PLoS ONE: Kolorektal Cancer Migration og Invasion Initieret af microRNA-106a

Abstrakt

MikroRNA’er har været impliceret i reguleringen af ​​flere cellulære signalveje af kolorektal cancer (CRC) celler. Selvom ny dokumentation viser, at microRNA (MIR) -106a udtrykkes højt i primær tumor og afføringsprøver fra CRC patienter; hvorvidt MIR-106a medierer cancermetastase er ukendt. Vi viser her, at miR-106a er stærkt udtrykt i metastatiske CRC celler, og regulerer kræftcellen migration og invasion positivt

in vitro

in vivo

. Disse fænotyper ikke involverer forstyrrende indflydelse på kræft celleproliferation. MIR-106a hæmmer ekspressionen af ​​

transformerende vækstfaktor-β-receptor 2 Hotel (

TGFBR2

), hvilket fører til øget CRC celle migration og invasion. Vigtigere, er miR-106a ekspressionsniveauerne i ubearbejdet CRC’er korreleret med klinisk cancer progression. Disse observationer indikerer, at miR-106a hæmmer anti-metastatisk mål direkte og resultater i CRC celle migration og invasion

Henvisning:. Feng B, Dong TT, Wang LL, Zhou HM, Zhao HC, Dong F, et al. (2012) Kolorektal Cancer Migration og Invasion Initieret af microRNA-106a. PLoS ONE 7 (8): e43452. doi: 10,1371 /journal.pone.0043452

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA

Modtaget: April 23, 2012; Accepteret: 24 juli 2012; Udgivet: 17 august, 2012 |

Copyright: © Feng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen finansiering eller støtte til rapporten

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Metastaser fører til ca. 90% af kolorektal cancer ( CRC) relaterede dødelighed, men de underliggende mekanismer stort set uklart [1]. Metastase er en kompleks og flere processer, hvorved CRC celler invaderer omgivende væv, intravasate ind i vaskulaturen, translokere gennem den systemiske cirkulation, ekstravasatet ind i parenkym af fjerne væv (lever og lunger), etablere mikrometastaser, og danne makroskopiske sekundære tumorer [2]. I de senere år er blevet udført flere studier for at undersøge gener og deres produkter, som er involveret i metastase [3] -. [7] Salg

MikroRNA’er (miRRNs) omfatter en evolutionært-konserverede klasse af små RNA’er, der kan stilhed genekspression post-transkriptionelt gennem sekvensspecifikke vekselvirkninger med 3 ‘utranslaterede regioner (UTR’er) af sammenhørende mRNA-mål [8]. For nylig er rollen for miRNA i etablering og progression af CRC blevet klart. Større end 50% af miRNA gener er beliggende i skrøbelige kromosomale regioner, der er ændret i løbet af tumorprogression [9], og nogle miRNA er blevet identificeret som onkogener eller tumorsuppressorgener i CRC [10] – [14]. Derudover har udtryk profilering analyse viste karakteristiske miRNA signaturer, der kan forudsige de kliniske resultater af CRC [15], [16]

MIR-106a. (MiRBase: MIMAT0000103) har vist sig at være stærkt udtrykt i kræft væv og afføringsprøver af CRC patienter [16] – [18]; Den præcise rolle af MIR-106 spiller i CRCs er ukendt. Vi korreleret derfor miR-106a med CRC migration og invasion, håber, at en sådan sammenslutning kan give indsigt i de mekanismer, som CRC celler metastaserer.

Resultater

miR-106a er stærkt udtrykt i metastatisk CRC celler

Vi først bestemmes niveauerne af miR-106a udtryk i en række humane CRC celler. Efter aftale med tidligere rapporter [16] – [18], miR-106a var opreguleret i alle seks humane CRC cellelinjer i forhold til spontant udødeliggjort, normale menneskelige kolon epitelceller (NCM640, Fig 1A.). MIR-106a blev mere stærkt udtrykt i mere invasive celler i forhold til celler med mindre invasiv kapacitet (fig. 1A og B). For eksempel er niveauet af ekspression af MIR-106a var 9 gange højere i mere invasive SW480-cellelinien end den mindre invasiv HT29 cellelinie.

