PLoS ONE: Etablering Magnetic Resonance Imaging som en præcis og pålidelig værktøj til diagnose og overvågning Esophageal Cancer i en rotte model

Abstrakt

Målsætning

For at vurdere pålideligheden af ​​magnetisk resonans imaging (MRI) til påvisning af kræft i spiserøret i Levrat model af end-to-side esophagojejunostomy.

Baggrund

Levrat model har vist anvendelighed med hensyn til dets evne til at replikere Barretts carcinogenese ved at inducere gastroduodenoesophageal reflux (GDER). På grund af manglende data om anvendeligheden af ​​ikke-invasive metoder til påvisning af kræft i spiserøret, har behandling effektstudier været begrænset, da adenocarcinom histologi kun er blevet valideret efter slagtning. Det vil derfor være af stor værdi, hvis gyldigheden og pålideligheden af ​​MRI kunne etableres i denne indstilling.

Metoder

Kronisk GDER reflux blev induceret i 19 Sprague-Dawley rotter ved hjælp af den modificerede Levrat model. På 40 uger efter operationen, alle dyr undergik endoskopi, MR-scanning, og efter slagtning histologiske analyse af spiserøret og anastomose. Med post mortem histologi tjener som guldstandarden blev vurdering af tilstedeværelsen af ​​kræft i spiserøret lavet af fem esophageal specialister og fem radiologer på endoskopi og MR henholdsvis.

Resultater

Nøjagtigheden af ​​MRI og endoskopisk analyse for at identificere kræft korrekt vs. ingen kræft var 85,3% og 50,5%, henholdsvis. ROC kurver viste, at MRI bedømmelse havde en AUC på 0,966 (

s

0,001) og endoskopi bedømmelse havde en AUC på 0,534 (

s =

0,804). Følsomheden og specificiteten af ​​MRI til at identificere kræft vs no-kræft var 89,1% og 80% henholdsvis, sammenlignet med 45,5% og 57,5% for endoskopi. Falsk positive satser for MRI og endoskopi var 20% og 42,5%, hhv.

Konklusioner

MR er en mere pålidelig diagnostisk metode end endoskopi i Levrat modellen. Den ikke-invasiv af værktøjet og dets potentiale til volumetrisk kvantificere størrelsen og antallet af tumorer sandsynligvis gør det endnu mere nyttigt i at vurdere nye agenter og deres effektivitet i behandling studier af kræft i spiserøret

Henvisning:. Kosovec JE, Zaidi AH, Komatsu Y, Kasi PM, Cothron K, Thompson DV, et al. (2014) Etablering Magnetic Resonance Imaging som en præcis og pålidelig værktøj til diagnose og overvågning Esophageal Cancer i en rotte model. PLoS ONE 9 (4): e93694. doi: 10,1371 /journal.pone.0093694

Redaktør: Helge Bruns, Universitetshospital Heidelberg, Tyskland

Modtaget: December 6, 2013; Accepteret: 8 Mar 2014; Udgivet: April 4, 2014

Copyright: © 2014 Kosovec et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af David Gold og Irene Blumenkranz. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Behandlingsmuligheder for patienter med esophageal adenocarcinom (EAC) er i øjeblikket begrænset og kompliceres af, at de fleste patienter til stede med fremskreden sygdom [1] – [3]. Desuden forekomsten af ​​esophageal adenocarcinom fortsætter med at stige i USA, og de fem-års overlevelse er kun 15% [4]. Det er derfor blevet stadig mere relevant at afprøve nye teknikker og nye agenter til at forebygge og behandle ØK gennem gennemførelsen af ​​omfattende translationelle modeller. Den kirurgiske model af ende-til-side anastomose esophagojejunal i rotter (modificeret Levrat model) inducerer kronisk gastroduodenoesophageal tilbagesvaling (GDER) og udsætter spiserøret for mavesyre og galde at initiere sygdomsprogression [5] – [10]. Den Levrat modellen er valideret til effektivt replikere den samme langsgående progression fra gastroøsofageal reflukssygdom (GERD) til Barretts øsofagus (BE) til ØK, der er observeret hos mennesker [11], [12]. Derudover er modellen højeffektive, da det er blevet vist, at ca. 70% af rotter udvikler EAC ved 28 uger efter kirurgi [13].

