PLoS ONE: DNA aptamer Evolved af Cell-SELEX for Anerkendelse af prostatakræft

Abstrakte

sygelighed og dødelighed af prostatakræft (PCA) er steget i de seneste år på verdensplan. Øjeblikket eksisterende fremgangsmåder til diagnosticering og behandling gør ikke situationen bedre, især for hormon refraktær prostatacancer (HRPC). Manglen på molekylære prober til PCa hindret tidlig diagnosticering af metastaser og nøjagtig iscenesættelse til PCA. I dette arbejde har vi udviklet en ny aptamer sonde Wy-5a mod PCa cellelinie PC-3 ved celle-SELEX teknik. Wy-5a viser høj specificitet til målcellerne med dissociationskonstanter i det nanomolære område, og genkender ikke andre testede PCA cellelinjer og andre testede tumorcellelinier. Farvningen af ​​kliniske vævssnit med fluorescerende farvestof mærkede Wy-5a viser, at sektioner fra højrisikogruppe med metastase udviste stærkere fluorescens og snit fra benign prostatahyperplasi (BPH) udviste ikke bemærkelsesværdige fluorescens, hvilket tyder på, at aptamer Wy-5a kan binde til protein relateret til udviklingen af ​​PSA. Den høje affinitet og specificitet Wy-5a gør denne aptamer hold potentiale til anvendelse i diagnose og målrette behandlingen af ​​PCa

Henvisning:. Wang Y, Luo Y, Bing T, Chen Z, Lu M, Zhang N, et al. (2014) DNA aptamer Evolved af Cell-SELEX for Anerkendelse af prostatakræft. PLoS ONE 9 (6): e100243. doi: 10,1371 /journal.pone.0100243

Redaktør: Sabato D’Auria, CNR, Italien

Modtaget: Januar 18, 2014 Accepteret: 23. maj 2014 Udgivet: 23 Jun 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne anerkender den økonomiske støtte fra National Natural Science Foundation of China (81172430, 81372728, 21205124 og 81201694) og Grant 973 Program (2011CB935800) og Specialized forskningsfonden for ph.d.-programmet for videregående uddannelse i Kina (20120171120059). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatacancer (PCA) er den mest almindelige non-kutant neoplasme i den mandlige befolkning på verdensplan [1]. For nylig har flere undersøgelser vist, at hændelsen PCA er betydeligt højere end tyve år siden [2]. Opdateringen statistikken viser, at sygeligheden af ​​PCa har overskredet lungekræft og blevet den mest almindelige ondartet svulst hos mænd. Mere end 238,590 mænd vil blive diagnosticeret med PCa og 29.720 vil dø af metastatisk PCa i USA (US) i 2013, hvilket gør det den anden hyppigste årsag til kræft død hos amerikanske mænd, bag lungekræft [3]. Desværre havde de fleste PCA patienter i Asien avancerede lokal sygdom eller metastaser, når de blev diagnosticeret, og dødelighed af PCa kan fortsætte med at stige i de fleste asiatiske lande. Dette kan være forårsaget af ændringer i livet eller kosten stil og miljø [4].

Udførelsen af ​​PCa i den tidlige fase udviser en relativt indolent kur hos de fleste patienter [5]. Denne funktion gjort PCa svært at blive bemærket og diagnosticeres i den tidlige fase. Når patienterne er i smerte, de fleste af dem har forekommet den knoglemetastaser. Oprindeligt er de fleste PCA patienter er følsomme over for androgen deprivation terapi (ADT), men varigheden er heterogent, kan det vare fra nogle få måneder til mere end 3 år [6]. Sidst, kan PCa udvikle sig til Hormone prostatacancer (HRPC), som er resistent over for konventionel behandling. Vellykket cancerterapi er baseret på tidlig diagnose og nøjagtig stadieinddeling, som begge kræver egnede molekylære prober og biomarkører [7]. Endvidere er de molekylære niveauforskelle beslutter fænotype; personlig behandling er baseret på disse forskellige biomarkører til at diagnosticere og skelne præcist. Men manglen på molekylære prober til PCA celler hindret tidlig diagnosticering af metastaser og nøjagtig iscenesættelse til PCA. Serum prostataspecifikt antigen (PSA) er en biomarkør til PCA, og har været meget anvendt til påvisning af PSA. Koncentrationen af ​​PSA er også forbundet med malign grad og tumortilbagevenden. Men PSA er ikke en specifik markør for PCa da dens forhøjede serumkoncentrationer med benign prostatahyperplasi (BPH) og påvirkes af mange faktorer såsom medicin (Finasteride), urologiske manipulationer, inflammation, eller endda ejakulation [8], [9] . Selv, sammen med generalisering af screening med prostata-specifikt antigen (PSA) test, blev den diagnostiske sats og tidlig behandling hurtigt forbedres, men det kliniske forsøg i USA og Europa viser screeningen ikke har nogen effektiv på at reducere dødeligheden af ​​PCa [ ,,,0],10], [11]. Så for at forbedre den kliniske klassifikation og personlig kemoterapi, er det stadig nødvendigt at finde nye biomarkører eller sonder med mere specificitet.