A, Real-time RT-PCR-analyse af MIR-106a ekspression i immortaliserede, normale humane colon-epitelceller og en række CRC-celler. U6 lille nukleare RNA blev anvendt som en intern kontrol. Et repræsentativt eksperiment er vist i tre eksemplarer, og søjlerne indikerer standardafvigelser. B, invasive evne af en række CRC-celler bestemt ved Matrigel invasion assays. Et repræsentativt eksperiment i tre eksemplarer er vist, sammen med standardfejl. C, Western blot-analyse af N-cadherin, E-cadherin, vimentin, og ZEB1 ekspression i CRC-celler. D, kvantitativ analyse med billedforstærker.

n

= 3,

barer,

± SD.

Desuden udtryk for epitelial-mesenkymale overgang (EMT) markører (E-cadherin, N- cadherin, vimentin, og ZEB1) blev bestemt ved Western blot analyse. EMT kan betragtes som en patologisk proces, der bidrager til udviklingen af ​​kræft, især da det angår invasion og metastase. Som vist i fig. 1C og D, ekspressionsniveauerne af E- og N-cadherin varierede mellem syv cellelinier. E-cadherin blev udtrykt i NCM640 og fem CRC cellelinier, men ikke SW480, og mere kraftigt udtrykt i NCM640, HT29, SW620, og LOVO. N-cadherin, vimentin og ZEB1 udtryk var lavere i de fire cellelinjer.

De to CRC cellelinjer, RKO og SW480, som har den højeste invasion potentiale, udstillet konstant lav ekspression af E-cadherin og høj ekspressionen af ​​N-cadherin, vimentin og ZEB1.

miR-106a Starter CRC Cell Migration og invasion

in vitro

Vi næste påtog

in vitro

tab af funktion analyser til at bestemme, hvilken rolle miR-106a i CRC celle migration og invasion spillet. MIR-106a blev stille i

in vitro

via antisense-oligonukleotider, derefter ekspressionsniveauerne blev bestemt ved real-time RT-PCR [19]. Vi fandt, at transfektion af MIR-106a anti-sense-oligonukleotider i SW480-celler resulterede i 7,3 gange lavere niveauer af MIR-106a-ekspression (fig. 2A). Anti-sense inhibitorer af MIR-106a førte til en 2,5-fold reduktion i migrering af SW480-celler, som bestemt ved migration assays

in vitro

, i forhold til kontrollen oligonukleotider (fig. 2B). MIR-106a inhibitorer forårsagede en 2,7-fold reduktion i den invasive evne SW480-celler målt ved invasion assays

in vitro

sammenlignet med kontrolpatienter oligonukleotider (fig. 2C). Vigtigere er det, kunne denne reduktion ikke tilskrives ødelæggelsen af ​​cellulær levedygtighed (Fig 2D, P . 0,05). Således disse observationer indikerer, at miR-106a er nødvendig for migration og invasion af disse mere metastatiske CRC celler

in vitro

, men ikke påkrævet for levedygtighed.