Tidligere undersøgelser har vist anvendeligheden af ​​denne model til bestemmelse af effektiviteten forebyggende midler mod sygdomsprogression, men potentialet til anvendelse som en behandling model er blevet begrænset af en manglende evne til pålideligt diagnosticere patologi antemortem [13], [14]. Visual endoskopisk analyse har været anvendt som et værktøj til overvågning af naturhistorie sygdom [15], med biopsi giver mulighed for analyse af molekylære markører samtidig undgå dyr offer [16] – [18]; Men på grund af den iboende model begrænsning af den ekstra-luminale præsentation af størstedelen af ​​tumorer, samt den lave nøjagtighed endoskopiske biopsier, adenocarcinom histologi er kun blevet valideret efter slagtning [15].

Alternative billeddiagnostiske teknikker såsom mikro-PET scanning er blevet udforsket i et forsøg på at løse dette problem; imidlertid ingen teknik vist sig signifikant følsom og specifik i forhold til guldstandarden af ​​histologi [19]. For nylig, magnetisk resonans (MRI) er med succes blevet anvendt som en ikke-invasiv billeddannelse metode i bryst- og leverkræft dyremodeller [20] – [22]. Med post mortem histologisk analyse er den gyldne standard for ØK, vores mål var at undersøge, om MR skulle vise sig at være en gyldig redskab til at påvise tilstedeværelsen af ​​kræft i spiserøret i Levrat modellen i forhold til visuel inspektion med endoskopi.

Materialer og metoder

Levrat Model

den institutionelle Animal Care og brug Udvalg fra University of Pittsburgh godkendt en protokol for udviklingen af ​​denne undersøgelse (protokol nr. 1.104.373). Alle dyr modtog human måde i overensstemmelse med “Vejledning til pleje og anvendelse af forsøgsdyr.” End-to-side esophagojejunal anastomose (fig. 1) blev udført på 300 g 6-8 uger gamle Sprague-Dawley rotter ( Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) i henhold til den kirurgiske procedure og overvågning standarder beskrevet tidligere [13]. Vægten og sundhedstilstanden af ​​dyrene blev overvåget på daglig basis. Dyr blev ofret forud for endpoint, hvis de oplevede mere end 45% vægttab eller akutte sundhedsmæssige betænkeligheder og modtaget supplerende kost mushed pellet eller gel diæt (Nutra-Gel S5769, BioServ) hvis vægttab nåede mere end 25%. Rotter blev aflivet ved 40-ugers postoperativt gennem carbondioxid inhalation til histologisk evaluering. Dyrene blev planlagt til at modtage MR og endoskopi på 32, 36, og 40 uger postoperativt.

Gross billede af esophageal tumor (dyr nr. 13) induceret af modificeret Levrat model.

endoskopisk Assessment

Mad og vand blev begrænset fra dyrene i 2-6 timer før endoskopisk evaluering og for 2-4 timer efter proceduren. Rotter blev bedøvet med isofluoran ved 5% og 2% induktion og vedligeholdelse hhv. Dyr blev intuberet ved anvendelse af en justeret 16-gauge intravenøst ​​kateter for at opretholde luftvejene under endoskopi, men blev ikke ventileret. Rotter blev anbragt rygliggende på en vand-opvarmet kirurgisk seng at opretholde kroppens temperatur under evaluering og en næsekegle var sikret med tape over intubationsrøret. Visuel endoskopisk evaluering blev udført af hele spiserøret hjælp af en mini-stiv, fiberoptisk lyskilde Hopkins II Fremadrettede Oblique Telescope 30 ° (diameter 1,9 /2,1 mm, længde 19 cm), og biopsi prøver blev opnået ved hjælp af 1 mm knivspids miniature biopsi pincet med dobbelt-action kæber (Karl Storz, Tuttlingen, Tyskland). Luft blev introduceret gennem sideåbning af endoskop at hjælpe visualisering af distal spiserøret. Fire biopsier blev opnået under hver evaluering, to for histologisk evaluering og to for molekylær korrelat analyse. Alle endoskopiske evalueringer blev registreret ved hjælp af en digital videooptager (AIDA HD Connect DVD, Karl Storz, Tuttlingen, Tyskland). Efter endoskopisk evaluering blev dyrene injiceret intramuskulært for dag 0 til 3 med ketoprofen (3 mg /kg) og enrofloxacin (5 mg /kg) i et forsøg på at reducere ubehag og forhindre luftvejsinfektion fra aspiration. Dyrene blev også placeret på en tre dages modificeret kost progression fra gel kost til mushed pellet kost til normal pellet kost, henholdsvis.

