PLoS ONE: Promoter hypermethylering Profilering Identificerer undertyper af hoved- og halscancer med Distinct Viral, Miljø, Genetisk og overlevelsesegenskaber

Abstrakt

Baggrund

Epigenetisk og genetiske ændringer spiller en stor rolle for udviklingen af ​​hoved og hals pladecellekræft (HNSCC). Forbrug af tobak (rygning /tygning) og human papillomavirus (HPV) er også forbundet med en stigning i risikoen for HNSCC. Promoter hypermethylering af tumorsuppression gener er relateret med transkriptionel inaktivering og tab af genekspression. Vi undersøgte epigenetiske forandring (promotor methylering af tumor-relaterede gener /loci) i tumorvæv i forbindelse med genetisk ændring, virusinfektion, og eksponering tobak og overlevelse status.

Metode

Undersøgelsen omfattede 116 vævsprøver (71 tumor og 45 normale væv) fra det nordøstlige indiske befolkning. Methylering specifik polymerasekædereaktion (MSP) blev anvendt til at bestemme status for methylering af 10 tumorrelaterede gener /loci (

p16

,

DAPK

,

RASSF1

,

BRAC1

,

GSTP1

,

ECAD

,

MLH1

,

MINT1

,

MINT2

MINT31

). Polymorfier af

CYP1A1

,

GST

(

M1

T1

),

XRCC1

XRCC2

gener blev undersøgt ved hjælp af polymerasekædereaktion-restriktion polymorfisme (PCR-RFLP) og multiplex-PCR henholdsvis.

vigtigste resultater

Unsupervised hierarkisk clustering analyse baseret på methylering mønster havde identificeret to tumor klynger, som i væsentlig grad afviger fra CpG ø methylator fænotype (CIMP), tobak,

GSTM1

,

CYP1A1

, HPV og overlevelse status. Analyse methylering af gener /loci individuelt, har vi fundet signifikant højere methylering af

DAPK

,

RASSF1

,

p16

og

MINT31

gener (

P =

0,031, 0,013, 0,031 og 0,015 henholdsvis) i HPV (+) tilfælde sammenlignet med HPV (-). Desuden blev en CIMP-høj og Cluster-1 karakteristik også forbundet med dårlig overlevelse.

Konklusioner

Promotor methylering profiler afspejler en sammenhæng med tobak, HPV, overlevelse status og genetiske ændringer og kan handle som markør for at bestemme undertyper og patient resultat i HNSCC

Henvisning:. Choudhury JH, Ghosh SK (2015) Promoter hypermethylering Profilering Identificerer undertyper af hoved- og halscancer med Distinct Viral, miljø, Genetiske og overlevelsesegenskaber. PLoS ONE 10 (6): e0129808. doi: 10,1371 /journal.pone.0129808

Academic Redaktør: Dajun Deng, Peking University Cancer Hospital og Institut, KINA

Modtaget: Marts 20, 2015; Accepteret: 13. maj 2015; Udgivet: 22 juni, 2015

Copyright: © 2015 Choudhury, Ghosh. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Globalt hoved og halscancer er den femte mest almindelige kræftform og tegner sig for mere end 550.000 nye tilfælde hver [1] om året. Forbrug af tobak (rygning og tygning), alkohol og HPV-infektion er velkendte risikofaktorer mod udviklingen og progressionen af ​​hoved og hals pladecellekræft (HNSCC) [2, 3]. I Indien, HNSCC har dyb rygning, betelnødder quid og tobak tygge profil og relativt dårlige overlevelse [4-6]. Imidlertid HPV positive (+) HNSCC havde klar risiko profil og forbundet med en bedre overlevelse sammenlignet med HPV negative (-) HNSCC [7]. Genetisk ændring såsom mutationer og genetiske polymorfier også spille en central mekanisme i HNSCC [8-11]. Desuden kan epigenetisk modifikation (variation af genekspression uden at påvirke primære sekvens af DNA’et) ændre ekspressionen af ​​centrale tumorrelaterede gener og således betragtes som en afgørende spiller for udviklingen af ​​forskellige kræftformer [12-14].