A, Niveauer af miR-106a udtryk i SW480 celler efter transfektion med hæmmere af miR-106a, bestemt ved real-time RT-PCR-analyse. Data blev normaliseret med U6 lille nukleare RNA. Et repræsentativt eksperiment i tre eksemplarer, sammen med standardafvigelser er vist. B, Transwell migration analyser af SW480-celler transficeret med hæmmere af miR-106a eller kontrol vektorer. Et repræsentativt eksperiment er vist i tre eksemplarer og søjlerne angiver standardafvigelser. Også vist er fase-kontrast billeder af SW480 celler migrerer gennem membraner. C, Matrigel invasion analyser af SW480-celler transficeret med oligonukleotider mod miR-106a eller kontrol oligonukleotider. Et repræsentativt eksperiment i tre eksemplarer, samt standardafvigelser er vist. Fase kontrast billeder af SW480 celler invaderet gennem membraner er også vist. D, Trypan blå eksklusion assay af SW480-celler med miRNA inhibitorer. Et repræsentativt eksperiment er vist i tre eksemplarer, sammen med standardfejl. E, Real-time RT-PCR-analyse af miR-106a udtryk i HT29-celler inficeret med miR-106a-udtrykkende eller kontrol vektorer. U6 lille nukleare RNA bruges som en intern kontrol. Et repræsentativt eksperiment er vist i tre eksemplarer, og søjlerne indikerer standardafvigelser. F, Migration potentiale NCM640 celler inficeret med miR-106a-udtrykkende eller kontrol vektorer, som bestemt af Transwell migration assays. Et repræsentativt eksperiment i tre eksemplarer, samt standardafvigelser er vist. Fasekontrast billeder af HT29-celler migreret gennem membraner er også vist. G, invasive potentiale HT29 celler efter MIR-106a transduktion eller kontrol vektor transduktion målt ved Matrigel invasion assays. Et repræsentativt eksperiment er vist i tre eksemplarer og søjlerne angiver standardafvigelser. Også vist er fase-kontrast billeder af HT29-celler invaderet gennem membraner. H, Vækstkurver for HT29-celler inficeret med MIR-106a-udtrykkende eller kontrol vektor

in vitro

. Et repræsentativt eksperiment er vist i tre eksemplarer, sammen med standardfejl.

For at bestemme, om overekspression af miR-106a eller der ikke er tildelt vandrende og invasive potentiale på ikke-metastatiske eller mindre metastatiske CRC celler, vi klonede den genomiske sekvens af det humane mIR-106a-genet i en mus stamcelle retrovirus-afledte vektor [20]. Vi derefter bruges de resulterende vektorer til at udtrykke MIR-106a i immortaliserede NCM640 og HT29-celler med mindre metastatisk potentiale. Succesfulde transduktioner af miR-106a blev konstateret af real-time RT-PCR (fig. 2E).

I begge disse to linjer, ektopisk udtryk for miR-106a forårsagede en signifikant stigning i cellulær migration og invasion ( fig. 2F og 2G). En sådan stigning kan ikke være på grund af den øgede proliferative satserne for disse celler (Fig 2H, P . 0,05 for dag 0, 2, 4 og 6). Disse observationer tyder på, at overekspression af miR-106a er tilstrækkelig til at initiere migration og invasion af CRC celler

in vitro

.

miR-106a Fremmer CRC Invasion

in vivo

Vi næste afgøres, om miR-106a eller ej induceret invasion

in vivo

. Til dette formål har vi overudtrykt MIR-106a i CRC-celler, der normalt er mindre invasiv. Først, vi implanteret HT29-celler transduceret med miR-106a eller inficeret med kontrol vektorer i nøgne mus subkutant. Recipientmus voksede bemærkelsesværdige tumorer inden for 2 uger efter injektion og blev døende i uge 8 efter injektion grundet tumor byrde, når eksperimentet blev afsluttet.

Ved uge 4 efter implantering, tumorer af MIR-106a-overudtrykkende HT29 celler og tumorer af kontrol inficerede celler var ens i størrelse, hvilket antyder, at mIR-106a havde en minimal effekt på den primære tumorvækst (fig. 3A). Som forventet, tumorer i kontrol- celler non-invasiv, vist som tumormasser begrænset inden fibrøse kapsler (fig. 3B, venstre panel). I modsætning hertil tumorer af MIR-106a-overudtrykkende celler havde øer af epitelcancerceller invaderer ind i tilstødende stromale væv (fig. 3B, venstre panel). Således ektopisk udtryk for miR-106a tillagt invasive kapacitet på kræftceller, som ellers ikke-invasiv.

A, Vækst kurver af tumorer dannet af HT29-celler inficeret med miR-106a-udtrykkende eller kontrol vektorer. Hver data prik repræsenterer middelværdien ± standardfejl på 3-4 mus. B, Hæmatoxylin og eosin-farvede sektioner af CRC’er dannet af HT29-celler inficeret med miR-106a-udtrykkende eller kontrol vektorer 8 uger efter implantation.