MR Analyse

Alle MRI evalueringer blev udført inden for 24 timer endoskopisk analyse . Dyrene blev bedøvet med isofluoran ved 5% induktion og 2% vedligeholdelse gennem næsekegle. Rotter blev anbragt tilbøjelige onto MRI bord og sikret. En lille pres ballon blev placeret under brysthulen at overvåge respirationsfrekvens og 2-lead elektrokardiogram elektroder blev placeret på venstre front og højre back poter til at overvåge puls (MR-kompatibel model 1030 Overvågning og gating System, Small Animal Instruments, Inc., Stony Brook-, NY). MR-scanninger ved hjælp af en T2-vægtet respiratorisk-gated turbo spin-ekko (TSE) sekvens med et ekko tid (TE) af 27. ms og gentagelse tid (TR) på ca. 1200-1800 msek blev udført ved hjælp af et lille dyr 7 T ClinScan MRI (Bruker) ved anvendelse Siemens MRI-interface (version VB15A). MRI-billeder blev erhvervet i både aksial og koronale fly. Erhvervelse tid var 9-10 min pr fly.

Histologisk Processing og Patologisk Evaluering

biopsiprøver opnået for histologiske formål og til at evaluere molekylære korrelater blev hurtigt nedfrosset i OCT-forbindelse (Tissue-Tek) og i RLT-buffer (Qiagen), hhv. Dyr blev aflivet umiddelbart efter afslutningen af ​​den endelige endoskopisk og MRI-undersøgelser. Ved obduktion blev hele spiserøret og jejunum ca. 1 cm distalt for anastomosen opsamlet og åbnet på langs for visuel inspektion og fjernelse af artefakter, før prøverne blev indlejret i OCT og lynfrosset. Vævssnit blev skåret (5 um) fra OLT blokke og farvet i hæmatoxylin og eosin (fig. 2). To uafhængige erfarne patologi eksperter udført histologisk analyse. Prøver hvor konsensus ikke var nået, samt tumorer ikke er synlige på brutto undersøgelse (ikke-fremspringende; 1 mm i diameter) blev ekskluderet

A, Hæmotoxylin og eosin farvning (forstørrelse × 10) viser histologisk bekræftelse. af ØK. B, Endoskopisk evaluering af den samme rotte. Arrow betegner, mistænkt område tumor identificeret ved endoskopiske undersøgelsens deltagere. C, aksial MRI vurdering. Pilen viser en unormal masse på esophageal væg udvalgt af MRI undersøgelsens deltagere. D, koronal MRI billede. Arrow identificerer tilsvarende tværsnit af mistanke tumor i anastomotiske område af interesse. MR; magnetisk resonans, ØK; esophageal adenocarcinom.

Design af Blinded Interpretation Study

Endoskopi.

Endoskopisk videoer blev redigeret med QuickTime Player (version 10.1, Apple Inc.) til også at omfatte komplet visualisering af den distale esophagus (fig. 2). Videoer blev skåret til at udelukke biopsi scener, så for ikke at skævhed observatøren til potentielle områder af interesse. Alle videoer blev importeret til et diasshow i tre eksemplarer, randomiseret og de-identificeret (PowerPoint 2010, Microsoft). Umiddelbart før undersøgelsen blev esophageal kirurgiske endoscopists og gastroenterologer præsenteret med en tutorial skitserer den kirurgiske model, sigter af undersøgelsen, og klassificering af overfladen slimhinder mønstre. Endoskopisk karakteristika blev beskrevet som følgende:

normal

– karakteriseret ved glatte overflade og endda farve;

esophagitis

– karakteriseret ved forhøjede plaques og højderygge og uigennemsigtig farve med ekssudat;

