PLoS ONE: LINE-1 hypometylering i Cancer varierer meget og omvendt korreleret med mikrosatelitter Instability

Abstrakt

Baggrund

Ændringer i DNA methylering i kræft omfatte globale hypometylering og gen-specifikke hypermethylering. Det er ikke klart, om disse to epigenetiske fejl mekanisk forbundne eller forekommer uafhængigt af hinanden. Denne undersøgelse blev udført for at bestemme forholdet mellem DNA hypometylering, hypermethylering og mikrosatellit ustabilitet i kræft.

Metode /vigtigste resultater

Vi undersøgte 61 kræft cellelinjer og 60 kolorektal carcinomer og deres tilstødende væv ved hjælp af LINE-1 bisulfit-PCR som et surrogat for global demethylering. Colorektale carcinomer med sporadisk mikrosatellit instabilitet (MSI), hvoraf de fleste er på grund af en CpG ø metylering fænotype (CIMP) og tilhørende MLH1 promoter methylering, viste i gennemsnit ingen forskel i LINE-1 methylering mellem normale hosliggende og cancervæv. Interessant, nogle tumor prøver i denne gruppe viste stigning i LINE-1 methylering. I modsætning hertil MSI-viste et signifikant fald i LINE-1 methylering mellem normale hosliggende og cancer væv (P 0,001). Microarray analyse af gentagne element methylering bekræftet denne iagttagelse og viste en høj grad af variabilitet i hypometylering mellem prøver. Derudover opsyn hierarkisk klyngedannelse identificeret en gruppe af højt hypomethylated tumorer, der består for det meste af tumorer uden mikrosatellit ustabilitet. Vi udvidede LINE-1 analyse til kræft cellelinjer fra forskellige væv og fandt, at 50/61 blev hypomethylated forhold til perifert blod lymfocytter og normal colon mucosa. Interessant, disse kræft cellelinjer udviste også en stor variation i demethylering, som var vævsspecifik og dermed næppe resulterende fra en stokastisk proces.

Konklusion /Betydning

Global hypometylering delvis vendes i kræft med mikrosatellit ustabilitet og også viser høj variabilitet i kræft, hvilket kan afspejle alternative progression veje i kræft

Henvisning:. Estécio MR, Gharibyan V, Shen L, Ibrahim AE, Doshi K, han R, et al . (2007) LINE-1 hypometylering i Cancer varierer meget og omvendt korreleret med mikrosatelitter ustabilitet. PLoS ONE 2 (5): e399. doi: 10,1371 /journal.pone.0000399

Academic Redaktør: M. Cristina Cardoso, Max Delbrueck Center for Molekylær Medicin, Tyskland

Modtaget: 10. januar, 2007; Accepteret: April 4, 2007; Udgivet: Maj 2, 2007

Copyright: © 2007 Estecio et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (USA) giver CA098006, CA100632 og CA105346 (JP.JI) og fra FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, Brasilien) giver 99 /09.368-1 (MRHE) og 00 /12.361-8 (EHT)

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft er en kompleks sygdom, der skyldes både genetiske og epigenetiske fejl. Betydningen af ​​genetiske ændringer i kræft, herunder kromosomfejl og genetiske mutationer samt dens tilgrundliggende faktorer (for eksempel ioniserende stråling og kemiske carcinogener) er nu kendt. Den epigenetiske bestanddel af cellulær transformation, var imidlertid indtil for nylig dårligt forstået. Det har været kendt i årtier, at hele genomet hypometylering sker i tumorer sammenlignet med normale celler [1] – [4] og overekspression af onkogener blev postuleret at være et resultat af denne hypometylering. DNA hypermethylering i kræft fik opmærksomhed et par år senere med undersøgelser fra Baylin et al. [5], [6] og Jones et al. [7]. Sidstnævnte ændring sker i CpG ø initiativtagere til single-kopi-gener og svækker gentranskription, hvilket resulterer i nedregulering af tumor supressor gener. Flere undersøgelser beskrev en vævsspecifik mønster af methylering i cancer og hundrede af mål gener er kendte, herunder tumorsuppressorgener og gener involveret i invasion, angiogenese og apoptose [8], [9]. Den aldersrelaterede karakter af promotor hypermethylering i normale væv [10] er blevet foreslået som en prædisposition faktor i kræft.

