PLoS ONE: Kvantitativ proteomanalyse af Oral Brush Biopsier Identificerer Sekretorisk leukocyt proteasehæmmer som en lovende, Mechanism-Based Oral Cancer Biomarkør

Abstrakt

Et fald i næsten halvtreds procent dødelighed fra kræft i mundhulen er et presserende behov. Forbedringer i tidlig diagnose og mere effektive forebyggende behandlinger kan påvirke et sådant fald. Mod herpå vi påtog for første gang en grundig massespektrometri-baseret kvantitativ shotgun proteomics undersøgelse af ikke-invasivt indsamlede mundtlige børste biopsier. Proteiner isoleret fra børste biopsier fra sundt normalt væv, orale præmaligne læsion væv (OPMLs), oral planocellulært karcinom (OSCC) og matches kontrol væv blev sammenlignet. I replikerede proteom datasæt, stod den sekretoriske leukocyt proteasehæmmer (SLPI) protein ud baseret på dens fald i overflod i både OPML og OSCC læsion væv sammenlignet med raske normale væv. Western blotting i yderligere børstet biopsiprøver bekræftede en tendens til gradvis faldende SLPI overflod mellem sund normal og OPML væv, med et større fald i OSCC læsion væv. En lignende SLPI fald blev observeret

in vitro

sammenligne model OPML og OSCC cellelinjer. Desuden afstødes orale celler i patienternes hele spyt viste et underskud på SLPI korreleret med oral cancer progression. Disse resultater, kombineret med proteomics data, der indikerer et fald i SLPI i matchede raske kontrol væv fra OSCC patienter sammenlignet med væv fra sundt normalt væv, foreslog en systemisk fald i SLPI i orale celler korrelerede med oral cancerudvikling. Endelig

in vitro

forsøg viste, at behandling med SLPI faldt betydeligt NF-kB-aktivitet i en OPML-cellelinje. Resultaterne indikerer anti-inflammatorisk aktivitet i OPML, støtte en mekanistisk rolle SLPI i OSCC progression og tyder på potentiale for forebyggende behandling af udsatte orale læsioner. Kollektivt, vores resultater viser for første gang muligheden for SLPI som en mekanisme-baseret, ikke-invasiv biomarkør for oral cancer progression med potentiale i forebyggende behandling

Henvisning:. Yang Y, Rhodus NL, Ondrey FG, Wuertz BRK, Chen X, Zhu Y, et al. (2014) Kvantitativ proteomanalyse af Oral Brush Biopsier Identificerer Sekretorisk leukocyt proteasehæmmer som en lovende, Mechanism-Based Oral Cancer Biomarkør. PLoS ONE 9 (4): e95389. doi: 10,1371 /journal.pone.0095389

Redaktør: John M. Koomen, Moffitt Cancer Center, USA

Modtaget: Januar 3, 2014 Accepteret: 25 marts 2014; Udgivet: 18 April, 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud 1R01DE017734 fra National Institutes of Health (US) til TJG og forskningsbevillinger 81000439 og 81271134 fra National Natural Science Foundation of China til Y.Y. og Y.Z. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

desværre overlevelsesraten for mennesker diagnosticeret med oral cancer, overvejende i form af orale pladecellecarcinom (OSCC), er kun en smule bedre end 50% [1]. OSCC indledes med forekomsten af ​​en mundtlig præmaligne læsion, almindeligvis leukoplakia, der forvandler til invasiv cancer i 5% til 17% af tilfældene [2], [3]. Hvis diagnosen tidligt, forebyggende behandlinger er mere effektive, øger overlevelsesraten til 80% eller bedre [4]. Således er der et presserende behov for bedre måder at diagnosticere og behandle i risikogruppen OPML og /eller tidlige fase OSCC orale læsioner [2].

Invasive incisional biopsi efterfulgt af histopatologi er den nuværende guldstandarden til oral kræftdiagnose [5]. Desværre, det har mange begrænsninger. Den invasive og dyre naturen fører til mindre hyppig testning af mistænkelige læsioner, og dermed en forsinket diagnose af OSCC [6], [7]. En retrospektiv undersøgelse viste kun omkring en 14% opfølgende sats for skalpel biopsier inden for en [2] 3-årig periode. Derudover skalpel biopsi er tilbøjelige til at under-sampling af læsioner [8], [9], hvilket fører til fejl i diagnosen.