Barrett’s-lignende-tarm-metaplasi

– karakteriseret ved selv-dukket laks-farvede pletter;

kræft

– præget af uregelmæssige forhøjede masserne og /eller sårdannelse. Observatører blev instrueret til lønklasse hver video som positive eller negative for kræft. Derudover blev observatørerne bedt om at manuelt cirkel formodede områder af positiv tumor i videoen til den første tredobbelte delmængde bruger PowerPoint Håndskriftsfunktioner. Alle slideshows blev registreret for at bevare anmærkninger.

MR.

Alle MRI DICOM-billeder blev overført til OsiriX (version 4.1, Pixmeo Sari) i tre eksemplarer, randomiseret og de-identificeret for blindede undersøgelse evaluering. Undersøgelse deltagere blev præsenteret med en tutorial skitserer den kirurgiske model, sigter af undersøgelsen, og klassificering af patologi som følger:

normal

– selv tykkelse esophageal væg fra proximal til distal spiserøret

godartet striktur

– stigning i tykkelsen af ​​esophageal væg i distal spiserøret med glatte grænser; – Ujævn stigning i esophageal væg resulterer i uregelmæssig masse. Radiolog eksperter blev instrueret i at fortolke MRI-billeder korrelerede i aksial og koronale fly og optage positiv eller negativ for cancer (fig. 2). Derudover blev deltagerne bedt om at cirkel formodede områder af tumor på de aksiale billeder af den første triplikat delmængde. Alle billeder, der indeholder anmærkninger blev reddet.

Statistisk analyse

Procent aftale blev beregnet som det samlede antal gange rater aftalt med histologi divideret med det samlede antal aflæsninger afsluttet. Cohens kappa blev brugt som et mål for aftale mellem en individuel rater og histologiske diagnoser (fx positiv eller negativ kræft). Kappa-værdier blev vurderet på følgende måde: 0 repræsenterer ingen aftale; mellem 0,01-0,20 repræsenterer svag aftale; mellem 0,21 til 0,40, fair aftale; mellem 0,41-0,60, moderat aftale; mellem 0,61-0,80 væsentlig aftale; og mellem 0,81 til 0,99 glimrende aftale [23]. Den intraclass Korrelationskoefficienten (ICC) blev anvendt til at estimere mellem og inden rater pålidelighed for tumor tilstedeværelse /fravær fra esophageal kirurgiske endoscopists og gastroenterologer set endoskopi videoer og radiologer læsning MRI-scanninger. ICC kan variere fra 0 (ingen aftale) til 1 (fuld enighed). Stigende ICC for både inter og intra-rater pålidelighed indikerer stigende aftale. Fem individuelle raters læse hver rotte tre gange til MRI. Fem forskellige raters læse hver rotte tre gange til endoskopi. En konsensus læsning (≥2 /3) blev bestemt for hver rater og hver rotte. Et gennemsnit på alle konsensus ratings for alle raters blev bestemt for hver modalitet. Følsomhed, specificitet og falsk negative og falsk positive værdier blev beregnet ved hjælp af histologi som reference standard. En modtager opererer karakteristik (ROC) kurve blev konstrueret for MRI og endoskopi hjælp gennemsnitlige konsensus rating som test variabel og histologi som staten variabel. En p-værdi 0,05 blev anset for at indikere statistisk signifikans. Dataene blev analyseret ved hjælp af PASW Statistics, udgave 18.0 (IBM-SPSS, Inc., Chicago).

Resultater

Rotter og Histologi

En kohorte af 38 dyr, har undergået den modificerede Levrat klinik, blev udvalgt til at modtage endoskopisk og MRI evaluering på 32, 36 og 40 uger efter operation. Ti dyr blev fjernet fra undersøgelsen på grund af indledende død (26,3%). Obduktioner blev dannet på alle dyr og dødsårsager inkluderet: vægttab (n = 5), akut luftvejsinfektion (n = 2), og ukendte (n = 3). Den rapporterede dødelighed og tilhørende dødsårsager var i overensstemmelse med tidligere rapporterede undersøgelser udnytte Levrat model [13].