TGFBR2

er et direkte mål for miR-106a

for at forstå den mekanisme, hvormed miR-106a fremkalde kræft celle migration og invasion, vi brugte to algoritmer (PicTar og Targetscan) at identificere mål for menneskelig miR-106a [21], [22]. Blandt 990 mål forudsagt af Targetscan,

LAMA3

(Gene ID: 3909) og

TGFBR2

gener (Gene ID: 7048) er tidligere blevet impliceret i reguleringen af ​​cellulære migration og /eller invasion [23] – [27].

TGFBR2

er særlig interessant, fordi ekspressionen af ​​

TGFBR2

har vist sig at være tabt gradvis under malign progression af forskellige typer af cancer [23], [25], [27], [28 ]. Desuden TGFBR2-kodende mRNA har en 3’UTR element, som er komplementær til MIR-106a (fig. 4A).

A, den beregnede dannelse af dupleks mellem human

TGFBR2

3’UTR og miR-106a. B, Real-time RT-PCR-analyser af

TGFBR2

i HT29-celler inficeret med miR-106a-udtrykkende eller kontrol vektor.

GAPDH

mRNA bruges som en intern kontrol. Et repræsentativt eksperiment er vist i tre eksemplarer, sammen med standardfejl. C, Luciferaseaktivitet af vildtype

TGFBR2

3’UTR reportergenet i HT29-celler inficeret med MIR-106a-udtrykkende eller kontrol vektorer. Et repræsentativt eksperiment er vist i tre eksemplarer, sammen med standardfejl. D, Luciferaseaktivitet af mutant-typen

TGFBR2

3’UTR reporter gen i HT29-celler inficeret med miR-106a-udtrykkende eller kontrol vektorer. Et repræsentativt eksperiment er vist i tre eksemplarer. Bars betegner standardafvigelser.

Faktisk overekspression af MIR-106a førte til nedbrydning af

TGFBR2

mRNA, som målt ved real-time RT-PCR (fig. 4B). Derefter bestemte vi, om

TGFBR2

er et direkte mål for MIR-106a-medieret inhibering ved at analysere aktiviteten af ​​et luciferase reportergen fusioneret i 3’UTR af vildtype

TGFBR2

gen. MIR-106a reducerede aktiviteten af ​​luciferase reporter signifikant (P 0,05, figur 4C.). Hæmning af

TGFBR2

medieret af miR-106a afhænger af tilstedeværelsen af ​​miR-106a homologe bindingssteder i 3’UTR af

TGFBR2

gen. Fordi luciferase reporter bærer en mutant

TGFBR2

3’UTR, substitution af 4 nukleotider inden for MIR-106a bindingssteder blev ikke inhiberet af MIR-106a ektopisk ekspression (Fig 4D, P . 0,05). Kollektivt, disse observationer viser, at

TGFBR2

kan fungere som et direkte mål for miR-106a-medieret lyddæmpning.

TGFBR2

er en funktionel Target af miR-106a

Vi næste afgøres, om reduceret ekspression af

TGFBR2

gen er nødvendig for induktion af cellulære migration og invasion observeret efter miR-106a overekspression. Vi overudtrykt miR-106a og en konstruktion, der udtrykker

TGFBR2

konstitutivt. Denne konstruktion koder hele kodende sekvens af

TGFBR2,

mens mangler 3’UTR element, hvilket således giver en type af mRNA resistent over for MIR-106a medieret hæmning. Bemærkelsesværdigt, det resulterende konstitutivt udtrykte

TGFBR2

ophævet den tidligere forhøjede migration og invasion initieret af MIR-106a (Fig 5A.), Men havde ingen virkning på cellelevedygtighed (figur 5B, P . 0,05), hvilket tyder at

TGFBR2

er faktisk en funktionel mål for miR-106a.

a, Matrigel invasion analyser af miR-106a-transducerede eller kontrol-inficerede HT29-celler forbigående transficeret med