For nylig, en ny klasse af molekylære prober betegnes aptamer har tiltrukket meget opmærksomhed som molekylære prober til sygdom diagnose og terapi. Aptamerer er enkelte oligonukleotider, der kunne folde til unikke tertiære strukturer gennem forskellige intramolekylære interaktioner [12]. Svarende til antistoffer, der er vildt anvendes i klinikken, kan aptamerer binder specifikt til forskellige mål, der spænder fra små organiske molekyler til proteiner [13], [14]. Sammenligning til antistoffer, aptamerer har lav-molekylvægt, højere stabilitet, hurtig vævsgennemtrængning, manglende immunogenicitet [15] – [18], og især, kan aptamerer syntetiseres kemisk og modificeret [19]. Disse fordele gør aptamerer alsidige værktøjer til diagnosticering [20], Image cytometri [21] og målrettede lægemidler [22].

Aptamere genereres af SELEX teknologi (Systematisk Evolution af ligander ved eksponentiel berigelse) [20], [23]. Celle-SELEX er en aptamer udvælgelsesprocedure anvendelse af hele celler som mål, som genererer cellespecifikke aptamerer ved anvendelse af forskellene på det molekylære niveau mellem to cellelinjer [19], [24] – [27]. Ved Cell-SELEX, et panel af aptamerer, der specically binder til target cellelinje kan identificeres uden forudgående kende den nøjagtige membranproteiner. I processen med berigelse, de levende celler forsikre målene eksisterende på membranen holde deres natur dannelse, så de opnåede aptamerer vil opretholde den samme affinitet og specificitet i deres cellulære anvendelser [28]. I dette papir, beskriver vi aptamer selektion mod PC-3-celler (et PCA cellelinie). Gennem celle-SELEX, vi identificeret en DNA aptamer, som binder specifikt til PC-3 celler og kan skelne BPH prøver og høj risiko PCA prøver fra klinikken.

Resultater og Diskussion

aptamer selektion mod PC-3-celler

processen med aptamer valg vises i figur 1. målcellelinie PC-3 er en typisk cellelinie fra androgenuafhængige cancerpatient med ossøse metastaser. Androgenuafhængige cancerpatienter med ossøse metastaser er de mest vanskelige at behandle. For at generere aptamerer med høj specificitet, brugte vi mere end en slags cellelinje som negativ kontrol for counter markering, herunder nontumor-immortaliserede prostata epitelceller line RWPE-1, humant hepatisk carcinom cellelinie SMMC-7721 og humane cervikale cancercellelinie line Hela.

for første runde valg, blev målcellerne inkuberet med det tilfældige DNA-bibliotek pool. Efter vask blev forblev sekvenser på celler amplificeret ved polymerasekædereaktion (PCR), og adskilles i enkeltstrengede sekvenser for anden runde selektion. Fra den anden runde selektion blev negative celler inkuberet med den berigede pool før målcellen bindende for at fjerne de sekvenser, der er bundet til de fælles molekyler til stede på overfladen af ​​målceller og kontrolceller. For hver to eller tre runder selektion blev aptameren berigelse overvåges ved flowcytometri og konfokal billeddannelse. Hvis aptamer sekvenser blev beriget, fluorescensintensiteten på overfladen af ​​PC-3-celler blev stærkere efter inkubering af celler med de valgte puljer. Som vist i figur 2A, fluorescensintensiteten på overfladen af ​​PC-3-celler stærkt forøgede i de første ti runder af udvælgelse, og fluorescensen forbedring på kontrolcellerne (SMMC-7721, figur 2B) var meget mindre, hvilket viser, at aptamerer til målet celler blev i høj grad beriget. Men efter udført yderligere fem runder af udvælgelse, selvom fluorescens på PC-3-celler var stadig stærkere end på kontrolceller, fluorescensen forbedring på PC-3-celler blev langsommere og at der på kontrolceller blev hurtigere, hvilket antyder, at mere ikke-specifikke sekvenser som bandt til begge cellelinier blev beriget. Konfokal imaging (figur 2C) viste, at aptamerer bundet på membranen af ​​målcellerne. Efter yderligere to selektionsrunder med stærkere counter selektion blev det 17. runde puljen klonet og 50 kloner blev sekventeret.