En vigtig og uløste spørgsmål er, om genom-dækkende hypometylering og enkelt kopi CpG ø promotor hypermethylering er to uafhængige ændringer, eller hvis de er mekanistisk forbundet. Unbiased studier af DNA-methylering ændringer har identificeret både hyppig hypermethylering og hypometylering i flere typer af neoplasier [11] – [14]. Forsøg på at besvare dette spørgsmål resulterede i modstridende resultater, med nogle grupper støtter [15], [16] og andre gendrive [17], [18] en sammenhæng mellem de to ændringer.

Her har vi gennemført en genom- bred methylering studie i kræft cellelinjer og primære tumorer til at bestemme forholdet mellem DNA hypometylering, hypermethylering og mikrosatellit ustabilitet i kræft. Den retrotransposable element LINE-1 blev anvendt som et surrogat for genom-dækkende hypometylering, og methylering mikroarrays udvidet vores analyse til andre klasser af repetitive elementer. Genom-dækkende methylering afveg i kolorektale karcinomer tilhører særskilte CpG ø methylering fænotype (CIMP) grupper, især i dem med tilhørende mikrosatellit instabilitet (MSI), hvor hypometylering var sjælden sammenlignet med både CIMP + /MSI-og CIMP- /MSI- grupper. Kræft cellelinjer udviste en stor variation i genom-dækkende demethylering, som var vævsspecifik og dermed næppe være en stokastisk proces. Sammenfattende vores resultater viser, at genom-dækkende hypometylering i cancer varierer meget, hvis årsager er ukendte, og eksistensen af ​​en stærk omvendt sammenhæng mellem global hypometylering og mikrosatellit ustabilitet i kræft.

Materialer og metoder

Vævsprøver og cellelinier

Sixty matchede par af tumor og tilsyneladende normale tilstødende colon prøver blev opnået fra patienter, der behandles på Johns Hopkins University (Baltimore, MA). CpG ø metylering fænotype (CIMP) og mikrosatellit-analyse blev bestemt tidligere for disse prøver [19]. Perifere blodlymfocytter blev opnået fra fem raske donorer, og normal colon mucosa væv blev ressected fra fem individer indgivet til kirurgi for gun shot sår eller ikke-maligne læsioner. Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité af Johns Hopkins University (Baltimore, MA), og informeret samtykke blev opnået fra alle deltagere.

Sixty-én cancer cellelinjer fra otte forskellige væv (bryst, centralnervesystemet, colon, leukæmi, lever, lunge, ovarie og prostata) blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og dyrket under anvendelse af standardmetoder. DNA fra patienter og cellelinier blev ekstraheret ved anvendelse af standard phenol-chloroform ekstraktionsmetoder.

bisulfit pyrosekventering LINE-1 analyse

bisulfitbehandling blev udført som beskrevet [20]. Metyleringsanalyse af LINE-1 promotoren (Genbank X58075) blev undersøgt under anvendelse af en pyrosekventering-baserede methyleringsanalyse. Vi udførte 50 pi PCR i 60 mM Tris-HCI pH 8,5, 15 mM ammoniumsulfat, 2 mM MgCl2, 10% DMSO, 1 mM dNTP-blanding, 1 enhed Taq polymerase, 5 pmol den fremadrettede primer (5′-TTTTTTGAGTTAGGTGTGGG 3 ‘), 5 pmol revers-biotinylerede primer (5′-BIO-TCTCACTAAAAAATACCAAACAA-3′) og 50 ng af bisulfit-behandlet genomiske DNA. PCR cyklusbetingelser var 95 ° C i 30 s, 50 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 sek i 50 cyklusser. Det biotinylerede PCR-produktet blev oprenset og gjort enkeltstrengede at fungere som en template i en pyrosekventering reaktion som anbefalet af producenten ved anvendelse af Pyrosequencing Vacuum Prep Tool (Pyrosequencing, Inc., Westborough, MA). Kort fortalt blev PCR-produktet bundet til streptavidin Sepharose HP (Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige) og sepharose-perlerne indeholdende det immobiliserede PCR-produkt blev oprenset, vasket, denatureret under anvendelse af en 0,2 M NaOH-opløsning og vaskes igen. Derefter, 0,3 uM pyrosekventering primer (5’-GGGTGGGAGTGAT-3 ‘) blev annealet til det oprensede enkeltstrenget PCR-produkt og pyrosekventering blev udført under anvendelse af PSQ HS 96 Pyrosequencing System (Pyrosequencing, Inc.).