Hypermethylering af CpG-øer i promotorregionen af ​​gener (der er involveret i cellecyklusregulering, apoptose, DNA beskadigelse reparation og afgiftning pathway) er associeret med cancer progression og udvikling. Således afvigende methylering af CpG-øer er en af ​​de epigenetiske ændringer lovende enorme potentiale molekylær biomarkør til forudsigelse og detektion af en række forskellige cancere [15, 16]. CpG ø methylator fænotype (CIMP) associerede tumorer er en særskilt gruppe defineret ved CpG-rige promotor hypermethylering i flere gener og har en særskilt epidemiologi og molekylære egenskaber [17-20]. Begrebet CIMP blev først foreslået i kolorektal cancer som en molekylær markør [21], senere blev det også undersøgt i andre tumortyper. Imidlertid er stadig ukendt rolle CIMP pathway i tumorgenese af HNSCC. Den største konfrontere i at studere og udforske CIMP tilknyttede tumorer er at definere specifikke methylerede loci, der skal bruges som CIMP panel. Afvigende methylering af normalt ikke-methylerede CpG-øer er forbundet med transkriptionel inaktivering og dermed tab af genekspression. Nylige undersøgelser, der foretages på forskellige tumor-relaterede gener vist også differentiel methylering mønster i HNSCC [22-26]. At vurdere og skærm CIMP status kræftformer, Park et al [27] foreslog et panel af gener består

af p16 /CDKN2A

,

MINT1

,

MINT2

,

MINT31

MLH1

(benævnt som klassisk CIMP panel) .De frekvenser af hypermethylering i et panel af seks gener (

ECAD

,

p16

,

DAPK

,

MGMT

,

RASSF1

TIMP3

) blev fundet meget højt i hoved og halscancer [28]. I en anden undersøgelse afvigende methylering af

MINT1

MINT31

viste sig at være associeret med dårlig prognose [29]. Tidligere undersøgelser rapporterede også, at

p16

DAPK

afvigende methylering var forbundet med dårlig prognose i oral cancer [30, 31]. Derfor foreslog vi en CIMP panel af syv gener, herunder;

DAPK

(død-associeret protein kinase),

RASSF1 Hotel (Ras forening domænenavn familie-1),

BRCA1

(brystkræft 1),

MLH1

(mutL homologi 1),

p16

(cyklin-afhængige kinase inhibitor 2A),

ECAD

(epitelial cadherin),

GSTP1

(glutathion S-transferase pi-1 ), og tre methylerede loci såsom

MINT1

,

MINT2

MINT31 Hotel (methyleret i tumor 1, 2 og 31 henholdsvis). Nylige epigenetiske undersøgelser af forskellige kræftformer hovedsageligt fokuseret på multigenfamilie tilgang, foreninger med HPV-infektion og clinicpathological data og med genetiske ændringer [32-34]. HPV oncoproteiner E6 og E7 er kendt for at være associeret med genomisk ustabilitet ved at inaktivere p53 og Rb tumor suppressor proteiner af cellecyklus pathway [35], bortset fra dette, HPV modulerer også afvigende DNA-methylering af værtsgenomet [36] og forårsage kræftfremkaldende processer. De sidste par år, havde mange undersøgelser udført for at forklare sammenslutning af HNSCC med vekslen af ​​miljøfremmede og DNA reparation pathway gener samt gen-gen og gen-miljø interaktion [37, 38]. Tahara et al. [39] viste genetiske faktorer, relateret til DNA-reparation eller miljøfremmede pathways kan spille en rolle i CpG island hypermethylering-relateret gastrisk carcinogenese. Der var imidlertid ingen sådanne undersøgelser fokusere specifikt promotor methylering profil i HNSCC med en kombination af genetiske risikofaktorer i forbindelse med miljøfremmede stoffer og DNA-reparation vej. Således variation i promoter hypermethylering mønster af HNSCC baseret på vaner, genmodifikation og HPV-infektion er fortsat uklart.

For at forstå de underliggende mekanismer af forskelle i mønstre af tumor-specifikke hypermethylering, har vi analyseret den afvigende promotor methylering profil af HNSCC hjælp syv vigtige tumor-relaterede pathway gener, herunder

DAPK

,

RASSF1

(apoptose pathway),

BRCA1

,

MLH1

(DNA-reparation vej),

p16

(celle-cyklus vej),

ECAD

(celle-celle adhæsion),

GSTP1

(miljøfremmede vejen) og tre methylerede loci (

MINT1

,

MINT2

MINT31

) i den høje kræfttilfælde zone nordøstlige Indien. Så vidt vi ved, er vi de første til at udforske; korrelationen mellem CIMP egenskaber med genetiske (polymorfier af

GSTM1

,

GSTT1

,

CYP1A1

,

XRCC1

og

XRCC2

gener ) og miljømæssige faktorer (rygning, betel quid og tobak tygge) og også med HPV og overlevelse status HNSCC patienter. Desuden udførte vi hierarkisk klyngeanalyse til at identificere forskellige undergrupper af HNSCC baseret på promotor methylering profil.