På baggrund af disse begrænsninger af skalpel biopsi, megen opmærksomhed er blevet givet til at identificere molekylære biomarkører vejledende af sygdom i ikke-invasivt indsamlede patientprøver [10]. En lovende non-invasiv prøvetagning metode er brugen af ​​børste biopsier [11], [12]. Her er en relativt stiv børste bruges til forsigtigt at indsamle en prøve af trans-epitelceller direkte fra den orale læsion, eller matchet mundslimhinden. Denne samling er enkel og billig, med minimalt ubehag for patienten. Vigtigst det giver en potentielt indholdsrigt sampling af celler direkte fra læsion, der kan analyseres yderligere [11], [12].

At udvikle ikke-invasivt indsamlet molekylære biomarkører fra børste biopsier, lovende kandidat molekyler inden disse prøver skal først identificeres. Storstilede teknologier til molekylær profilering (fx genomik, proteomik) kan identificere sådanne kandidater. Især kunne analyse ved hjælp af massespektrometri-baseret proteomanalyse giver ikke blot fører på handlingsrettede protein biomarkører fra disse prøver, men også underliggende viden om kræft progression mekanismer og mulige mål for behandling. den proteomisk analyse af orale børste biopsier via MS-baserede proteomics har imidlertid set, begrænset opmærksomhed [13], [14], især ved hjælp af de mest moderne teknologier på området. Til dato har ingen anvendt kvantitative shotgun MS-baserede proteomics, nok den mest alsidige og dybdegående metode til kendetegner proteomer [15], til oral børste biopsi analyse.

I denne undersøgelse har vi anvendt kvantitativ shotgun MS-baserede proteomics til analysen af ​​børste biopsier indsamlet fra sunde normale væv, OPML og OSCC. Blandt en række replikerede proteiner viser overflod forskelle, viste den sekretoriske leukocyt-proteaseinhibitor (SLPI) protein dramatisk fald i forhold til normale væv korrelerede med trinnene oral cancer progression. Denne nedsatte overflod af SLPI blev verificeret via Western blotting i børste biopsiprøver, og blev også observeret i eksfolierede celler i spyt fra OPML og OSCC patienter. I overensstemmelse med patientresultater, model cellelinjer af OPML og OSCC viste også et fald i SLPI. Derudover behandling af en model OPML cellelinie med SLPI viste en inhibering af NF-KB-aktivitet, en transskriptionsfaktor vides at spille en rolle i inflammatoriske mekanismer, der ligger oral cancerudvikling. Kollektivt, vores resultater viser for første gang et progressivt tab af SLPI overflod i overgangen fra OPML til OSCC, og foreslå en ny rolle for SLPI som en mekanisme-forbundet, ikke-invasiv biomarkør for oral cancer, med potentiale som en OPML behandling agent.

Materialer og metoder

Patienter og prøver

undersøgelsen blev udført med informeret skriftligt samtykke fra alle prøve donorer bruger et menneske protokol godkendt af Institutional Review Board på University of Minnesota (IRB undersøgelse nummer 0001M34501). Alle spyt samlinger blev gjort uden stimulation via passiv savlen, i løbet af dagen mellem kl 09:00 og 05:00. Spyt og børste biopsier blev opsamlet fra 11 patienter diagnosticeret med en dysplastiske OPML og 11 patienter med OSCC på University of Minnesota Otolaryngology klinik. For hver patient blev spytprøver først indsamlet, efterfulgt af samling af børsten biopsier fra læsionen og den sunde slimhinde af tilsvarende kontralaterale område, der anvender Rovers Orcellex børster (Rovers Medical Devices B.V., Holland). Brush biopsier fra mundslimhinden, og hele spyt blev også indsamlet fra 10 raske frivillige. De raske frivillige havde ingen større risikofaktorer for OSCC (ikke-rygere, moderat til lav indtagelse af alkohol) og var fri for orale læsioner. Umiddelbart efter indsamling blev prøverne opbevaret ved -20 ° C, og derefter overført til -70 ° C indtil anvendelse. Desuden information om tobak og alkohol brug af patienterne blev indsamlet. Kendetegnene for undersøgelsespopulationen er opsummeret i tabel S1.

cellelinier

MSK Leuk1 celler [16], vokset fra mundslimhinden støder op til orale leukoplakia læsioner, var en gave fra Dr. Peter Sække, New York University. MSK Leuk1 celler blev dyrket i KGM-2 Medium (Lonza Walkersville, MD) suppleret med ekstrakt fra bovin hypofyse, rekombinant human epidermal vækstfaktor, rekombinant humant insulin, hydrocortison, epinephrin, og transferrin ved 37 ° C i 5% CO

2 .