Methylated CpG island amplifikation (MCA) /CpG island microarray

Seksten colorektale tumorer blev sammenlignet med deres normalt udseende tilstødende væv under anvendelse af en CpG ø microarray protokol udviklet i vores laboratorium. For hver prøve blev MCA amplikoner fremstillet efter Toyota et al. [20] ved hjælp RXMA PCR-adaptere. For at minimere forstærkning skævhed skyldes differentiel inkorporering af fluorescerende farvestoffer, vi har valgt en protokol indirekte-mærkning. Til dette blev inkorporeringen af ​​amino-allyl dUTP (aa-dUTP, Sigma) i 600 ng af hver af tumor-DNA og normalt DNA udført ved anvendelse af Bioprime systemet DNA-mærkning protokol (Life Technologies). Cy5 og Cy3 fluorescerende farvestoffer blev koblet til aa-dUTP-mærkede tumor og normale tilgrænsende amplikoner henholdsvis og cohybridized til HCGI12K-Human CpG 12K Array (Microarray Centre, University Health Network, Toronto, Canada). Hybridisering og post-hybridisering vask procedurer i henhold til DeRisi og kolleger, og kan findes på https://www.microarrays.org. Hybridiserede objektglas blev scannet med GenePix 4000A scanner (Axon Instruments, Foster City, CA) og de erhvervede billeder blev analyseret med softwaren GenePix Pro 6.0. Kun pletter med kommenteret DNA-sekvens med 90% eller mere af deres længde overlappende en repetitiv element blev anvendt til analyse. I alt 770 pladser, der repræsenterer repetitive DNA af forskellige klasser blev evalueret ved hjælp af denne metode, og methylering data for hver plet var repræsenteret som loggen

2ratio af tumor (Cy5, rød) /normal (Cy3 normale) intensiteter. Values≥1.0 (2-fold ændring) var tegn på øget methylering (hypermethylering) og values≤-1.0 var tegn på nedsat methylering (hypometylering) i tumor. Unsupervised hierarkisk klyngedannelse blev udført ved hjælp af programmet CIMminer (https://discover.nci.nih.gov/cimminer/) med beregningen for distance ved hjælp absolut korrelation og komplet kobling klyngedannelse.

Statistisk analyse

betydningen af ​​de observerede mellem midler forskelle blev anslået ved hjælp af tosidet t-test. P-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. En-vejs ANOVA blev anvendt ved sammenligning lighed for tre eller flere grupper. Statistiske analyser blev udført med Statistica softwarepakke (StatSoft, Tulsa, OK).

Resultater

LINE-1 methylering i kolorektale karcinomer korrelerer med MSI-status

Vi anvendte pyrosekventering metode til bestemmelse af methylering tæthed i LINE-1 promotor. I tidligere undersøgelser, vi valideret anvendelsen af ​​denne metode til at evaluere genom-dækkende indhold methylering [21], [22] og viste en stærk positiv korrelation mellem LINE-1 methylering og LC-MS (væskekromatografi /massespektrometri) data. Således kan LINE-1 methylering niveauer anvendes som et surrogat for hele genomet demethylering. Kortet over LINE-1 promotor med primere og probe positioner er vist i figur 1A. Denne metode bygger på bisulfit behandling af DNA, som ændrer umethylerede cytosiner til tymidines mens methylerede cytosiner er ikke-reaktive. PCR af bisulfit-behandlet DNA resulterer i puljer af produkter, der indeholder både methyleret og umethyleret DNA, som kan skelnes og kvantificeret under anvendelse af pyrosekventering metode. Repræsentative LINE-1 pyrograms er præsenteret i figur 1B. Vi undersøgte fem normal colon mucosa og fem perifere blod lymfocytter (PBL) DNA-prøver fra raske donorer til at bestemme de normale niveauer af LINE-1 methylering. LINE-1 methylering var ens i disse to forskellige væv, med et gennemsnit på 71,9% i PBL og 70,8% i normal colon mucosa.