Materialer og metoder

Indsamling af HNSCC væv

I den foreliggende undersøgelse, vi undersøgte 116 vævsprøver, herunder 71 tumor prøver af HNSCC og 45 tilstødende normale væv, indsamlet fra forskellige hospitaler i det nordøstlige Indien fra 2009-2013. Patienterne gav deres skriftligt informeret samtykke før indsamlingen af ​​prøverne. Grundlæggende demografiske data som alder, køn, tobak (rygning /tygge) forbrug, kostvaner mv blev indsamlet ved hjælp af et standard spørgeskema.

Etik Statement

Samling, samtykkeerklæring og analyse af vævsprøver blev godkendt af Institutional Komité (IEC), Assam University, Silchar, Assam, Indien.

DNA-ekstraktion

Genomisk DNA blev ekstraheret fra biopsiprøver, kirurgisk udskårne kræft væv, og tilstødende normale væv anvendelse af standard phenol /chloroform-ekstraktion protokol og også af Bioline Isoler Genomisk DNA MINIKIT (Bioline, UK) ved at følge producentens instruktioner. Det ekstraherede DNA blev derefter opløst i TE (10 mM Tris-HCI pH 8,0, 1 mM EDTA) buffer og opbevaret ved -80 ° C til yderligere analyse [40].

HPV detektering

Vævsprøverne blev screenet under anvendelse af sæt af konsensus primere My9 /MY11 til at amplificere HPV L1-genfragmenter, kan der registrerer højrisiko-stammer af HPV [32]. Forstærkning blev udført på 20 gi reaktions- blandinger indeholdende 2X Biomix (Bioline, UK), frem og bak primere, 2 pi prøve og nuklease frit vand. PCR-reaktionsblandingen blev underkastet indledende denaturering ved 94 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 35 cykler ved 94 ° C i 45s, 47 ° C i 1 min og 72 ° C i 1 min. Den endelige udvidelse foregik ved 72 ° C i 10 min. Alle mulige sikkerhedsforanstaltninger, herunder negative kontroller blev taget for at minimere krydskontaminering. PCR-produkterne blev observeret i 2% agarose gel med ethidiumbromidfarvning.

Genetiske polymorfier af kræftfremkaldende metabolizing (

GSTM1

,

GSTT1

CYP1A1

) og DNA-reparation (

XRCC1

XRCC2

) gener

De polymorfier af

CYP1A1

(T3801C),

XRCC1

( Arg399Gln) og

XRCC2

(Arg188His) gener blev analyseret ved polymerasekædereaktion-restriktionsfragmentlængde-polymorfisme (PCR-RFLP) -metoden. Den polymorfe site af

CYP1A1

,

XRCC1

XRCC2

blev opformeret ved hjælp offentliggjorte frem og reverse primere [37, 41] i 20 ul PCR reaktioner. Hver PCR-reaktionsblandingen indeholder 10-100 ng genomisk DNA, 20 pmol af hver primer, 10X reaktionsbuffer, dNTP-blanding,

Pfu

DNA-polymerase, MgCl

2 og nuklease frit vand (NFW). PCR-reaktionsblandingen blev sat med en indledende denaturering ved 94

° C i 5 minutter, efterfulgt af 35 cyklusser af 94

° C til denaturering for 45s, 62

° C /58

° C /60

° C (for

CYP1A1

,

XRCC1

XRCC2

henholdsvis) for 45s til primerannealing og forlængelse ved 72

° C i 1 min. Den endelige udvidelse foregik ved 72

° C i 10 minutter. PCR-produkter af

CYP1A1

,

XRCC1

XRCC2

blev fordøjet separat med restriktionsenzym

MSP1

,

HpaII

HphI

enzymer (New England Biolabs, USA) hhv. De fordøjede produkter blev derefter resolveret på 3% agarosegel for at vurdere størrelsen af ​​PCR-RFLP-produkter [37]. Genotypebestemmelse af

GSTM1

GSTT1

blev gjort ved multiplex-PCR, ved hjælp af

CYP1A1

gen som en intern kontrol, i et samlet volumen på 10 pi reaktionsblanding på 2X Biomix (Bioline, UK) og 10 pmol af hver af den forreste (F) og revers (R) primere (S2 Table). PCR-produkterne blev elektroforeret i 1,5% agarosegel farvet med ethidiumbromid.