flowcytometriassayet af udvalgte puljer binde til mål-cellelinien PC-3 (A) og negativ kontrol celle line SMMC-7721 (B), Blank er baggrunden fluorescens af ubehandlede celler. Lib er FITC-mærket DNA-bibliotek som negativ kontrol. (C) Konfokal billeddannelse af PC-3 celler plettet af det 15. runde valgte pulje mærket af FITC (× 100 olie nedsænkning objektiv).

Identifikation af aptamerer mod målceller

efter justering blev de opnåede sekvenser af 50 kloner sig at fordeles i 5 familier ifølge lighederne af deres sekvenser. Ved at analysere den forudsagte sekundære struktur af sekvenserne i hver familie [29] – [31] blev seks sekvenser trunkeret og syntetiseret til bindingsassay (sekvenser ikke vist). Flowcytometri assay viste, at en sekvens, Wy-5a udviste de stærkeste binding til PC-3-celler og den svageste binding til andre celletyper (figur S1); derfor denne sekvens blev yderligere karakteriseret. Den sekundære struktur forudsigelse [32] viste, at Wy-5a vedtaget en hårnåle-struktur med en en-base-bule på stilken (figur 3). Fjernelse af én-basen bule, blev en perfekt hårnåle-struktur sekvens Wy-5b (tabel 1) også syntetiseret til yderligere karakterisering. Bindingsanalysen viste, at Wy-5a og Wy-5b specifikt bundet til PC-3-celler (figur 3). De ligevægt dissociationskonstanter (

K

d), i Wy-5a og Wy-5b blev beregnet til at være 73,59 ± 11,01 og 173,1 ± 44,67, hvilket indikerer, at aptamer Wy-5a har højere affinitet til PC-3 celler end Wy-5b. Den højere affinitet af Wy-5a antyder, at one-basen bule på stammen af ​​Wy-5a kan involvere binding til dets mål. På grund af den højere affinitet af Wy-5a, blev det yderligere karakteriseret som en ny probe til PCA detektion.

Koncentrationerne af DNA er 0, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0, 16, 32, 64, 128 og 256-mærket DNA-bibliotek (Lib). Den forudsagte sekundære struktur af Wy-5a og wy-5b (til højre), var genopbygge af værktøjet, som integrerede DNA Technologies (IDT). [Www.IDTdna.com/page/scitools].

Specificitet af Selected Aptamere

Specificiteten af ​​Wy-5a til andre tumorcellelinjer blev undersøgt ved flowcytometri og konfokal billeddannelse (figur 4). Blandt alle de testede cellelinjer, Wy-5A kun bundet til PC-3 cellelinie, ikke binder til andre PCA cellelinier (såsom DU145, fra PCa hjernemetastaser med moderat metastatisk potentiale 22RV-1, fra den lokale PCa uden metastatisk potentielle), og andre cancercellelinjer, herunder lungekræft cellelinje (A549), human brystcancer-cellelinie (MCF-7), humane cervikale cancercellelinie (HeLa), hepatomacellelinie (SMMC-7721), coloncancercelle linier (LoVo og HCT-8) leukæmi cellelinie (Jurkat) og kronisk myeloid leukæmi cellelinje (K562) (tabel S1). Disse resultater indikerer, at aptamer Wy-5a har fremragende specificitet til mål-cellelinie. Den høje specificitet gør Wy-5a har potentiale til anvendelse i detektion af metastase PCa eller et værktøj til target terapi

Række A, målrette cellelinie PC-3.; Række B, SMMC-7721; Række C, HeLa; Række D, 22RV-1. Colum 1, fluorescensbilleder; Colum 2, overlejring af fluorescens billeder og lyse felt billeder, Colum 3, Histogram Plot af flowcytometri. Blank er baggrunden fluorescens af ubehandlede celler henholdsvis; Lib er FITC-mærket DNA-bibliotek som negativ kontrol.