Transformeret humane epidermale keratinocytter (Rhek) udødeliggjort af Ad 12-SV40 virus [17] blev opnået fra Dr. Jhong S. Rhim på National Cancer Institute, (Frederick, MD). Den OSCC cellelinje CA-9-22 [18], var en gave fra Toshio Kuroki, MD. Celler blev holdt i Eagles minimale essentielle medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, L-glutamin (5,8 mg /ml), og penicillin /streptomycin (50 ug /ml) ved 37 ° C i 5% CO

2 som adhærerende monolagskulturer.

Børstet Biopsi Prøveforberedelse

For MS-baserede proteomisk opdagelse undersøgelser og Western blot valideringsstudier, børste biopsi prøver fra spørgsmål, der falder i de to grupper var forberedt identisk. For at maksimere genvinding af peptider og minimere prøve håndteringstrin, vi anvendte en “on-brush” fordøjelse metode til at producere en peptidopløsning til MS-baserede proteomics analyse (se figur 1A i afsnittet Resultater). Børstehovedet nedsænkes og lyseret i 50 mM tris pH 8,0 med 2% SDS ved 95 ° C i 10 min med intermitterende hvirvelbehandling. Cellerester blev fjernet ved centrifugering ved 16 100 x g og udvinding af supernatanten til et rent mikrocentrifugerør. Protein Recovery blev målt under anvendelse af BCA-assayet (Thermo Scientific). De udvundne proteiner blev derefter spaltet og forarbejdet til efterfølgende massespektrometrianalyse eller anvendt til Western blot-validering.

A. Børst biopsi indsamling og prøveforberedelse protokol. B. Eksperimentel design til kvantitative MS-baserede proteomics eksperimenter. Et eksperiment brugt matchet væv fra OPML patienter, mens det andet forsøg brugte matchet væv fra OSCC patienter.

isobarisk Peptide Tagging og Sample Preparation

Proteiner fra børstet celler blev reduceret i DTT for 1 time ved 55 ° C og trypsin spaltet under anvendelse af en modificeret FASP protokol [19]. Iodacetamid blev anvendt som cystein alkyleringsreagens. De resulterende peptider blev afsaltet under anvendelse af fast-fase ekstraktionspatroner (tC18 Sep-Pak, Waters). Peptider blev derefter opløst i producentleveret puffer og mærket med iTRAQ reagens (Applied Biosystems) ved stuetemperatur i 1 time og afsaltet med Sep-Pak-patroner. Salg

Prøver blev næste fraktioneret ved off-line semipræparativ HPLC. De kombinerede, iTRAQ-mærkede peptider blev resuspenderet i Buffer A (10 mM ammoniumformiat pH 10 i 98:2 vand: acetonitril) og fraktioneret offline ved høj pH C18 omvendt fase (RP) kromatografi [20]. En MAGIC 2002 HPLC (Michrom Bioressourcer, Inc., Auburn, CA) blev anvendt med en C18 Gemini-NX-søjle, 150 mm x 2 mm indre diameter 5 um partikel, 110 Å porestørrelse (Phenomenex, Torrence, CA). Buffer A var 10 mM ammoniumformiat, pH 10 i 98:2 vand: acetonitril og puffer B var 10 mM ammoniumformiat, pH 10 i 10:90 vand: acetonitril. Strømningshastigheden var 150 pl /min. med en gradient fra 0-35% puffer B i løbet af 60 min., efterfulgt af 35-60% i løbet af 5 min. Fraktioner blev opsamlet hvert 2. minut og UV-absorbans blev monitoreret ved 215 nm og 280 nm. Peptid fraktioner blev delt i to lige nummererede grupper, “tidlige” og “sene”. Den første “tidlige” fraktion blev sammenkædet med den første “sen” fraktion, og så videre. Sammenkædede prøver blev tørret i vakuum, resuspenderet i belastning opløsningsmiddel (98:2:0.01, vand: acetonitril: myresyre). Forud for massespektrometrisk analyse

massespektrometrisk analyse

En lineær ionfælde -Orbitrap (LTQ-Orbitrap) Velos instrument (Thermo Fisher Scientific) [21] blev brugt til massespektrometri. Instrumentet blev drevet i en top-ti data afhængig tilstand beskæftiger undersøgelsen scanninger på 30.000 opløsning 300-1800 m /z. Tandem MS (MS /MS) scanninger er erhvervet med en isolation bredde på 2 m /z og højere energi kollisionsdæmper dissociation (HCD) fragmentering mode. 40% normaliseret kollisionsenergi blev anvendt med en 20 millisekunders varighed. automatiske indstillinger gain kontrol var 3 × 10