Promoter hypermethylering analyse og vurdering af CIMP-status

Promotor methylering status tumor-relaterede gener (

RASSF1

,

DAPK

,

ECAD

,

BRCA1

,

MLH1

,

p16

GSTP1

) og tre methylerede loci (

MINT1

,

MINT2

, og

MINT31

) blev analyseret ved hjælp af methylering Specifikke PCR (MSP) primere (S2 tabel). For MFP assay blev DNA-prøver underkastes modifikation hjælp Imprint1 DNA Modification kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) efter anvisninger som beskrevet af fabrikanten [18]. I denne procedure, er DNA denaturering og bisulfit modifikation udføres samtidigt. Bisulfit reagerer med enkeltstrenget DNA til deaminate cytosin (C) og omdanner ikke-methyleret cytosin (C) til uracil (U) og efterlader 5-methyl-cytosin uændret og dermed skaber forskellige sekvenser for methyleret og umethyleret DNA. Derefter har vi anvendt to forskellige sæt af primere for hvert gen, en specifikt sæt af primere for methyleret DNA og den anden for unmetyhlated DNA. Vi anvendte også DNA fra perifert blod lymfocytter fra sunde individer uden HPV-infektion, som negativ kontrol, og DNA fra perifere blodlymfocytter behandlet med SSSI methyltranferase blev anvendt som positiv kontrol (for methyleret DNA). Alle PCR-reaktionen blev udført i gradient termisk cykliseringsapparat (Applied Biosystems, Inc., CA, USA) og de amplificerede produkter til methyleret og umethyleret DNA blev kørt side om side på agarosegel til sammenligning. I denne undersøgelse blev CIMP panel klassificeres i tre grupper: CIMP-høj (mindst 5 gener /loci methylerede fra 10), CIMP-lav (mindre 5/10 gener /loci methyleret), og CIMP-negative (0/10 gener /loci methyleret). Denne klassificering blev udført på grundlag af de kriterier, der tidligere blev anvendt til CIMP status i andre typer af tumor [19, 42]. Methylering indeks (MI) blev også beregnet for hvert enkelt tilfælde via dividere antallet af denatureret gener /loci med det samlede antal af gen /loci, der undersøges.

Survival analyse

Overlevelse blev beregnet i måneder fra starten af ​​behandlingen til den måned deathusing Kaplan-Meier overlevelseskurver i SPSS-software version 18 (Windows). Dødsfald som følge af sygdomme /andet end kræft komplikation blev bortvist fra studiet. Sammenhængen mellem forskellige karakteristika (HPV, CIMP og klynge) og tilfælde af dødsfald blev analyseret ved hjælp af log-rank (Mantel-Cox) tests.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af SPSS softwareversion 18 og tosidet

P

-værdi 0,05 (to-halet) blev betragtet som statistisk signifikant. Vi brugte Wilcoxon rank-sum test til at sammenligne promotor methylering niveauer af HNSCC tumorprøver og normale prøver, der tillader sammenligning af to grupper af uafhængige prøver [43]. De betydelige værdier blev yderligere justeret for multipel testning af Bonferroni-metoden (

P

-værdien ganget med antallet af sammenligninger). Også, for at styrke sammenhængen mellem forskellige faktorer og CIMP i HNSCC risiko,

P

-værdier blev beregnet efter justering forstyrrende faktorer som alder, køn, HPV, rygning, betel-quid og tobak tygge status som passende. Test for lineære tendens blev også foretaget for flere ordenstal CIMP status. Unsupervised hierarkisk klyngedannelse blev udført ved hjælp af JMP 12 softwarepakke af SAS, der identificerer undergrupper blandt HNSCC patienter baseret på promotor methylering frekvens.