Kvantificering af DNA-methylering ved anvendelse af bisulfit LINE-1 PCR og pyrosekventering. A) Diagram over CpG øen promotoren (GenBank accession nr. X58075, nukleotidposition 108-520 bp) associeret med fuld længde LINE-1 den. Hver lodret linje repræsenterer en enkelt CpG site. Den 3’UTR, 5’UTR og to ORF’er af LINE-1 er vist øverst. Pile angiver placeringen af ​​primere anvendt til bisulfit PCR (R-biot og F) og pyrosekventering (S). B) Repræsentative LINE-1 pyrograms for normale perifere blodlymfocytter (PBL) og brystkræft cellelinier (MB-468 og SKBR3). Den pyrogram kvantificerer C i methyleret og T for umethyleret DNA. Det skraverede område repræsenterer CpG stedet kvantificeres i LINE-1 elementer, og procent methylering vises over toppen.

Vi næste evalueret LINE-1 methylering i tres primære colorektale carcinomer og deres normale matchende slimhinde og korreleret dette med demografiske, clinopathologic og molekylære variabler (tabel 1). Kolorektale tumorer i gennemsnit 54,9% methylering (SEM = 1,1%) versus 64,3% (SEM = 0,5%) methylering i det tilstødende normale væv, hvilket svarer til en gennemsnitlig relativ demethylering på 14,6% (P 0,001). Sammenlignet med LINE-1-methylering i normal colon, som i gennemsnit 70,8% (SEM = 1,3%), både tumor og støder op til tumor colon mucosa blev demethyleres, med en respektiv gennemsnit på 22,5% og 9,2% relativ demethylering (P = 0,001). Ingen forskelle i LINE-1 methylering blev fundet af alder eller køn, men en signifikant forskel blev fundet for side, med lavere niveauer af methylering i normal tilstødende højre colon (63,0%) sammenlignet med venstre kolon (65,5%, P = 0,016) og scenen, med lavere niveauer af methylering for tumorer i trin 3 og 4 (51,9%) sammenlignet med trin fra 0 til 2 (57,1%, P = 0,028).

De primære kolorektale tumorer præsenteret en høj variation i LINE-1 methylering blandt forskellige prøver (figur 2A), og lagdeling af disse kolorektale tumorer og deres normale tilstødende væv afslører en uensartet variation i LINE-1 methylering. CRC med sporadisk mikrosatellit instabilitet (MSI), hvoraf de fleste skyldes MLH1 promotor methylering, viste ingen forskel i LINE-1 methylering mellem normale tilstødende og kræft væv (62,6% ± 1,1% mod 60,6% ± 1,7%, P = 0,33) , med et gennemsnitligt fald i methylering af kun 3,12% ± 2,3%. Derimod havde MSI-sager et signifikant fald i LINE-1 hypometylering mellem normale hosliggende og cancervæv (64,6% ± 0,5% versus 53,8% ± 1,2%, P 0,0001). Tilsyneladende LINE-1 hypometylering var uafhængig af CIMP status, da CIMP + /MSI-sager og CIMP-sager lige blev hypomethylated (15,4% ± 2,7% mod 17,7% ± 2,7%, P = 0,56). Denne ulige fordeling af relativ demethylering ved tilstedeværelsen af ​​mikrosatellit ustabilitet er repræsenteret i figur 2B, der illustrerer vedligeholdelsen af ​​LINE-1-methylering i CIMP + /MSI + tumorer sammenlignet med normalt udseende slimhinde, mens CIMP + /MSI-og CIMP- /MSI- gennemgå alvorlig hypometylering, med et tilfælde præsentere en ekstrem relativ demethylering (61,3%).