5 ioner i ion trap, og 1 × 10

6 i Orbitrap. Dynamisk udelukkelse blev anvendt med en varighed på 15 sekunder, og en gentagelse optælling af 1.

Protein Identifikation og kvantificering

Rå filer blev konverteret til mzXml hjælp msconvert (distribueres som en del af ProteoWizard 1260/06/01) . MS /MS-spektre blev søgt mod UniProt menneskelige database herunder scrambled sekvenser og fælles forurenende proteiner (i alt 136,002 poster) ved hjælp SEQUEST v27.0. Søgeparametre omfattede en 1,6 amu (atommasseenheder) forløber og 0,8 amu fragment masse tolerance, 2 ubesvarede spaltninger, delvis trypsin specificitet, faste modifikationer af carbamidomethylated cystein, iTRAQ reagens modifikation på lysiner og N-termini, og variabel ændring af methionin oxidation. Søgeresultater blev filtreret til 99% protein sandsynlighed og 95% peptid sandsynlighed i Scaffold (v3.3.1, Proteome Software), der producerer en falsk opdagelse sats på 1%. Proteiner blev kvantificeret ved hjælp af tilpasset software udviklet in-house [22]. Kun proteiner identificeret fra to eller flere MS /MS-spektre tilpasset peptider blev anset for kvantitativ analyse. P-værdier blev tildelt til hvert protein kvantificeres ved tre eller flere MS /MS-spektre, som beskrevet [22]. Tabel S2 viser alle oplysninger for proteiner identificerede og kvantificerede i disse eksperimenter.

Western blotting Eksperimenter

For vestlige blotting eksperimenter, en uafhængig sæt prøver blev brugt på grund af manglende prøvemateriale fra den indledende prøve, der bruges i MS-baserede proteom eksperimenter. Tredive mikrogram (ug) af børste biopsi protein fra hver enkelt fag analyseres Valideringsforsøg eller halvtreds ug protein fra cellelysater af cellelinier, sammen med tredive ug positiv kontrol protein, blev adskilt ved 12% SDS-PAGE. Proteiner blev derefter overført til en PVDF-membran (Millipore) og probet med polyklonale kanin anti-SLPI antistof (1:250; Abcam ab46763). Blottene blev mærket med peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer (1:10,000) og visualiseret med et ECL detektionssystem (Thermo Scientific).

For hele spyt, ustimulerede prøver blev indsamlet fra et uafhængigt sæt fag (4 raske frivillige, 5 patienter med OPML og 5 patienter med primær OSCC). Spyt blev centrifugeret ved 3000 x g ved 4 ° C, supernatanten indeholdende den opløselige fraktion af spyt-proteiner blev opsamlet, og cellepellets vasket med PBS og lyseret for at opnå cellulære proteiner. Totalt protein blev kvantificeret under anvendelse af BCA-assayet (Thermo Pierce).

reportergenassays Salg

cellelinier blev udpladet med 50.000 celler /brønd i 12 brønd plader og transient cotransficeret via Transit Express reagens (MirusBio, Madison, WI) med en pIgκB-Luc-reportergen plasmid 24 timer senere sammen med en pCMV Lac-Z reporter indeholdende CMV-promotoren og Lac-Z-genet i pcDNA3 for at justere for transfektionseffektivitet. Den pIgκB-Luc reporter konstruktion indeholder tre immunglobulin G-κ kæde NF-KB-bindingssteder kørsel luciferasegenet og blev venligst stillet til rådighed for os af Dr. K. Brown (NIAID, NIH). Efter natten over transfektion blev celler behandlet med rekombinant humant SLPI (R 2 gange) i vores undersøgelse. Interessant kun tre af disse proteiner viste overflod ændringer i begge vævstyper (OPML og OSCC) sammenlignet med raske normale (fed tekst i tabel 1).