TGFBR2

. Et repræsentativt eksperiment er vist i tre eksemplarer sammen med standardfejl. B, Trypan blå eksklusion assay af MIR-106a-udtrykkende HT29-celler transduceret

TGFBR2

eller kontrol vektor. Vist er et repræsentativt eksperiment i tre eksemplarer, sammen med standardfejl. C, Immunoblotting for

TGFBR2

i HT29-celler forbigående transficeret med

TGFBR2

siRNA. Et repræsentativt eksperiment er vist i tre eksemplarer, sammen med standardfejl. D, Sammenligning af den øgede migration og invasion potentiale mellem HT29-celler transduceret med miR-106a og HT29-celler forbigående transficeret med

β

siRNA. Et repræsentativt eksperiment er vist i tre eksemplarer. Barer betegne standardafvigelser.

Vi ønskede også at afklare, om nedbrydning af

TGFBR2

er tilstrækkelig til miR-106a-medieret øget migration og invasion. Transfektion af

TGFBR2

lille interfererende RNA (siRNA), hvilket resulterede i en reduktion i niveauet af

TGFBR2

protein (. Figur 5C), førte til en bemærkelsesværdig 90%, men ikke fuldstændig induktion af cellemigration og invasion sammenlignet med induktionen forårsaget af mIR-106a overekspression (fig. 5D). Kollektivt,

TGFBR2

synes at være en nødvendig, men ikke tilstrækkelig mål for miR-106a.

miR-106a Expression øges i metastatisk Primary CRC

Det er vigtigt, en nylig microarray analyse viste, at mIR-106a er blandt de miRNA som er højt udtrykt i primær CRC sammenlignet med normal colorektal epitel væv [16], [18]. Vi afgøres, om miR-106a udtryk i metastase-positive tumorer er højere end metastase-fri tumorer, og om miR-1061 udtryk er forbundet med kliniske resultater i CRC patienter. Vi rekrutterede 28 CRC patienter, der var langsigtede metastase-fri overlevende efter komplet kirurgisk resektion af den primære tumor, og sammenlignede patienter til en kontrol kohorte af patienter med metastaser på diagnosetidspunktet eller metastaser i opfølgning ( 60 måneder ) (tabel S1). Desuden blev metastase-fri overlevelse for patienter uden metastaser ved diagnose stratificeret baseret på miR-106a udtryk status. Faktisk metastase-positive patienter havde signifikant højere niveauer af MIR-106a i deres primære tumorer i forhold til de patienter uden metastaser (fig 6A, P. 0,05). Især blandt alle disse patienter, dem, der havde lavere niveauer af miR-106a havde bedre kliniske resultater (figur 6B,

s

. 0,05). Tilsammen indikerer disse resultater, at MIR-106a har en vigtig rolle i CRC metastase.

A, Niveauer af MIR-106a-ekspression i primære CRCs med eller uden metastaser. Der var en signifikant forskel i MIR-106a-ekspression i disse to grupper. B, Kaplan-Meier metastase overlevelse i 28 CRC patienter uden metastaser ved diagnose, stratificeret baseret på de niveauer af miR-106a udtryk i deres primære tumorer. Aχ

2 test blev anvendt til statistisk analyse og en P. 0,05 blev betragtet som signifikant

Diskussion

Den nuværende arbejde identificerede miR-106a som en pro-metastase miRNA førende til fremme af migration og invasion af CRC celler. Reduktion af denne miRNA i CRC celler, som ellers er metastatisk faldt vandrende og invasive potentiale CRC celler. I modsætning hertil opregulering af miR-106a i CRC celler med mindre migration og invasion potentiel øget cellulær migration og invasion. Vi viste, at miR-106a ikke signifikant indflydelse på proliferative satser CRC celler

in vitro

in vivo

. Sådan dokumentation antyder, at MIR-106a kun kan spille en rolle i CRC celleinvasion.