Resultater

Karakteristik af patienter

klinisk-patologisk data af 71 undersøgte HNSCC patienter er opsummeret i tabel 1, omfattede 51 (71,8%) mænd og 20 (28,2%) kvinder med aldersgruppen 23-86 år (77,5% tilhører aldersgruppen 45-86). Af de 71 HNSCC patienter; 38 (53,5%) kræft i mundhulen (herunder kind, base af tungen, tungen, gingivam, og mundslimhinden) 16 (22,6%) havde larynxcancer, 8 (11,2%) havde svælg kræft og 9 (12,7%) havde andet kræft typer i hoved og hals region. Ifølge TMN klassificering, størstedelen af ​​patienterne havde fremskredent stadium (III /IV) (67,3%) ved diagnose. Blandt HNSCC patienter, rygere, betelnødder quid tyggere og tobak chewers var 71,8%, 66,2% og 74,6% hhv.

Frekvensen af ​​promotor hypermethylering i tumor prøver af HNSCC patienter og normale væv

Promotor hypermethylering status for

p16

,

DAPK

,

GSTP1

,

RASSF1

,

BRCA1

,

ECAD

,

MLH1

,

MINT1

,

MINT2

MINT31

gener af 71 HNSCC og 45 normale væv prøver blev vist i tabel 2 . tumorvæv havde meget højere gener /loci hypermethylering frekvens sammenlignet med normale vævsprøver (32,4% vs. 13,3% for

p16

, 29,6% vs. 11,1% for

DAPK

, 18,3% vs. . 8,9% for

BARC1

, 31% vs. 15,6% for

GSTP1

, 32,4% vs. 8,9% for

ECAD

, 50,7% vs. 22,2% for

RASSF1

, 5,6% vs. 2,2% for

MLH1

, 43,7% vs. 13,3% for

MINT1

, 52,1% vs. 11,1% for

MINT2

og 46,5% vs. 17,8% for

MINT31

). Dog blev der observeret signifikant højt hypermethylering i

p16

,

DAPK

,

ECAD

,

RASSF1

,

MINT1

,

MINT2

MINT31 Hotel (

P

= 0,02, 0,02, 0,04, 0,02, 0,01, 0,01, og 0,01 henholdsvis) i HNSCC væv sammenlignet med normale vævsprøver . Methyleringen indeks (MI) (forholdet mellem antallet af methylerede promotorer og samlede antal promotorer, der undersøges) lå mellem 0 0,9 de 71 patienter. Ud af de 71 HNSCC patienter 14 (19,7%) havde 0 (nul) MI, 33 (46,5%) havde MI på 0,1-0,5 og 24 (33,8%) patienter havde MI på 0,6-0,9. HNSCC patienter med forskellige vaner og genetiske profiler blev fundet at udvise differentiel methylering indeks (MI). Mean MI af tobaksvarer chewers /rygere var højere end ikke tyggere /rygere. Tilsvarende patienter med

GSTM1

null,

CYP1A1

CC genotype og HPV (+) vist også højere methylering indeks (figur 1).

Hver kasse plot repræsenterer forskellen methylering indeks blandt rygere /tyggere og ikke rygere /tyggere eller vilde genotype vs. variant genotype eller HPV (MI) (+) vs. HPV (-) HNSCC patienter

Promotor methylering status i HPV. positive (+) og HPV negative (-) HNSCC

i undersøgelsen blev HPV påvist i 37 ud af 71 tilfælde (52,11%) ved hjælp af konsensus primere. Sammenhængen mellem methylering af tumor-relaterede gener og HPV blev opsummeret i tabel 3. Resultater vist, at promotor methylering af

DAPK

,

RASSF1

,

p16

MINT31

var signifikant højere i HPV positive (+) HNSCC patienter sammenlignet med HPV negative (-) patienter (

P

= 0,031, 0,013, 0,031 og 0,015) (figur 2B). En stærkt signifikant sammenhæng blev fundet mellem HPV positive (+) tumorer og CIMP-høj gruppe (

P

= 0,028). Der var imidlertid ingen korrelation mellem CIMP-lav og HPV (+) HNSCC (

P

= 0,477), når man sammenligner med HPV (-). HNSCC tumorer

(A) Kaplan-Meier overlevelse plots: (i) HPV (+) HNSCC tumorer viser bedre overlevelse sammenlignet med HPV (-) tumorer. (Ii) CIMP-høj gruppe af HNSCC tumorer viser dårligere overlevelse i forhold til andre. (Iii) To epigenetiske klynge viste også forskellen overlevelse med cluster-1 havde en dårlig overlevelse. (B) Hyppigheden af ​​promotor-methylering af 10 tumorrelaterede gener /loci i HPV (+) og HPV (-) HNSCC [* P 0,05 (Mantel-Cox log-rank)]. (C) Methylering indeks (MI) i tre CIMP-grupper af HNSCC tumorer.