De bindingssteder af aptamer på målcellerne

konfokal billeddannelse har vist, at de opnåede aptamerer bundet på celleoverfladen ( Figur 2C og figur 4 række a), således en proteinasefordøjelse eksperiment blev udført for at kontrollere, om målmolekylet er et membranprotein. Som vist i figur 5, efter behandling med trypsin eller proteinase K i 2 min, PC-3-celler næsten bandt ikke Wy-5a, hvilket indikerer, at målmolekylet af aptamer Wy-5 er et membranprotein.

efter behandling med trypsin eller proteinase K, PC-3 celler næsten ikke binder Wy-5a. Blank er baggrunden fluorescens af ubehandlede celler henholdsvis.

internaliseringen af ​​Wy-5a

Tidligere undersøgelser har vist, at oligonukleotider længere end 25 baser ikke frit kunne gennemtrænge membranen [33] , [34]. Wy-5a er et 52-base-oligonucleotid, det er rettet mod et membranprotein. For at undersøge, om Wy-5a kan internalisere ind i celler via receptormedieret endocytose, blev PC-3-celler inkuberet med Wy-5a ved 37 ° C i 2 timer. Stigningen i tempreture fra 4 ° C til 37 ° C ikke meget indflydelse på bindingen af ​​Wy-5a til PC-3-celler (figur S2). Den flowcytometriassayet (figur 6) viste, at forbehandling af celler med trypsin forårsagede næsten fuldstændig tab af aptamer binding (sammenlignet med ubundet DNA labrary). Men behandling af cellen med trypsin efter aptamer binding kun forårsagede delvis tab af aptamer binding, hvilket antyder, at nogle Wy-5a kan internalisere ind i celler. I det konfokale billede af PC-3 celler efter inkubering med Wy-5a ved 37 ° C i 2 timer (figur 6), stærkt fluorescenssignal blev observeret på cellemembranen og svag fluorescens signal blev fundet i hele celler. Men det konfokale billede af celler icubated DNA-bibliotek viste ikke signifikant fluorescenssignal bortset fra nogle ikke-specifikke lyspunkter dispersedly adsorberet på cellerne. Disse resultater antyder, Wy-5a kan være involveret i receptor-medieret endocytose

W /O behandling:. Celler blev inkuberet med Wy-5a; Forbehandling: celler blev forbehandlet med trypsin og derefter inkuberet Wy-5a; efterbehandling: celler blev inkuberet Wy-5a og derefter behandlet med trypsin; Lib: negtive kontrol blev celler inkuberet med FITC-mærket DNA-bibliotek; blank:. er baggrunden fluorescens af ubehandlede celler

Den farvning af kliniske PCa glider

Over resultater hav vist, at aptamer Wy-5a har fremragende specificitet til PC-3 celler end DU145 og 22RV-1-celler. PC-3-cellelinjen blev initieret fra en knogle metastase af en grad IV androgenuafhængige PCa patient. Desuden skelet engagement er den mest almindelige metastatisk sted i avanceret fase PCa, observeret i op til 80% af patienterne [35]. DU145 blev afledt fra PCa hjernemetastaser med moderat metastatisk potentiale, og er ikke hormon-følsomme [36]; 22RV-1 er en human PCa cellelinie uden metastatisk potentiale afledt af en xenograft i mus [37]. Derfor målproteinet af Wy-5a kan have korrelation med aggressivitet eller metastase. aptamer Wy-5a kan således have potentiale i tumor klassificering og iscenesættelse. For at teste muligheden for Wy-5a for tumor klassificering og iscenesættelse, brugte vi dette aptamer at farve PCA vævssnit fra kliniske patienter. Den negative kontrol er BPH væv, en udbredt noncancerous ændring i alderen mand. Tumorvæv blev fået fra patienter med PCa (identificeret ved senior patolog, tredje tilknyttede hospital af Sun Yat-Sen University). Snittene blev skåret fra formalin-fikserede paraffin-indlejrede (FFPE) væv, og membranen antigener blev repareret ved kogning EDTA Antigen Retrieval Solution før farvning. Som vist i figur 7, efter farvet ved FITC (fluoresceinisothiocyanat) -mærket aptamer Wy-5a, cancer væv udviste stærk fluorescenssignal. Men fluorescens-signalet var næppe observeret på dias BPH væv