Interessant, men fra den samme patient, SW480 og SW620 celler havde forskellige invasion potentiale og MIR-106a-ekspression (fig. 1A og B ). Det er muligt, at dette fund var fordi SW480 celler er fra en primær cancer undergår EMT og SW620 celler er fra en sekundær cancer. Faldet i ekspression af ZEB1 i SW620-celler sammenlignet med SW480 celler kan resultere i genoprettelse af E-cadherin-niveauer og inducerer en omvendt proces med EMT eller mesenchymal-epithelial overgang (MET) [29], hvori MIR-106a kan spille en rolle som en opstrøms eller nedstrøms faktor ZEB1.

Vores resultater rapport første gang, at som et mål gen af ​​miR-106a,

TGFBR2

kan blive negativt reguleret af miR-106a på transkriptionel niveau via binding af 3’UTR af

TGFBR2

mRNA i CRC.

TGFBR2

er en stor TGF-β signalmolekyle ofte vist sig at være et af generne ændres i cancer. TGF-β-signalvejen spiller en kompleks rolle, som forbliver kontroversielt, i ondartet udvikling af tumorer. Det er blevet vist, at TGF-β kan inducere EMT og fremme tumorcelleinvasion [30], medens en anden undersøgelse har vist, at reduceret

TGFBR2

ekspression er forbundet med aggressive træk ved hepatocellulært carcinom [25]. I CRC, kan TGF-β inducerer vækstinhibering af cancerceller, og

TGFBR2

var en tumor-suppressor protein, der er nødvendig for TGF-β signalering [31]. Den foreliggende undersøgelse viste, at nedregulering af

TGFBR2

stiger cellulære migration og invasion af HT29 (Fig. 2G og 5D). Derfor kan TGF-β-signalering være en vigtig fremgangsmåde, hvor miRNA regulere udviklingen af ​​tumorer. En nylig undersøgelse rapporterede, at MIR-17~92, aktiveret af c-Myc, dæmper TGFp-signalvejen, hvilket vil stimulere angiogenese og tumorcellevækst [32]. Selvom

TGFBR2

synes at være en nødvendig, men ikke tilstrækkelig mål for miR-106a i den aktuelle undersøgelse, forholdet mellem miR-106a og TGF-β-signalering fortjener yderligere undersøgelse.

Clinicopathologic analyse yderligere demonstreret forbindelsen mellem mIR-106a og metastase. Langsigtede overlevende uden metastaser havde signifikant lavere niveauer af miR-106a i deres primære tumorer i forhold til patienter med recidiv, og lavere niveauer af miR-106a foreslår en højere metastase overlevelse sats (fig. 6). Dette fund støtter kraftigt den opfattelse, at overekspression af miR-106a er tæt involveret i metastase af CRC.

Som konklusion, vi viste, at ekspressionen af ​​miR-106a var positivt korreleret med migration og invasion potentiale CRC celler, og nedregulering af

TGFBR2

, som en af ​​target gener for miR-106a, kunne øge celle migration og invasion.

Endnu vigtigere er, niveauerne af miR-106a udtryk i primære CRC’er er korreleret med klinisk cancer progression, hvilket antyder, at miR-106a kan repræsentere en ny mål for terapeutisk intervention for at forhindre CRC metastaser.

Materialer og metoder

cellelinier

Den udødeliggjort menneskelige kolon epitelial cellelinje, NCM640, var en gave fra JQ Zhang og dyrket i DMEM suppleret med 10% FBS HT29, SW480, LOVO, SW1116, og SW480 cellelinier blev indkøbt fra ATCC (Manassas, VA, USA) og dyrket under betingelser i overensstemmelse med producentens anvisninger.

RNA Isolation og miRNA Analyser

Totalt RNA af dyrkede celler blev ekstraheret med Mirvana Isolation Kit (AM1560, Ambion, Austin, TX, USA). miRNA analyser blev udført med Mirvana QRT-PCR miRNA Detection Kit (AM1558, Ambion) sammen med QRT-PCT Primer sæt (4.395.280, Ambion) i overensstemmelse med vejledninger for fremstiller. U6 lille nukleare RNA blev anvendt som intern kontrol.