CIMP i HNSCC tumorvæv

I denne undersøgelse CIMP status blev klassificeret som CIMP -high (fem eller flere methylerede gener), CIMP-lav (mindre end fem methylerede gener) og CIMP-negative (ingen methylerede gener). Af de 71 HNSCC prøver, 39,4% (28/71) var CIMP-høj, 42,3% (30/71) var CIMP-lav og 18,3% (13/71) var CIMP-negative.

Sammenhæng mellem miljøfaktorer og CIMP

Når vi analyserede data om miljømæssige faktorer såsom rygning, betelnødder quid tygge og med CIMP og fundet rygning og tobak tygge havde stærk korrelation med CIMP-høj (

P

= 0,008 og 0,034) sammenlignet med CIMP-negative. Men betelnødder quid tygge havde ingen signifikant korrelation med CIMP-markører. Vi havde heller ikke fundet nogen signifikante forskelle mellem CIMP-lav Vs CIMP-negative og CIMP-høj Vs CIMP-lav i form af tobaksrygning eller tygges (tabel 4).

Sammenhæng mellem genetiske faktorer og CIMP

Vi korreleret også genetisk ændring data for kræftfremkaldende metabolizing (

GSTM1

,

GSTT1

CYP1A1

) og DNA-reparation (

XRCC1

XRCC2

) gener med CIMP paneldata. De CIMP-høje tumorer havde signifikant højere frekvens af

GSTM1

null, sammenlignet med CIMP-lav og CIMP-negative tumorer (

P

= 0,004 og 0,023 henholdsvis). Men der var ingen signifikant sammenhæng mellem

GSTT1

(null),

CYP1A1

(T3801C),

XRCC1

(Arg /Gln) og

XRCC2

(Arg /Hans) variant genotyper og forskellige CIMP markører (tabel 4).

Overlevelse korrelerer med CIMP og HPV

Overlevelse blev undersøgt med hensyn til CIMP markører bruger Kaplan-Meier overlevelseskurver (Fig 2A). Analyse viste, at den samlede median overlevelsestid på 47 patienter ud af 71 var 15 måneder [95% CI = 10,97-19,03], og den mediane overlevelse tid i CIMP-høj, CIMP-lav og CIMP-negative var 11 måneder [95% CI = 7,71-14,28], 18 måneder [95% CI = 13,73 til 22,26] og 19 måneder [95% CI = 5,14 til 32,85], henholdsvis (

P

trend

= 0,011). Igen median overlevelsestid for Cluster-1 og Cluster-2 karakteristik var 13 og 18 måneder, henholdsvis (

P

= 0,026) (S1 tabel). Den CIMP-høj og Cluster-1 var signifikant associeret med ringe overlevelse hos patienter med HNSCC. Betragtninger, overlevelse tid for HPV (+) HNSCC patienter var bedre (17 måneder) end HPV (-) HNSCC patienter (13 måneder) (

P

= 0,041)

Identificerede tumor klynger. og korrelation med miljømæssige, genetiske og epigenetiske egenskaber

i den foreliggende undersøgelse, vi udførte ukontrollerede hierarkisk klyngedannelse og identificeret to klasser eller undergrupper baseret på promoter methylering data om tumor prøver (figur 3). Vi havde konstrueret hierarkiske klynger ved hjælp af syv gener /loci, som efter justering syv gen /loci ud af ti at være væsentligt hypermethyleret. De to identificerede klynger havde tydelige miljømæssige, genetiske og epigenetiske egenskaber og er opsummeret i tabel 5. Frekvensen af ​​rygning (86,2%) og tobak-tygge (89,7%),

GSTM1

null (82,8%) og

CYP1A1

(31,05%),

XRCC1

(27,6%) og

XRCC2

(48,3%) variant genotyper var højere i Cluster-1 i forhold til Cluster-2. Men kun rygning, tobak tygge og