Sjældent fluorescenssignal. (-) Blev observeret på BPH dias. I veldifferentieret prostatacancer, Gleason score: 2 + 3, ingen bevis for andre organer metastase, meget svag fluorescens signal (+) blev observeret. I lav-opdelte prostatacancer patient, Gleason score: 5 + 5, med knoglemetastaser, blev der observeret kraftig fluorescens signal (+++). (Colum 1) HE farvning af paraffin sektion fra klinisk prøve, (Colum 2) Lys på konfokal, (Colum 3) Fluorescens signal om konfokal.

farvning af alle dias blev opsummeret i tabel 2 . Helt, alle de 10 BPH slides fra forskellige patienter viste negative resultater og 20 kræft glider ud af 28 tilfælde af kræft væv viste positive resultater. Kun 8 tilfælde af kræft dias kunne ikke farves af aptamer. Sammenligning af Gleason score på kræft væv og journal af patienterne, fandt vi et interessant fænomen: dias fra patienter med højt Gleason score ( 6) med knoglemetastaser viste stærkere fluorescens på cellemembranen end lav score (≤6 ) uden metastaser (figur 7). Dette indikerede, at målproteinet af Wy-5a højt udtrykt i disse høje score patienter med metastase. Den Gleason grading system er et kraftfuldt værktøj til at prognosticate og hjælp i behandlingen af ​​mænd med PSA. Baseret på patologisk struktur kirtel epitel, er vævet billedet inddeles i fem typer. Fra den første til den femte type, graden af ​​differentiering gradvist reduceret [38]. Da Gleason score reflekterer malignitet graden af ​​PCa, kan disse resultater indebærer, at målproteinet af Wy-5a måske har nogle forhold med den maligne grad eller aggressivitet eller progression af tumor. Yderligere protein identifikation og evaluering vil blive gennemført for at belyse dette spørgsmål. Dette sæt af resultater tyder aptamer Wy-5a har potentiale til at tjene som probe til diagnosticering af PSA.

PCA patienter med tilbagefald eller i fremskredent stadium vil i sidste ende blive HRPC og viser ingen reagerer på ADT [6]. Udviklingen af ​​dets resistens foruden hormon ildfasthed, gør effekten af ​​behandlingen frustrerende [39]. Imidlertid heterogen varighed er angivet, at de typer og manifestationer af patienterne er forskellige. Nøjagtig klassificering af type eller grad er nyttigt at forbedre effektiviteten af ​​behandlingen. Derfor er der behov for mere diagnostiske reagenser for at vælge den optimale personlige terapi. Nogle kemoterapeutiske midler er effektive in vitro, men mangel på celle-selektivitet, begrænset alvorlige toksicitet og bivirkninger deres anvendelse in vivo. Aptamer medieret målrettet medicin kan være en god løsning. Indtil nu dage, har kun én RNA aptamer sigter mod PCa blevet genereret ved traditionel SELEX-fremgangsmåden, dvs. aptamer mod PSMA (prostataspecifikt membran-antigen, der kun udtrykkes i LNCaP-cellelinie) [40]. På typisk cellelinien PC-3, er der stadig ingen oligonukleotid aptamer udviklet sig. For nylig aptamer baseret drug delivery har vist gode resultater [41]. Den høje affinitet og specificitet til PC-3 cellelinie og kræft væv med høj risiko og metastase indebærer, at DNA aptamer Wy-5a hold potentiale på området for klassificering, afsløring og target terapi af PCA patienter.