Af disse proteiner er vist i tabel 1, den sekretoriske leukocyt Protease Inhibitor (SLPI), stod ud baseret på dens store fald i både OPML og OSCC væv sammenlignet med raske raske (19.5 og 12.4 gennemsnitlig overflod fald for OPML og OSCC væv, henholdsvis). Baseret på disse resultater, og den kendte rolle SLPI som en proteasehæmmer med forbindelser til oral cancer [26], valgte vi at yderligere at validere og undersøge dette protein. Til dette formål vi først videre afhørt de kvantitative proteomics data på SLPI. Af note var resultaterne fra det andet iTRAQ eksperiment, som omfattede den matchede OSCC raske kontrol væv. Resultaterne viste, at ikke blot var SLPI faldt i OSCC læsion væv sammenlignet med raske normaler, men også det blev reduceret i den matchede raske væv sammenlignet med de sunde normale væv (figur 2). En forholdsvis lille fald blev også observeret i den første iTRAQ eksperimentet mellem matchede væv fra OPML patienter og raske normale væv (Tabel S2).

Validering Cancer Progression-afhængige SLPI Overflod Dynamics i uafhængige prøver

for at validere den observerede overflod fald i SLPI i både OPML og OSCC væv, vi først forfulgte semikvantitative western blotting eksperimenter i ekstra børste biopsiprøver. Som vist i figur 3A, Western blots bekræftede de MS-baserede resultater, som SLPI overflod viste et gradvist fald mellem sundt normalt væv og OPML væv, med en mere dramatisk nedgang i OSCC væv. Figur S1 viser resultater loading kontrol via total protein-farvning af membraner, der anvendes til resultaterne vist i figur 3. Derudover har vi samlet un-stimulerede hele spytprøver fra de samme patienter der er gået med at børste biopsier. Vi isolerede de eksfolierede celler i disse prøver via centrifugering og undersøgt de isolerede proteiner til SLPI efter cellelyse. Resultaterne viste en lignende tendens i overflod fald i SLPI mellem raske normale væv og både OPML og OSCC væv (figur 3B). Analyse af de opløselige proteiner i spyt supernatanter viste en mindre konsistent trend (data ikke vist).

A. Verifikation af nedsat SLPI i væv, der indsamles med pensel biopsi. B. SLPI overflod niveauer målt i eksfolierede celler fra hele spyt. C. SLPI overflod niveauer målt i model-cellelinjer. Positive kontrol er et normalt rask menneske spytprøve; Rhek celler er fra en normal epitelial cellelinje, MSK er en model OPML cellelinje (MSK-Leuk1) og CA9-22 er en model OSCC cellelinie.

Vi testede også overflod af SLPI-protein i model OPML og OSCC cellelinjer (figur 3C). Her valgte vi at sammenligne opløselige proteiner isoleret fra helcellelysater fra kontrol RHEK celler, MSK-leuk1 celler (en model cellelinje OPML [27]) og Ca9-22 celler (en model cellelinje OSCC [28]). Svarende til resultaterne fra patient børste biopsier, observerede vi et dramatisk fald i SLPI i MSK-leuk1 og Ca9-22 cellelinjer sammenlignet med raske kontrolpersoner celler.

Test Potentielle Anti-inflammatoriske virkninger af SLPI Behandling på OPMLs

rolle NF-KB-aktivering og regulering af pro-inflammatoriske faktorer i den mekanisme, der ligger til grund overgangen fra OPML til OSCC er velkendt [29], [30], [31]. Beviser eksisterer der viser, at SLPI hæmmer NF-KB [32], [33], selv om dette er ikke påvist i modeller for oral cancer. I betragtning af denne dokumentation, søgte vi at undersøge, hvorvidt eller ikke SLPI falder NF-KB-aktivitet i MSK-Leuk1 celler, under anvendelse af en luciferase-baserede reporter assay [34]. Vi behandlede de transficerede MSK Leuk1 celler med to forskellige koncentrationer af rent SLPI-peptid (20 ug /ml og 40 ug /ml) og målt NF-KB på forskellige tidspunkter efter behandling (figur 4). Resultater for begge behandlinger var sammenlignelige, med både viser en ca. 40% fald i NF-KB efter 24 timers SLPI behandling. Behandling med en lavere mængde SLPI (10 ug /ml) udviste en mindre og mindre pålidelig formindskelse i NF-KB-aktivitet (data ikke vist).