Differential LINE-1 methylering blandt CIMP /MSI grupper i den primære kolorektale carcinoma prøver (CRC’er). A) Colorectal tumor DNA og deres normale optræder tilstødende slimhinde fra tres patienter blev evalueret for LINE-1 methylering. Disse tumorer blev tidligere evalueret for CpG island methylator fænotype (CIMP), anvendelse af et panel af enkelt-kopi-gener methyleringsanalyse, og mikrosatellit instabilitet (MSI) status, hvilket resulterer i identifikationen af ​​tre CIMP /MSI-grupper. I normal observeres mellem prøver og CIMP /MSI grupper (gennemsnitligt methylering = 64,3%), mens der i tumor (nederst) flere prøver undergå høj LINE-1 demethylering vises slimhinder (øverst) lidt variation i LINE-1 methylering (25/60 tumor prøver har methylering tæthed Bellow 55%), mest bemærkelsesværdige i CIMP + /MSI-og CIMP- /MSI-grupper. B) Relativ LINE-1 demethylering i CRCs. Relativ demethylering blev beregnet som den procentvise ændring af LINE-1 methylering i tumor i forhold til sine normale vises slimhinde. Både CIMP + /MSI-og CIMP- /MSI-prøver præsenteret i gennemsnit 16% demethylering til LINE-1, mens der sås ingen signifikante ændringer for CIMP + /MSI + prøver. For CIMP + gruppen, 4-9% stigning af methylering tætheden for LINE-1 blev observeret for en lille brøkdel af prøver, de fleste af dem er identificeret som CIMP + /MSI + prøver.

Methylering analyse af repetitive elementer ved hjælp af MCA /CPG ø microarrays

Udover LINE-1 methylering analyse af bisulfit PCR og pyrosekventering, vi også evalueret status methylering af repetitive elementer, herunder LINE (lang afbrudt nukleare elementer), SINE (kort afbrudt nukleare elementer), LTR (lange terminale gentagelser), DNA og satellit-gentagelser, ved kobling MCA (methyleret CpG island amplifikation; 20) til et CpG island microarray indeholdende i alt 770 pletter repræsenterer repetitiv DNA fra forskellige klasser. Den første analyse blev udført ved at tælle hypermethyleret (log

2ratio 1,0) og hypomethylated (log

2ratio -1.0) gentagelser adskilt efter deres forskellige klasser (figur 3A). På CIMP + /MSI + prøver blev hver af gentagelserne klasser undtagen satellit gentagelser fundet at være beriget for hypermethylering i tumor-DNA sammenlignet med normale tilstødende slimhinder (hypermethylering /hypometylering = 2,4 gange i gennemsnit). Den berigelse for hypermethyleret sekvenser faldt kraftigt i CIMP + /MSI-og CIMP- /MSI- (0,88-og 0,71 gange, henholdsvis). Disse resultater antyder, at der er et stærkt pres for vedligeholdelse og /eller de-novo methylering af repetitive elementer i MSI + -gruppen. Validering af vores microarray metode blev gjort ved at sammenligne resultaterne for LINE-1 til pyrosekventering data i de samme kolorektale prøver. Denne analyse viste, at tumorer med den laveste LINE-1 demethylering ved pyrosekventering analyse viste den højeste berigelse for hypermethyleret LINE repeats (figur 3B), med overholdes den inverse situation for tumorer med den højeste LINE-1 demethylering. Disse resultater understøtter, at vores microarray analyse er en egnet teknik til at få adgang methylering ændringer i repetitive elementer.