Oligonucleotid transfektion

miRIDIAN microRNA-hæmmer, miRIDIAN Mimic HSA-miR-106a og siRNA af

TGFBR2

blev købt fra Dharmacon (IH-300.526-08, C-300.526 til 07, og D-003.930, Dharmacon, Lafayette, CO, USA). Celler blev transficeret med 200 nM af de angivne oligonukleotider under anvendelse af Oligofectamine Reagent (12.252.011, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Celler blev anvendt til efterfølgende eksperimenter 48 timer efter transfektion.

Gene Kloning og ektopisk ekspression

Det humane miRNA-genet blev PCR-amplificeret fra normal genomisk DNA og klonet ind i MDH1-PGK-GFP 2.0 retrovirus-afledte vektor.

TGFBR2

cDNA’er mangler 3’UTR blev PCR-amplificeret fra normal genomisk DNA og udtrykt fra pWZL-blasticidin vektor. Virusgenerering og infektion af målceller har tidligere [33] blevet beskrevet. Inficerede celler blev selekteret med 2 ug /ml puromycin (P9620, Sigma, St. Louis, MO, USA), 200 ug /ml hygromycin (H9773, Sigma), og 10 ug /ml blasticidin (sc-205.604, Santa Cruz, Santa Cruz, Californien, USA).

In vitro migration og invasion Analyser

migration og invasion potentiale CRC celler blev evalueret, som tidligere beskrevet med mindre ændringer [34].

CRC-celler (2,5 x 10

5) blev udpladet på ikke-coatede øvre kamre (24 brønde indsætter; porestørrelse, 8 um, BD Bioscience, Bedford, MA, USA) for Transwell migration assays. CRC-celler (2,5 x 10

5) blev anbragt på Matrigelcoatede øvre kamre (24 brønde indsætter; porestørrelse, 8 um; BD Bioscience). For invasion assays

Mediet i øverste komponent var aspireret og erstattet med serumfrit medium 2 timer efter podning og medium indeholdende 20% serum blev anvendt som en chemotractant i de nedre kamre. Cellerne fik lov til at migrere i 24 timer, og derefter blev cellerne på begge sider af kammeret blev fikseret 50. /50% acetone /methanol. Celler i bunden af ​​kammeret blev farvet med krystalviolet (C3886, Sigma). Derefter blev billede af hver brønd taget til billedet kernerne i cellerne med × 10 objektiv, og cellekernerne i hvert område blev talt under anvendelse af Image-J software (NIH; https://rsb.info.nih.gov /ij /).

Dyreforsøgstilsynet

Six-til-otte uger gamle nøgne mus blev anvendt til undersøgelsen, og alle de eksperimentelle procedurer blev godkendt af Animal Care udvalg Shanghai Jiaotong Universitet . 10

6 HT29-celler i 200 pi DMEM blev injiceret i flankerne af mus subkutant. Diametrene af tumorer blev målt to gange om ugen med Præcisionsskydelærer. Tre til fire mus per gruppe blev aflivet på hver af de 4 tidspunkter (uge 2, 4, 6 og 8 efter transplantationen). Tumorerne blev fjernet og vejet. Vævsprøver blev fikseret i 10% pufret formalin i 12 timer, derefter vasket med PBS og indgivet til 70% ethanol, efterfulgt af at blive indlejret i paraffin, snittet og farvet med hæmatoxylin og eosin (H9627 og E4009, Sigma).

SYBR Green Real-time RT-PCR

Den samlede RNA fra celler blev ekstraheret og revers-transkriberet som tidligere beskrevet [35]. De forudgående og efterfølgende primere til

TGFBR2

gen blev opnået fra Primerbank (https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/): 5′-GTAGCTCTGATGAGTGCAATGAC-3 ‘og 5’-CAGATATGGCAACTCCCAGTG-3 ‘. SYBR grøn real-time RT-PCR, og den tilsvarende dataanalyse har tidligere [35] blevet beskrevet. β-actin mRNA blev anvendt som en intern kontrol (primere: 5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3 ‘og 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’).