Fold-ændring af en NF-KB reportergenassay i forhold til kontrol køretøj plottes på forskellige tidspunkter efter behandling.

diskussion

Vi har udført en første-of-its-kind, dybtgående kvantitativ shotgun proteomics analyse af ikke-invasivt indsamlede mundtlige børste biopsiprøver, der søger at identificere protein overflod ændringer i forbindelse med oral cancer progression. Brush biopsier er kendt for deres værdi som en ikke-invasivt indsamlet celleprøve for kræft oral diagnostiske anvendelser [11], [12]. Imidlertid har MS-baserede proteomiske studier udnytter disse potentielt informationsrige prøver været begrænset. Især Driemel et al [13] anvendte overflade-forstærket laser desorption /ionisering (SELDI) MS til kvantitativt profil børste biopsiprøver og identificere potentielle biomarkører for progression. Remmerbach et al [14] brugt mere standard MALDI-MS til at analysere proteiner isoleret fra børste biopsier så godt. Selv om disse undersøgelser haft en vis succes, anvendelse af en SELDI eller MALDI-baserede metoder på kompleks blanding er begrænset til en delmængde af relativt små proteiner og /eller peptider i prøverne af interesse.

MS-baserede shotgun proteomics på den anden side giver et ekspanderet billede af børste biopsi proteomer, givet sin evne til at identificere og kvantificere proteiner af alle molekylvægt klasser [15]. Vores undersøgelse giver den første demonstration af shotgun proteomics anvendes til mundtlig børste biopsiprøver. Et spørgsmål i starten af ​​denne undersøgelse var, om celler indsamlet via børste biopsi ville give rigelig total protein for en storstilet proteomisk analyse. Vi fandt, at en on-børste cellelyse metode billede bedre udbytte (i hvert fald snese mikrogram totalt protein) end at forsøge at vaske celler fri af børsten inden lyse (data ikke vist). Vores resultater bør bane vejen for yderligere shotgun proteomisk analyser af børste biopsier til karakterisering orale læsioner i forskellige sammenhænge.

Vores gentagne analyser sammenligne sundt normalt væv til OPML og OSCC væv, samt matchede kontroller, afslørede en række af interessante proteiner, der viser ændringer i overflod. Selv om andre kandidater fortjener yderligere validering blev identificeret, valgte vi at fokusere på SLPI, givet sin store og reproducerbar fald i overflod i både OPML og OSCC væv i forhold til raske normale væv. Forskere har traditionelt erkendt rolle SLPI ved inhibering serinproteaser; dog kendskab til sine funktioner har fortsat med at udvide til også at omfatte antimikrobielle, immunitet og anti-inflammatoriske roller [35]. SLPI rolle i oral cancer progression er mindre kendt, men de seneste resultater i biopsi væv skiver viste et fald i SLPI i OSCC væv sammenlignet med raske, samt en potentiel rolle i at hæmme invasiv [26].

Vores undersøgelse har afsløret en række nye resultater om SLPI mulige rolle i kræft i mundhulen. For en, vores resultater er de første til at demonstrere et betydeligt fald i SLPI i ikke-invasivt indsamlede mundtlige børste biopsiprøver, samt den cellulære brøkdel af hele spyt. Disse resultater er i overensstemmelse med de seneste resultater viser en SLPI overflod fald i OSCC vævssnit indsamlet via traditionel skalpel biopsi [26]. Vigtigere vores undersøgelse er den første til at undersøge både OPML og OSCC væv, viser en fremadskridende tab af SLPI i den præ-malign tilstand, efterfulgt af et mere dramatisk nedgang OSCC. Vores resultater tyder på en potentiel rolle for SLPI som en ikke-invasivt indsamlet diagnostisk eller prognostisk biomarkør i enten OPML eller OSCC væv – en betydelig fund givet det presserende behov for enklere og billigere tests for kræft i mundhulen, der omgår ulemperne ved skalpel biopsi [8] [9].

Vores resultater tyder også en mekanistisk rolle for SLPI i oral cancer progression. Nylige fund med

in vitro

cellekultur har antydet, at SLPI hæmmer invasiv af orale cancerceller [26]. Udvide disse fund, tyder vore resultater en systemisk fald i SLPI mindste i orale epitelceller, hos patienter er modtagelige for oral cancerudvikling. Denne påstand blev understøttet af om en 5 gange formindskelse i SLPI i matchede raske væv sammenlignet med raske normale kontroller, med en samstemmende fald i overflod i eksfolierede celler i spyt. Opgørelse (f.eks genetiske, epigenetiske etc.) for denne samlede tab i SLPI overflod i patienter, der udvikler OSCC vil tage mere undersøgelse.