Histologisk evaluering blev udført på alle resterende 28 studier prøver og verificeret af en uafhængig observatør. Prøver hvor konsensus ikke kunne nås til histologi (n = 5) og mikroskopiske tumorer (n = 4) blev fjernet fra undersøgelsen kohorte, hvilket resulterer i en endelig undersøgelse stikprøve på 19 dyr. Af de 19 dyr, blev 57,9% rapporteret at have EAC (n = 11). Der var ingen signifikant sammenhæng mellem endoskopiske biopsier og post-mortem histologi (data ikke vist), som de fleste prøver var vanskelige læser skyldes knuse artefakt, utilstrækkelig dybde eller ubestemt orientering.

Endoskopisk Analyse

af de 5 blindede undersøgelsens deltagere, procentdel aftale med histologi lå mellem 42,1% -57,9%, med et gennemsnit aftale på 50,5% (fig. 3). Kappa værdier for de enkelte raters faldt mellem -0.044-0.165, og ingen evalueringer nåede statistisk signifikans (p-værdi 0,05) (tabel 1). 47.37% af scanninger kunne læses med mindst 80% nøjagtighed (9/19) (fig. 3). Intra-rater pålidelighed ICCs varierede mellem 0,667-0,873 blandt tredobbelte scanninger; mens inter-rater ICC var 0,608. ROC kurve analyse produceret et område under kurven (AUC) af 0,534 (SE = 0,138; asymptotiske betydning = 0,804; 95% konfidensinterval, 0,263-0,805) (Fig. 4). Følsomhed af endoskopi var 0,455 (95% konfidensinterval, 0,323-0,586), specificitet var 0,575 (95% konfidensinterval, 0,422-0,728) og diagnostisk nøjagtighed (effektivitet) var 0,505 (95% konfidensinterval, 0,405 til 0,606). Gennemsnitlige falsk positive og gennemsnitlige falsk negative var 0,425 (95% konfidensinterval, 0,272-0,578) og 0,546 (95% konfidensinterval, 0.0.414-0.679), hhv. Selv når 5/5 endoskopi evaluatorer vurderet en tumor som positiv, der var en 40% falsk positive rate

A, Grafen viser procent nøjagtighed af de enkelte scanninger når vurderet af hver teknik:. Visuel endoskopi og MR. B, Grafen sammenligner gennemsnitlige nøjagtighed hver teknik, som vurderet af blindet undersøgelse. MR; magnetisk resonans

A, ROC kurve af gennemsnit endoskopisk læsning. (AUC = 0,534; SE = 0,138; asymptotiske betydning = 0,80; 95% konfidensinterval, 0,263-0,805). B, ROC kurve af gennemsnit MRI læsning. (AUC = 0,966; SE = 0,036; asymptotiske betydning 0,001; 95% konfidensinterval, 0-1,0). ROC; receiver operating characteristic, AUC; areal under kurven, SE; standard fejl.

MRI Evaluering

Procent aftale med histologi af MRI deltagere lå mellem 78,95% -94,7% med en gennemsnitlig aftale på 85,3% (fig. 3), og kappa værdier af individuelle satser mellem 0,553-0,890. Alle raters nåede statistisk signifikans (p-værdi 0,05) (tabel 1). 78.95% af scanninger kunne læses med mindst 80% nøjagtighed (15/19) (fig. 3). Intra-rater pålidelighed ICCs blandt tredobbelte scanninger faldt mellem 0,315-0,785 og inter-rater ICC var 0,624. ROC kurve analyse bestemt en AUC på 0,966 (SE = 0,035; asymptotiske betydning 0,001; 95% konfidensinterval, 0-1,00) med følsomhed på 0,891 (95% konfidensinterval, 0,809-0,973), specificitet 0.800 (95% tillid interval, 0,676 til 0,924), og effektiviteten af ​​0,853 (95% konfidensinterval, 0,781-0,924) (fig. 4). Gennemsnitlige falsk positive og falsk negative var 0,200 (95% konfidensinterval, 0,076-0,324) og 0,109 (95% konfidensinterval, 0,027-0,208), hhv. Med en gennemsnitlig MRI rating på 0,80 eller større (4/5 eller 5/5 vurderinger er positive for tumor), blev MR gennemsnitlige bedømmelse noteret for at være prædiktiv for tumor uden falske positiver.