Immunoblotting

Celler blev høstet i RIPA-lysepuffer . Proteiner fra cellulære lysater blev løst med PAGE-gel, overført til PVDF-membraner (Millipore Corp., Billerica, MA, USA) og derefter blokeret i 5% fedtfri mælk i PBS /Tween-20 efterfulgt af inkubering med antistof againstN-cadherin (sc-271.386, Santa Cruz), E-cadherin (sc-21791, Santa Cruz), vimentin (sc-373.717, Santa Cruz), ZEB1 (sc-25.388, Santa Cruz) eller TGFBR2 (sc-17799, Santa Cruz) . Mængden af ​​målprotein blev kalibreret ved hjælp af β-actin (SC-130.656, Santa Cruz), og relative intensiteter blev opnået.

Construct

TGFBR2

3’UTR sekvenser blev klonet ind i en pMIR-RAPPORT luciferase-konstruktion (AM5795, Ambion) [36]. Mutant

TGFBR2

3’UTR blev genereret med en QuickChange mutagenese Kit (200.519, Stratagene, Palo Alto, CA, USA).

Luciferase Reporter Assay

Celler ved 50% konfluens i plader med 24 brønde blev transficeret med Fugene6 (E2691, Promega, Madison, WI, USA). Luciferasereportergenet konstrukt (200 ng) og pRL-SV40 Renilla luciferase-konstruktion (1 ng [anvendes til normalisering]) blev co-transficeret i hver brønd. Celleekstrakter blev forberedt 24-48 timer efter transfektion og målt med en Dual-Luciferase Reporter Assay System (E1910, Promega).

Klinisk Kolorektal tumorer

Primære kolorektale tumorer og tilsvarende normale kolorektal væv var indsamlet mellem 2004 og 2006, og behandles i overensstemmelse med en protokol godkendt af Etisk Komité Ruijin Hospital i Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Det TNM fase af tumor blev bestemt i overensstemmelse med klassificeringen foreslået af AJCC Cancer Staging Manual [37]. Opfølgende data blev sammenfattet i slutningen af ​​2011 med en median opfølgning på 60 måneder. Frisk væv blev høstet fra patienter, lynfrosset og opbevaret ved -80 ° C. Delstrækninger fra de samme væv blev derefter farvet med hæmatoxylin-eiosin at validere tilstedeværelsen af ​​tumor og væv indeholdende 90% tumorceller blev anvendt til QRT-PCR som tumorer. Totalt RNA blev isoleret fra frosset væv under anvendelse af TRIzol ekstraktion (15596, Ambion) og en Mirvana miRNA Isolation Kit (AM1560, Ambion). miRNA analyser blev udført med en Mirvana QRT-PCR miRNA Detection Kit (AM1558, Ambion) sammen med QRT-PCT Primer sæt (4.395.280, Ambion) i overensstemmelse med producentens vejledninger. U6 lille nukleare RNA blev anvendt som en intern kontrol. Primære tumorer blev stratificeret som miR-106a lavere eller højere for at skelne, hvorvidt miR-106a niveauer korreleret med metastaser. Tumorer blev anset miR-106a lavere eller højere, hvis den normaliserede udtryk for miR-106a boet i bunden eller toppen 50% af tumorerne i gruppen, henholdsvis.

cellevækst og levedygtighed Assay

for at bestemme vækstrater, 2,5 x 10

4 celler blev udpladet i hver brønd i en plade med 12 brønde. Fireogtyve timer senere blev cellerne høstet og talt på et hæmocytometer hver 2. dag indtil dag 6. For at bestemme cellelevedygtighed blev celler trypsiniseret og fortyndet med 0,4% trypanblåt (302.643, Sigma) farvning opløsning og talt på en hematocytometer.

Statistisk Analyse

data er udtrykt som gennemsnit ± standardfejl. En Student t-test (to-halet) blev anvendt til at sammenligne to grupper (en P 0,05 blev betragtet som signifikant), medmindre andet er angivet (χ

2 test)

Støtte oplysninger

tabel S1. .

Korrelation af miR-106a udtryk med metastaser i patienter med tarmkræft.

doi: 10,1371 /journal.pone.0043452.s001

(DOC)