Vores resultater påviser, at SLPI hæmmer NF-KB transkriptionel aktivitet in vitro i OPML celler støtter yderligere sin mekanistiske rolle i oral cancer progression. Øget NF-KB transkriptionel aktivitet, aktivering ekspression af pro-inflammatoriske cytokiner, er en velkendt faktor i OSCC udvikling [29], [30], [31]. Et fald i SLPI overflod kan, i det mindste delvis, være en medvirkende faktor til pro-inflammatorisk tilstand, der fører til OSCC. Andre har vist en rolle for SLPI som en inhibitor af NF-KB-aktivitet, hvilket viser, at det kan forstyrre signalvejen fører NF-KB-aktivering [36] og /eller muligvis konkurrerer om binding til DNA ved NF-KB regulatoriske sites [32 ]. Vores undersøgelse er den første til at vise SLPI som en inhibitor af NF-KB i forbindelse med oral cancer, specielt i en model OPML cellelinie. Forståelse den nøjagtige mekanisme af hæmning vil tage mere undersøgelse. Vores observation åbner spændende mulighed for SLPI som option for udsatte OPML læsioner behandling, som sådanne behandlinger er et presserende behov for at forhindre udvikling af invasiv OSCC. SLPI tilbyder mulige fordele i en sådan ansøgning, da det er en lille protein (ca. 11 kDa), der vides at være fri for post-translationelle modifikationer, og vist at blive taget op af celler let [32].

vores resultater generere en række interessante hypoteser for afprøvning i fremtiden. For én kunne muligheden for SLPI som en ikke-invasivt indsamlet diagnostisk eller prognostisk biomarkør afprøves i større kohorter af OPML og OSCC patienter. Dets rolle som en inhibitor af NF-KB i OPML, med potentiale for forebyggende behandling kunne testes og undersøges i en række måder. Eksperimenter undersøger arten af ​​inhibering, eksempelvis direkte binding ved NF-KB sites og virkninger på gen og protein ekspression ville være oplysende. Testning trunkerede versioner af SLPI kan også vise forøget inhiberende virkninger på NF-KB på grund af bedre cellulær optagelse og /eller DNA-binding. Til sidst af interesse, nye oplysninger tyder også en rolle for SLPI hæmme human papilloma virus (HPV) infektion og efterfølgende hoved- og halscancer udvikling [37]. Undersøgelse om effekter af SLPI behandling til HPV + cancerceller ville være af stor interesse. Resultaterne vi præsenterer her giver et udgangspunkt for sådanne fremtidige undersøgelser, som kunne størkner SLPI som et meget værdifuldt protein i diagnose, prognose og behandling af kræft i mundhulen.

massespektrometri proteomics data er deponeret til ProteomeXchange Consortium (https://proteomecentral.proteomexchange.org) via PRIDE partner repository [38] med datasættet identifier PXD000807 og DOI 10,6019 /PXD000807.

Støtte Information

Figur S1.

Coommassie farvede billeder af totalt protein belastning (A) børstet orale cellsfrom patienter; (B) afstødes cellsfrom hele salivafrom patienter; (C) Primære celler linjer, herunder RhEK keratinocytter, MSK oral leukoplakia celler og CA-9-22 mundtlige cancerceller. Disse membraner blev anvendt til Western blotting-resultater vist i figur 3 i tekst

doi:. 10,1371 /journal.pone.0095389.s001

(DOC)

tabel S1. .

Patient karakteristika

doi: 10,1371 /journal.pone.0095389.s002

(DOC)

tabel S2.

Alle proteiner identificeres og kvantificeres i proteomikanalyser. Resultater fra de to separate iTRAQ reagens-baser proteomics analyser er vist i separate regneark

doi:. 10,1371 /journal.pone.0095389.s003

(XLSX)

Tak

forfatterne er taknemmelige for center for massespektrometri ved University of Minnesota, især LeeAnn Higgins og Todd Markowski, for at få hjælp med prøveforberedelse og instrumentel analyse. Forfatterne også anerkende Minnesota Supercomputing institut for deres vedligeholdelse af software og hardware, der anvendes til analyse af data.