Methyleret CpG Island amplifikation (MCA) /CpG island microarray for repetitive DNA-sekvenser. A) Relativ overflod af hypermethyleret og hypomethylated gentagelser for hver CIMP /MSI-gruppe. Der blev observeret en højere antal hypermethyleret forhold til hypomethylated gentagelser for CIMP + /MSI + gruppe og en gradvis ændring i repræsentationen af ​​hypermethyleret og hypomethylated gentagelser blev set for CIMP + /MSI-og CIMP- /MSI-grupper, hvilket resulterer i en overrepræsentation af hypomethylated gentagelser i mikrosatellitmarkørerne stabile grupper. B) Validering af microarray resultater for LINE gentagelser. Bemærk at CIMP /MSI grupper med højere demethylering, bestemt ved bisulfit-pyrosekventering af LINE-1, der præsenteres også et større antal hypomethylated LINE gentager ved microarray analyse, som repræsenteret ved et lavere hyper /hypometylering forholdet. C) i vognen hierarkisk klyngedannelse blev påført methylering data fra et sæt af 770 repetitive DNA-sekvenser på tværs seksten kolorektale tumorer parret med deres normalt udseende slimhinde DNA. De colorektale tumorer dendrogram er vist, og prøven ID for hvert tilfælde er indeholdt i den rigtige. De terminale grene er farvekodede for at repræsentere CIMP /MSI status tumorprøven (rød, CIMP + /MSI +; blå, CIMP + /MSI-, grøn, CIMP- /MSI-). Samlet set prøver af samme CIMP /MSI gruppe klynge, styrke forskellige methylering skæbne for gentagne DNA-sekvenser methylering i hver gruppe. LINE, længe afbrudt nukleare elementer; SINE, kort afbrudt nukleare elementer, LTR, lange terminale gentagelser; DNA gentagelser; Satellit gentagelser.

Endelig hjælp af normaliserede log

2ratio værdier af de enkelte pletter, vi udførte ukontrollerede hierarkisk klyngedannelse at afsløre lighederne blandt de 16 kolorektal tumor sager undersøgt. Det resulterende klynger image map viste en god overensstemmelse med det forventede adskillelse af individuelle prøver ved kendte CIMP /MSI-status (figur 3C), hvilket tyder på, at methylering underskrifter af disse tumorer ikke er begrænset til en enkelt kopi-gener, men også involvere repetitive DNA elementer.

hypometylering af LINE-1 i cancer cellelinjer viser vævsspecifik variabilitet

for at kontrollere, om variationen i hele genomet methylering er begrænset til primære colorektale carcinomer eller også forekommer i andre tumortyper, vi anvendte LINE-1 bisulfit-pyrosekventering metode til tres-én cancer cellelinjer fra otte forskellige væv typer (bryst, centralnervesystemet, colon, leukæmi, lunge, ovarie, prostata og lever). Interessant nok fandt vi et markant fald i LINE-1-methylering i de fleste af de undersøgte cellelinier (figur 4). Samlet set 50/61 testede cancer cellelinjer blev hypomethylated til LINE-1, med en relativ demethylering på 15% eller mere (absolut methylering tæthed lavere end 60%) i forhold til perifert blod lymfocytter og normal colon mucosa. I lighed med primære colorektale tumorer, disse cancercellelinier udviste høj variabilitet i LINE-1 methylering, der spænder fra 6,5% (K562, en CML-cellelinie med erythroleukæmi faciliteter) til 74,2% (CEM, en akut lymfoblastisk leukæmi cellelinje). Der er en tydelig vævsspecificitet for demethylering; de laveste niveauer af LINE-1 methylering blev observeret i leveren (24,0%), efterfulgt af CNS (28,9%), bryst (29,8%), lunge (35,1%), prostata (41,9%), ovarie (49,7%), colon (46,7%) og leukæmi (56,1%). Mens en interessant fund, vi advare generalisering af data, fordi: (i) LINE-1 methylering blev ikke undersøgt for normale væv undtagen tyktarmen og perifert blod; og (ii) et lille antal cellelinier blev analyseret for leveren og prostatacancer.

LINE-1 methylering variabilitet i cancercellelinier. DNA-prøver af normalt perifert blod lymfocyt, normal colon mucosa og tres-én cellelinjer fra otte forskellige væv typer blev undersøgt for LINE-1 methylering hjælp bisulfit PCR efterfulgt af pyrosekventering. De normale væv præsenteret høje niveauer af LINE-1 methylering (over 70% i gennemsnit), og en stor variation i methylering niveauer blev observeret for cancercellelinjer, med overholdes en methylering densitet på 6,5% minimum for leukæmi K562. Taget som en gruppe, blev leukæmi-cellelinier moderat demethyleres (gennemsnit 56,1%), efterfulgt af ovarie, kolon, prostata og lungekræft cellelinier (variation fra 49,7% til 35,1%). Centralnervesystemet (CNS), bryst og de testede var dybt demethyleres én leverkræft cellelinjer (bellow 30% i gennemsnit). Stiplet linje repræsenterer gennemsnitlig methylering i normale kontroller.