GSTM1

null genotype havde vist statistisk signifikant variation blandt klyngerne (

P

= 0,048, 0,034 og 0,002 henholdsvis). Også hyppigheden af ​​HPV positive (+) HNSCC tumorer var signifikant højere (

P

= 0,009) i Cluster-1 i forhold til Cluster-2. CIMP-høj gruppe (93,1%) er betydeligt højere i af Cluster-1 (

P

0,001) sammenlignet med Cluster-2, hvorimod, Cluster-2 er karakteriseret ved CIMP-lav (66,7%) og CIMP -negative grupper (30,9%)

De forskellige faktorer i heatmap var repræsenteret ved farve variation:. tobak forbrugere, HPV tilstedeværelse og

GSTM1

null,

GSTT1

null (mørk rød farve); tobak ikke-forbrugere og HPV fravær

GSTM1

nuværende og

GSTT1

nuværende (lys gul farve). For

CYP1A1

,

XRCC1

XRCC2

status: vildtype (mørkerød); heterozygot (orange rød) og homozygot variant allel (lys orange) og for CIMP status: CIMP-høj (mørkerød), CIMP-lav (orange rød) og CIMP-negative (lys farve)

diskussion

udvikling og progression af HNSCC er en multi-trins proces moduleres af genetiske, epigenetiske og miljømæssige faktorer [2, 44, 45]. De vigtigste miljømæssige faktorer såsom tobaksrygning og tygge samt HPV-infektion kan føre til en lang række genetiske og epigenetiske procedurer, der fremmer genomisk ustabilitet og godkende tumorudvikling [3, 5, 9]. Promotor hypermethylering profil tumor-relaterede gener var forventet at være afgørende og hyppige i forskellige kræftformer. Mange epigenetiske begivenheder i kræftfremkaldende pathways er blevet studeret for nylig og afslørede fremgangsmåder til påvisning CpG island promotor methyleringsmønster at stratificere højrisikogrupper blandt forskellige cancere [15, 17, 18, 34]. Dette hjælper i påvisning af tidlig debut af kræft, og forudser kliniske resultater. Derfor er det absolut nødvendigt at studere status methylering af et panel af repræsentative gener i HNSCC. Her, i denne undersøgelse, analyserede vi den afvigende promotor methylering profil HNSCC hjælp syv vigtige tumor-relaterede pathway gener (

p16

,

DAPK

,

GSTP1

,

ECAD

,

RASSF1

,

MLH1

BRCA1

) og tre methylerede loci (

MINT1

,

MINT2

og

MINT31

) i den høje kræfttilfælde zone nordøstlige Indien. I vores undersøgelse har vi også korrelere afvigende methylering status patienter med genetiske (polymorfier af

GSTM1

,

GSTT1

,

CYP1A1

,

XRCC1

XRCC2

) og miljømæssig faktor (rygning, betelnødder quid og tobak tygge) samt med overlevelsesdata.

Vi fandt en signifikant højt

p16

,

DAPK

,

ECAD

,

RASSF1

,

MINT1

,

MINT2

MINT31

hypermethylering i HNSCC væv i forhold til normale vævsprøver, der afspejler den mulige involvering af epigenetisk ændring mod udviklingen og progressionen af ​​HNSCC. Vores nuværende undersøgelse havde dækket en bred gruppe af tumor-relaterede pathway gener, herunder

p16

(celle-cyklus kontrol),

DAPK

,

RASSF1

(apoptose),

BRCA1

,

MLH1

(DNA-reparation),

ECAD

(celle-celle adhæsion),

GSTP1

(kræftfremkaldende stofskifte),

MINT1

,

MINT2

MINT31

(methylerede loci i tumorer).

Mange tidligere epigenetiske studier belyst eksistensen af ​​HPV medieret DNA-methylering i HNSCC [46, 47] . Nylig undersøgelse fra det nordøstlige Indien ved hjælp af et panel af 10 gener, forklarede rolle HPV og tobak i tilblivelsen af ​​UADT kræft [32]. Men vi yderligere analyseret hypermethylering af individuelle gener /loci særskilt i HPV (+) og HPV (-) sager. Vi fandt promotor methylering af

