 3B, vores model placerer disubstituerede phenylringen i en hydrofob lomme bestående af Leu

589 og Leu

713, som kan diktere tolerancen af ​​aromatiske udskiftninger. Selv om andre bindende former for SD-208 blev undersøgt, den nuværende model bedst gengivet resultater er repræsenteret i vores SAR-analyse.

Denne afbildning vist potentiale bindende tilstand af SD208 i det aktive sted i pKD1. Røde stiplede linjer repræsenterer vigtigste vekselvirkninger mellem SD-208 og pKD1.

SD-208 hæmmede prostatakræft celledeling og invasion

Vi næste undersøgt virkningerne af målrettet hæmning af PKD ved SD -208 om prostatakræft celleproliferation, overlevelse, og cellecyklus progression. Som vist i fig. 4A-B, SD-208 ved 30 uM forårsagede signifikant reduktion i PC3 prostatacancerceller proliferation begyndende ved dag 2 og varede til slutningen af ​​eksperimentet. SD-208 også koncentrationsafhængigt induceret celledød med en IC

50 af 17,0 ± 5,7 pM (n = 3) (fig. 4C). Virkningen af ​​SD-208 på tumorcelleinvasion blev vurderet ved anvendelse Matrigel invasion assay (celleinvasion). Som illustreret i fig. 4D, behandling af celler med 30 pM SD-208 i 20 timer resulterede i over 60% inhibering af celleinvasion forhold til kontrol, hvilket indikerer, at SD-208 signifikant blokeret tumorcelleinvasion. Tilsammen vores data viser, at SD-208 er en potent inhibitor af prostatacancer celleproliferation og invasion.

A-B. SD-208 inhiberede PC3 (A) og LNCaP (B) prostatacancer celleproliferation. PC3 og LNCaP-celler blev udpladet i tre eksemplarer på plader med 24 brønde. Celler lodes binde natten over. En celletælling på dag 1 blev fremstillet, og derefter enten en vehikel (DMSO) eller SD-208 ved 30 uM blev tilsat. Celler blev talt dagligt i i alt 6 dage. Data er den gennemsnitlige ± S.E. af to uafhængige forsøg med tredobbelte bestemmelser på hvert datapunkt i hvert forsøg. C. SD-208 inhiberede PC3 prostatakræft celleoverlevelse. PC3-celler blev podet i plader med 96 brønde (3000 celler /brønd) og blev derefter inkuberet i medier indeholdende 0,3-100 uM inhibitorer i 72 timer. MTT-opløsning blev tilsat til hver brønd og inkuberet i 4 timer. Optisk densitet blev aflæst ved 570 nm for at bestemme cellernes levedygtighed. IC

50 blev bestemt som middelværdien af ​​tre uafhængige forsøg for hver forbindelse. D. SD-208 hæmmede prostatakræft celleinvasion. DU145 celler blev inkuberet med 30 pM SD 208 i Matrigel skær. Efter 20 timer blev noninvasive celler fjernet og invasive celler blev fikseret i 100% methanol, farvet i 0,4% hematoxylin-opløsning og fotograferet. Antallet af celler, som invaderede Matrigel matrix blev bestemt ved celletælling i 6 felter i forhold til antallet af celler, som migrerede gennem styring indsatsen. Procent invasion blev beregnet som procent af cellerne invaderet gennem Matrigel indsætter vs. totale celler migreret gennem kontrol- skær. Data er den gennemsnitlige ± S.E. af tre uafhængige forsøg med tredobbelte bestemmelser på hvert datapunkt i hvert forsøg. Statistisk signifikans blev bestemt ved anvendelse af uparret t-test. ***, P 0,001. E-F. Overekspression af pKD1 og PKD3 i prostata kræftceller reddet anti-proliferative virkninger af SD-208. PC3 (0,5 mio) -celler blev podet i en 60 mm skål og inficeret den næste dag med 50 og 100 MOI på pKD1 og PKD3 adenovira (Adv-pKD1 og Adv-PKD3). Tom adenovirus (Adv-null) blev anvendt som kontrol. Efter 24 timer, 3000 celler /brønd blev udpladet i 96-brønds plader og behandlet med og uden 10 og 30 uM SD-208 i 72 timer. MTT-opløsning blev tilsat til hver brønd og inkuberet i 4 timer. Optisk densitet blev aflæst ved 570 nm for at bestemme cellernes levedygtighed. Overekspressionen af ​​pKD1 og PKD3 blev bekræftet ved Western blotting-analyse. Dette forsøg blev gentaget tre gange og data er middelværdien ± S.E. af alle tre uafhængige forsøg. Statistisk signifikans mellem DMSO og inhibitor-behandling blev bestemt under anvendelse af uparret t-test *, p. 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001. G. PKD medieret Hsp27 aktivitet i prostatacancerceller blev hæmmet af SD-208. DU145-celler blev forbehandlet med forskellige doser af inhibitorer i 45 minutter, efterfulgt af PMA-stimulering ved 10 nM i 20 minutter. Cellelysater blev udsat for immunblotting for p-S

910-pKD1 og p-S

738/742-pKD1. GAPDH blev udslettet som lastning kontrol. Forsøget blev gentaget to gange, og de repræsentative blots vises.

SD-208-induceret vækststandsning blev formidlet gennem målrettet hæmning af PKD

For at bestemme målet specificitet SD- 208 på celleniveau, søgte vi at undersøge om SD-208-induceret anti-proliferative virkninger blev medieret selvom målrettet hæmning af PKD. Der blev gjort forsøg at vende effekten af ​​PKD inhibitor via overekspression forskellige PKD isoformer. Som vist i fig. 4E-F, PC3-celler blev inficeret med null adenovirus (Adv-null) og adenovirus bærer pKD1 og PKD3 gener (Adv-pKD1 og Adv-PKD3) ved 50 og 100 MOI. Western blotting viste overekspression af pKD1 og PKD3 i PC3-celler inficeret med adenovirus, der bærer de respektive gener. De inficerede celler blev underkastet SD-208 behandling ved 10 og 30 uM. Angivelse af stigende niveauer af pKD1 og PKD3 vendt anti-proliferative virkninger af SD-208. De højere niveauer af pKD1 eller PKD3 udtryk, jo større rednings- effekter, og ved 100 MOI en næsten komplet tilbageførsel af hæmning af celleproliferation blev observeret for Adv-PKD3 ved 10 og 30 uM SD-208 (fig. 4). Disse data viser, at anti-proliferative virkninger af SD-208 medieres via inhibering af PKD. For at afgøre, om anti-proliferative egenskab af SD-208 skyldes målrettet hæmning af PKD, vi søger at afgøre, om det også hæmmede PKD medieret PMA-induceret Hsp27 fosforylering på Ser-82 i prostatacancerceller (Yuan og Rozengurt, 2008 ). Hsp27 er en veletableret direkte substrat af PKD [32,33]. Som vist i fig. Som vist i fig. Som vist i fig. Som vist i fig.