En anden væsentlig konklusion er, at nogle cellelinjer viser ekstrem hypometylering. Mens leukæmier generelt nuværende LINE-1 methylering niveauer svarende til PBL, 3/15 cellelinjer har mere end 50% relativ demethylering (K562, HEL og TF-1). En lignende situation er observeret i andre væv, var “demethylering champions” cellelinjer blev identificeret (SKBR3 i bryst og OVCA420 i æggestokkene). En attraktiv forklaring er, at gener involveret i DNA metylering vedligeholdelse mangler eller muteret i disse cellelinier.

Discussion

DNA methylering spiller en vigtig rolle i normale celler, at være involveret i X-kromosom inaktivering , prægning og undertrykkelse af repetitive elementer såsom retrotransposoner og endogene retrovirus [23], [24]. Samtidig, CpG-øer i promotorregionen af ​​enkelt-kopi-gener er methylering-fri, hvilket er vigtigt for at muliggøre transkription. I kræft, er en omvendt scenarie fundet, med single-kopi CpG ø hypermethylering og genom-dækkende hypometylering. Formålet med det foreliggende arbejde var at bestemme forholdet mellem disse to unormale begivenheder, hjælp kræft cellelinjer fra flere vævstyper og primære kolorektale tumorer som model.

Mens genom-dækkende demethylering og single-kopi CpG ø hypermethylering forekomme i kræft, er det dårligt forstået, om disse to ændringer er forbundet. Vores data baseret på methylering niveauer af repetitive elementer, ved hjælp af både en specifik analyse for LINE-1 methylering analyse og en microarray platform bestående næsten 800 repetitive DNA-sekvenser fra forskellige klasser, viser, at disse tumorer med de højeste niveauer af afvigende hypermethylering (CIMP + /MSI + ), viste også det laveste niveau af genom-dækkende hypometylering, sammenlignet med normal tilstødende slimhinde. Faktisk viste disse tumorer hyppige stigning i methylering af repetitive elementer, som afsløret af både LINE-1 og microarray analyse. Interessant, CIMP + /MSI-og CIMP- /MSI-viste højere niveauer af LINE-1 hypometylering, styrke det unikke i CIMP + /MSI + tumorer. Selv CIMP + /MSI-og CIMP- /MSI-grupper var lige hypomethylated til LINE-1, hvilket antyder, at mikrosatellit ustabilitet er den vigtigste molekylære ændring i forbindelse med manglende LINE-1 hypometylering. Disse resultater er overensstemmende med tidligere rapporter om manglende global hypometylering i mikrosatellitmarkørerne ustabile tumorer [15]. Konsensus fortolkning af disse data er, at kolorektale tumorer opstår fra to forskellige progression veje: global hypermethylering med mikrosatellit ustabilitet og global hypometylering med kromosom ustabilitet. Det er imidlertid nødvendigt at bemærke, at CIMP + /MSI + gruppe ikke kun karakteriseret ved mikrosatellit ustabilitet, men også for en højere frekvens af hypermethyleret CpG-øer. Faktisk den sygdomsfremkaldende faktor af den observerede mikrosatellit ustabilitet er den eksklusive hypermethylering af MHL1 i disse tumorer, og andre gener som p16 og THBS1 findes også oftere methylerede i CIMP + /MSI + i forhold til CIMP + /MSI- [25]. Hertil kommer, at microarray analyse af gentagne DNA støttede eksistensen af ​​en gruppe af tumorer (CIMP + /MSI +) under stærkt pres for at de novo methylering af både CpG ø initiativtagere og repetitive elementer og re-klassificerede kolorektale tumorer i deres kendte CIMP /MSI-grupper . Især CIMP + /MSI-og CIMP- /MSI-meste grupperet hinanden, hvilket tyder på, at microarray analyse viste nogle særlige træk ved hver gruppe ikke set af LINE-1 bisulfit-pyrosequecing. For eksempel, SINE gentagelser viser en gradvis ændring i hypermethylering /hypometylering ifølge den CIMP /MSI, med CIMP + /MSI-være en mellemliggende gruppe. Også, satellit gentagelser (hovedsagelig repræsenteret ved centromere og pericentromeric gentagelser) viste en mere stabil mønster af methylering og det måske relateret til deres funktionelle rolle i kromosom adskillelse under celledeling. Derimod Ehrlich et al. [18] fandt, at hypometylering og hypermethylering er uafhængige i ovariecancer, baseret på kapaciteten af ​​disse ændringer til at forudsige graden af ​​malignitet i ovarietumorer. Imidlertid blev direkte sammenligninger af hypometylering i kræft med og uden høje niveauer af methylering (dvs. CIMP) er ikke undersøgt. Flere undersøgelser er nødvendige for at besvare, hvorfor forskel gentagne elementer klasser har forskellig følsomhed over for DNA hypometylering. Generelt vores microarray data antyder, at nogle klasser af repetitive elementer kan være omfattet af de samme methylering pres, der udøves på CpG øer på CIMP + kræftformer.