Diskussion

søgningen efter nye metoder til ØK behandling er blevet ekstremt vigtigt i de senere år med stigningen af ​​patienter med kræft i spiserøret. [24], [25]. Da MR nylig var blevet udnyttet med succes i små dyr translationelle modeller for andre typer af cancere [20] – [22], vi havde til formål at teste evnen af ​​MRI til effektivt diagnosticere esophageal tumor i Levrat modellen sammenlignet med endoskopi. Som bemærket, fandt vi MRI at være en meget gyldig og pålidelig metode til påvisning af esophageale tumorer sammenlignet med endoskopi. Selvom endoskopisk evaluering har sine egne fordele, i vores undersøgelse, biopsier kunne ikke give pålidelig histologi på grund af den lille prøvestørrelse og kompliceret orientering.

Sammenlignet med endoskopisk evaluering blev MRI noteret for at være overlegen i detektering af adenocarcinom på alle niveauer, herunder nøjagtighed, sensitivitet, specificitet og effektivitet. Inter-observatør konsensus var også højere for MR indikerer fremtidige evalueringer vil sandsynligvis producere lignende resultater. Intra-observatør enighed blandt tredobbelte aflæsninger var den eneste variabel, hvor endoskopiske værdier repræsenterede et højere interval, hvilket indikerer øget konsensus blandt endoskopiske aflæsninger. Alligevel MR scanninger med de laveste niveauer af intra-observatør konsensus var i overensstemmelse med scanninger producerer laveste nøjagtighed niveauer, hvilket indikerer variabilitet var for det meste begrænset til vanskelige scanninger. Der var fire tilfælde, hvor den gennemsnitlige nøjagtighed MR-scanninger blev noteret til at være under 80%. I tre af tilfældene, fortolkningen var vanskeligt på grund af tilstedeværelsen af ​​en byld på det anastomotiske sted eller maven; mens der i det fjerde tilfælde, var der betydelig bevægelse effekt.

Den ikke-invasive karakter af MRI, dens evne til præcist at identificere kræft, og integration i Levrat modellen gør modalitet endnu mere relevant at vurdere nye agenter og deres effektivitet i behandling studier. Den høje nøjagtighed og lave falske positive satser indikerer MR ville være en pålidelig metode til at differentiere kræft vs ingen kræftbehandling arme med minimal fejl. Desuden skulle lav falsk negativ-raten også hjælpe med at maksimere effektiviteten og minimere mængden af ​​dyr, der er nødvendige for en bestemt protokol. På den anden side, endoskopi frembragte en 40% falske positive, selv når alle endoskopiske eksperter enige tumor var til stede. Derfor ville visuel endoskopi være en dårlig diskriminator tumor status for en sådan undersøgelse.

Begrænsninger af vores undersøgelse omfatter den lille stikprøve. Endvidere selvom den specifikke sekvens brugt i dette studie var i stand til nøjagtigt at detektere tilstedeværelsen af ​​tumoren, hele volumenet af mistænkelige masser blev ikke kvantificeret på grund af den iboende 2-dimensional karakter af TSE scanning. Fremtidige undersøgelser kan drage fordel af en 3-dimensionel scanning. En 3-D MRI-sekvens integrerer den aksiale, koronale, og isseplanerne for at muliggøre nøjagtig volumetrisk kvantificering af anatomiske træk. I den skitserede model kan en 3-D MR-scanning anvendes til at analysere effektiviteten i en behandling model ved at tilvejebringe tumorvolumen før og efter behandling. Udnyttelse af kontrastmidler til at forbedre anastomotiske interesseområde og differentiere tumor vil yderligere øge nøjagtigheden af ​​denne modalitet.

Tak

Forfatterne vil også gerne takke University of Pittsburgh Cancer Institute, specifikt Erik Weiner, Paul Schornack, og Michael K. Gibson for deres støtte i vores indsats.