Eksperimentel sektion

Cellekultur

Tolv etablerede cellelinier blev anvendt: RWPE-1 er en immortaliseret normal human prostata epitelial cellelinje. PC-3, DU-145 og 22RV-1 er humane PCA cellelinier. SMMC-7721 er en human hepatisk carcinom cellelinie. LoVo og Hct-8 celler er kolorektale carcinom-cellelinier. HeLa er et humant livmoderhalskræft cellelinjer. A549 er en human lungecancer-cellelinie. MCF-7 er en human brystcancer cellelinje, Jurkat er en akut T-celle leukæmi-cellelinje, K562 er en kronisk myeloid leukæmi cellelinie. RWPE-1, PC-3, DU-145, 22RV-1, SMMC-7721 og LoVo cellelinjer blev købt fra Typisk konservering kultur provision celle bank, kinesiske videnskabsakademi (Shanghai, Kina). HeLa, A549, MCF-7, Jurkat og K562 blev købt fra Institut for Basic Medical Science ved Chinese Academy of Medical Sciences (Beijing, Kina). RWPE-1 blev dyrket i keratinocyt serumfrit medium (K-SFM) med ekstrakt fra bovin hypofyse (BPE) og human rekombinant epidermal vækstfaktor (EGF), de andre tumorcellelinier blev dyrket i RPMI 1640 dyrkningsmedium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, GIBCO) og 100 enheder /ml penicillin streptomycin (Sigma). Alle cellelinjer blev holdt ved 37 ° C og 5% CO

2 incubator. I hele processen, skal alle vigtige indeks vokse på celler holde stabil og cellerne blev holdt i god stand, som etablerer et stabilt grundlag for yderligere forsøg.

Buffer

Washing buffer var forberedt ved tilsætning af 5 mmol MgCl

2 og 4,5 g glukose i en L 0,01 M PBS (indeholder 8 g NaCl, 0,2 g KCI, 3,58 g Na

2HPO

4 · 12H

2O, 0,272 g KH

2PO 4 pr 1 l Hedeselskabet

2O. pH = 7,4) uden calcium og magnesium

. Bindingsbufferen blev fremstillet ved tilsætning af 1 mg /ml bovint serumalbumin (BSA, Sigma) og 0,1 mg /ml Herring Sperm DNA (Invitrogen) til vaskebuffer.

SELEX ssDNA bibliotek og PCR-primere

HPLC-renset bibliotek indeholdt en central randomiseret sekvens på 45 nukleotider (nt) flankeret af 20-nt primer hybridiseringssites (5′-ACGCTCGGATGCCACTACAG-45nt-CTCATGGACGTGCTGGTGAC -3 “). En fluoresceinisothiocyanat (FITC) -mærket 5′-primer (5′-FITC-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3 ‘) og et biotinyleret (Bio) 3′-primer (5′-Bio-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3’) blev anvendt i PCR-reaktioner til syntese af dobbeltstrengede mærket, dobbeltstrengede DNA-molekyler. Efter denaturering i alkaliske betingelser (0,2 M NaOH), er det FITC- konjugerede forstand ssDNA aptamer adskilt fra den biotinylerede antisense ssDNA streng af streptavidin-belagte sepharoseperler (Streptavidin Sepharose High Performance) (GE Healthcare, Sverige) og anvendt til næste runde udvælgelse eller bindingsassay. Udvælgelsesprocessen blev overvåget ved anvendelse flowcytometriassayet og konfokal billeddannelse.

Procedure SELEX

Processen med celle-SELEX ligner den tidligere [42] beskrevne. I kortvarigt blev processen udført som følge trin (figur 1). Før hver runde af SELEX, målcellerne PC-3 blev dyrket til 80~90% konfluens og de negative celler blev dyrket for at fuldføre konfluens i 60 mm petriskål og vasket tre gange med forafkølet PBS. 10 nmol indledende ssDNA bibliotek opløst i 1 ml bindingspuffer blev denatureret ved 95 ° C i 5 minutter og holdes i isbad i 15 minutter, derefter anbragt i stuetemperatur omkring en halv time før brug. Efter inkubering biblioteket pool med målcellerne ved 4 ° C i 1 time blev den initiale bibliotek opløsningen fjernet. Efter vasket med vaskebuffer de klæbende celler blev skrabet af og opsamles i en 2 ml rør, vasket igen. Den afgrænsede DNA’er blev elueret ved tilsætning af 500 pi ddH