Brug LINE-1 methylering som et surrogat for global demethylering, fandt vi en stor variation i methylering niveauer mellem forskellige cancer cellelinjer, med vævsspecificitet. Nogle væv som bryst-, CNS og lunge undergår markante LINE-1 demethylering i kræft i en temmelig ensartet vis. I andre testede væv, såsom colon og leukæmi, nogle cellelinjer havde methylering niveauer svarende til dem, der udvises af normale colon og blodprodukter væv, mens andre dybt blev demethyleret. Selv om en opfølgende undersøgelse, herunder normale prøver fra de samme undersøgte væv er nødvendig for at bekræfte denne observation, en analyse udført af Chalichagorn et al. [26] ikke viste en markant forskel i methylering mellem normale prøver fra forskellige væv. I lighed med vores resultater, en tidligere undersøgelse af Flörl et al. [27] havde fundet en markant forskel mellem blære og nyrekarcinomer, med kun den første udstiller LINE-1 demethylering. Den store variation i den globale hypometylering observeret implicerer ikke-stokastiske mekanismer for denne defekt, og foreslår også en selektiv fordel for tumorer med svær hypometylering. Nyere eksperimenter viser, at tumordannelse induceres i mus efter global genomisk hypometylering [28], [29]. Brug af betinget transgen teknologi til at reducere ekspressionen af ​​DNMT1, Gaudet et al. [28] observeret spontan dannelse af T-celle lymfomer med køb af yderligere genomiske forandringer. Holm et al. [29] genereret mus, der efterligner tab af prægning (LOI), der formodes at skyldes hypometylering, og i disse dyr tumordannelse blev også observeret. Årsagerne til en sådan differentieret demethylering blandt kræft i forskellige væv er ukendte, og både genetiske og eksponering faktorer kan spille roller i dette. Gennemgribende hypometylering, som observeret i K562 og andre kunne være relateret til specifik tab af funktion af gener, der styrer methylering af repetitive elementer. Kandidatgener er dem, der koder for proteiner, der er blevet beskrevet at udøve funktionen som “heterochromatin vogtere”. For eksempel er LSH protein, et medlem af SnF2 /helicase familie proteiner, der kræves til hele genomet methylering. Knockout mus til Lsh genet viste perinatal dødelighed og viste markant demethylering af repetitive elementer, der er uafhængig af ændringer i RNA niveauer af DNMT1 [30].

Sammenfattende vores resultater viser, at genom-dækkende hypometylering er meget varierende i kræftceller, som er enkelt eksemplar CpG ø hypermethylering. Begge ændringer kan findes i tumorerne og hver enkelt kan fremme tumorigenese af uafhængige processer. Vores undersøgelse giver også beviser for en stærk omvendt sammenhæng mellem global hypometylering og mikrosatellit ustabilitet i kræft.