DAPK

,

s

16,

RASSF1

og

MINT31

var signifikant associeret med HPV (+) tumorer i HNSCC. Derfor HPV syntes at være en forårsagende middel for ændringer af CpG ø metylering af tumor-undertrykkende gener i HNSCC. Generelt er HPV (+) HNSCC forbundet med en mere gunstig overlevelse [9], vores undersøgelse også undersøgt HPV (+) patienter af HNSCC havde bedre overlevelsesrate sammenlignet med HPV (-). Patienter afspejler en mulig rolle i prognosen

i mange cancertyper, især i colorektal cancer, CpG Island Methylator fænotype (CIMP) blev anvendt til at identificere klinisk og patologisk relevante undergrupper af tumorer. Toyota et al. indført CpG island methylator fænotype (CIMP) at klassificere kræft baseret på status for methylering af et panel af gener [21]. I kolorektal cancer, CIMP tumorer havde tydelige epidemiologiske karakteristika, mikrosatellit instabilitet (MSI) profil BRAF mutationer og overlevelse, sammenlignet med ikke-CIMP tumorer [48, 49]. CIMPs er blevet rapporteret for en række cancersygdomme, herunder øvre aerodigestive tarmkanalen (UADT) [32], oral cancer [50], og øsofageal pladecellecarcinom [51] og brystkræft [19]. Det er dog kun én undersøgelse var der i HNSCC, der forklarer CIMP i undergruppen af ​​HPV (+) tumor HNSCC [33]. Den hypermethylering profil genpromotorer er forskelligartet for hver type kræft, og også den påvisningsmetoden og flere valg gen for CIMP-panel varierer mellem studierne. Baseret på hypermethyleringen mønster af 10 tumorrelaterede gener /loci, vi klassificeret HNSCC i tre grupper: CIMP-høje, CIMP-lav og CIMP-negative. Vi observerede distinkte karakteristika tumor inden for CIMP-høje og CIMP-negative grupper. Frekvensen af ​​rygning, tobak tygge og

GSTM1

null genotyper af patienterne var signifikant højere i CIMP-høje grupper i forhold til CIMP-negative. Genetiske og miljømæssige karakteristika kan direkte til CIMP karakteristika HNSCC tumorer. Vi observerede også en hældning dårlig overlevelse i CIMP-høje tumorer i forhold til CIMP-negative gruppe; indikerer CIMP-høj kan være en indikator for en dårlig prognose for HNSCC i det nordøstlige indiske befolkning. Det er måske ikke uventet, at vi har fundet korrelationer mellem CIMP-høj og patienten dårligt resultat, hvis vi sammenlignet vores data på CIMP og overlevelse i HNSCC med andre tidligere beskrevne cancere [52, 53]. En dyb forståelse af CIMP kan tillade udformningen af ​​bedre behandlingsmuligheder strategier for HNSCC.

Epigenetisk gruppering af HNSCC patienter blev udført på grundlag af DNA methylering profiler i tumor vævsprøver. Hierarkisk klyngeanalyse identificeret to forskellige undergrupper, én undergruppe af HNSCC patienter med høj frekvens af rygning, tobak tygge vaner,

GSTM1

null og

CYP1A1

(CC) variant genotype. Klyngen-1 også karakteriseret ved HPV (+) tilfælde, og indeholdt CIMP-høj gruppe, hvilket afspejler en mulig sammenhæng mellem DNA methylering og genetiske og miljømæssige faktorer i HPV associeret HNSCC. Således kan epigenetisk og langs med genetisk ændring med en kombination af miljømæssige faktorer også spiller en rolle i en delmængde af HNSCC. I vores tidligere undersøgelse, fandt vi stærkt samspil mellem kræftfremkaldende metabolizing gener (

GSTM1

GSTT1

) og miljømæssige faktorer i HNSCC [2]. Samspillet af fase-I (

CYP1A1

) og fase-II (

GSTM1

GSTT1

) tobak kræftfremkaldende stoffer metaboliserende gener kan belyse ophobning af den større mængde af giftige stoffer i kroppen, der kan spille den største del under udviklingen af ​​HNSCC. Også en af ​​vores andre undersøgelse udforskede samspillet mellem (

XRCC1

og

XRCC2

) tobak og DNA-reparation gen polymorfier og krydstale mellem disse to DNA reparation gener mod modtagelighed HNSCC [37] . Nylig undersøgelse fra Tahara et al. [39] fundet sammenhæng mellem

GSTM1

null genotype og øget følsomhed over for CpG hypermethylering, men de fandt nedsat følsomhed over for CpG hypermethylering af

DAPK

gen med

XRCC1

codon 399 Gln