2O i røret, og opvarmning til 95 ° C i 5 min. Efter centrifugering blev supernatanten anvendt som template og amplificeret ved PCR med primerne mærket med FITC eller biotin (10-15 cykler af 30 sek denaturering ved 95 ° C, 30 sekunder, annealing ved 59 ° C, og 30 sek forlængelse ved 72 ° C, den sidste runde efterfulgt af 5 minutter ved 72 ° C;. holde produktionen ved 4 ° C The Taq-polymerase og dNTP’er blev opnået fra Takara). FITC-mærkede sense ssDNA pool blev adskilt fra PCR-produktet af streptavidinovertrukne sepharoseperler for den næste runde selektion. Fra den anden runde af selektion blev negative celler inkuberet med ssDNA pool først for counter udvælgelse, kan de negative celler bundet med uspecifikke sekvenser blev fjernet ved centrifugering. Supernatanten blev inkuberet med målceller at berige specifikke sekvenser. Udvælgelsesprocessen blev overvåget ved anvendelse af flowcytometri og konfokal billeddannelse. Fra 2. til 5. runde, blev RWPE-1-celler, der anvendes til tæller udvælgelse; fra 6. til 8. runde blev SMMC-7721 bruges til counter valg; fra 9. til 10. runde udvælgelse blev Hela celler anvendt til counter valg. Efter 10. runde blev HeLa og SMMC-7721 celler bruges til counter udvalg separat i hver runde. Til opnåelse aptamerer med høj affinitet og specificitet blev trykket af udvælgelsen forbedret gradvist fra 1. til 15. selektion ved at nedsætte mængden af ​​ssDNA pool (fra 100 pmol til 50 pmol), inkubationstiden for målcellerne (fra 60 min til 30 min), og målet celleantal (fra 7,5 mio /10 cm skål til 1 million /3,5 cm skål) og ved at øge antallet af vaske (fra to til tre). I de sidste to runder af styrket udvælgelse (16.-17), vi reduceret puljen til 30 pmol, inkubationstid til 15 min og øge vask til fire gange med stærkere ryster. Fuldstændig 17 selektionsrunder blev udført før sekventering. Klonen og sekventering blev udført af Sangon Biotechnology Co., Ltd.,

Flowcytometrisk analyse

For at overvåge berigelsen af ​​aptameren sammen med forløbet af SELEX, målcellerne og negative celler var dyrket i monolag med 80~90% konfluens, dissocieres derefter cellerne ved 0,02% EDTA efter vasket i PBS én gang ved stuetemperatur. Efter vasket med kold vaskebuffer to gange, celler (2 x 10

5) blev inkuberet med FITC-mærkede ssDNA puljer eller udvalgte DNA-sekvenser (0,25 uM) i 200 pi bindingsbuffer ved 4 ° C i 30 minutter. Før flowcytometri assay blev cellerne vasket to gange ved kold vaskebuffer og filtreret med en 400 mesh celle-sigte. Fluorescensen blev bestemt med FACScan cytometer (Becton Dickinson) ved at tælle 1 × 10

4 begivenheder. Den FITC mærkede bibliotek pulje blev anvendt som en negativ kontrol.

Farvning af menneskelig tumor vævssnit ved hjælp valgte aptamer

Paraffin væv blokke blev leveret af patologi afdeling af 3. tilknyttede hospital, Sun Yat- sen universitet (Guangzhou Kina). Forbehandlingen af ​​sektionerne (5 um tykke) blev udført som tidligere beskrevet [43], [44]. Antigen hentning proces er den samme med immunohistokemisk-kemi. Vævssnittene blev afparaffineret i xylen to gange (10 minutter hver gang) efter holdes i konstant temperatur ovn ved 60 ° C i 20 min. Brug gradient ethanol (100%, 95% og 70%) at rehydrere sektionen og glassene skylles i demineraliseret vand. Efter vask i PBS i 5 minutter, blev alle sektioner løber i TE-buffer (indeholder 10 mmol Tris, 1 mmol EDTA hvert 1. L ddH

2O, pH = 8,0) og hurtigt opvarmet til kogning ved mikrobølgeovn, så holder den temperatur ved 95 ° C i 15 min for at hente antigener og naturlig køling til stuetemperatur, derefter vasket tre gange med frisk PBS. Efter histologisk proces blev Vævssnittene inkuberet med bindingsbuffer indeholdende 20% FBS og 0,1 mg /ml Herring Sperm DNA ved stuetemperatur i 60 minutter og derefter inkuberet med 250 nM FITC-mærkede aptamerer i bindingspuffer 60 minutter ved 4 ° C. Så disse vævssnit blev vasket tre gange med frisk PBS, dehydreret og forseglet af antifade Polyvinylpyrrolidon Mounting Medium. Endelig blev de farvede snit afbildet af spinning-disk konfokal fluorescensmikroskopi (Olympus IX71, Japan). FITC var begejstret med en 488 nm argon-ion laser (Mells Griot, CA) .De fluorescens signaler blev observeret af en 40 × objektiv (NA 0,90, UPLSAPO, Olympus, Japan). Billederne blev analyseret ved FV10-ASW Version 3.1.

affinitet og specificitet af aptamer

14 cellelinier blev anvendt til at teste specificiteten af ​​aptamererne ved flowcytometri assay som beskrevet ovenfor. For at teste affinitet forskellige aptamerer til PC-3cell blev anderledes koncentration af aptamerer inkuberes med 2 × 10

5 celler ved 4 ° C, og derefter analyseret ved flowcytometri. Den gennemsnitlige fluorescensintensitet af hver prøve blev trukket den gennemsnitlige fluorescensintensitet af baggrunden. De ligevægtsdissociationskonstanter (

K

d), aptamer-celle interaktion blev opnået ved at tilpasse afhængigheden af ​​fluorescensintensitet af specifik binding af koncentrationen af ​​aptamererne til ligningen

Y

=

B

max

X-service /(

K

d +

X

), ved hjælp af SigmaPlot (Jandel, San Rafael, CA) [ ,,,0],25].

proteinase behandling for celler

PC-3-celler blev vasket to gange på fad af PBS ved stuetemperatur, dissocieret ved 0,02% EDTA. Efter vasket, 2 × 10

5cells inkuberet med 200 pi af 0,05% trypsin eller 0,1 mg /ml proteinase K ved 37 ° C i 2, 5 og 10 min hhv. Reaktionen blev afsluttet ved tilsætning af komplet medium. Efter vask blev de behandlede celler inkuberet med aptamer og anvendes til flowcytometri assay som tidligere beskrevet.

Konfokal billede af celler

konfokal fluorescensmikroskopi blev anvendt til at observere binding af aptamerer til leve- celler. 2 × 10

4 celler blev dyrket i 35 mm Glas Bottom Dish i mere end 1 dag at få et godt forlængelse. Efter vasket ved kold vaskebuffer blev cellerne inkuberet med aptamerer (0,25 uM) ved 4 ° C i 30 minutter. Efter vasket to gange, cellerne blev afbildet ved spinning-disk konfokal fluorescensmikroskopi (Olympus IX71, Japan). FITC var begejstret med en 488 nm argon-ion laser (Mells Griot, CA) .De fluorescens signaler blev observeret af en 40 × objektiv (NA 0,90, UPLSAPO, Olympus, Japan). Billederne blev analyseret af FV10-ASW Version 3.1.

Den internalisering af det aptamer

Målet celle PC-3 blev dissocieret med 0,02% EDTA. Efter vask blev cellerne opdelt i 5 rør. Et rør uden nogen behandling som blanke; ene rør blev inkuberet med 0,25 uM FITC-mærket DNA Library som negtive kontrol; ene rør blev inkuberet med 0,25 uM FITC-mærket Wy-5a som positiv kontrol; ene rør blev forbehandlet med 0,05% trypsin i 10 minutter og derefter inkuberet med 0,25 uM FITC-mærket Wy-5a (forbehandling); ene rør blev inkuberet med 0,25 uM FITC-mærket Wy-5a og derefter behandlet med 0,05% trypsin i 10 minutter (efterbehandling). Alle inkubationer med DNA blev udført ved 37 ° C i 2 timer i serumfrit RPMI 1640 medium. De fem prøver blev anvendt til flowcytometri assay som beskrevet ovenfor. For det konfokale observation blev PC-3-celler inkuberet med 0,25 uM FITC-mærket Lib eller Wy-5a i serumfrit RPMI 1640 medium ved 37 ° C i 2 timer og derefter anvendt til billeddannelse som beskrevet ovenfor.

Støtte Information

figur S1.

Flowcytometri assays af celler efter inkubering med tdifferent aptamerer. Blank:. Er baggrunden fluorescens af ubehandlede celler

doi: 10,1371 /journal.pone.0100243.s001

(TIF)

Figur S2.

flowcytometriassayet af PC-3-celler efter inkubering med Wy-5a ved 4 ° C eller 37 ° C. Bindingsevnen af ​​Wy-5a viser ingen forskel ved 4 ° C eller 37 ° C. Blank:. Er baggrunden fluorescens af ubehandlede celler

doi: 10,1371 /journal.pone.0100243.s002

(TIF)

tabel S1.