PLoS ONE: Kombination af Quercetin og 2-Methoxyestradiol Forbedrer inhibering af human prostatacancer LNCaP og PC-3 Cells xenograft Tumor Growth

Abstrakt

Quercetin og 2-Methoxyestradiol (2-ME) er lovende anti-cancer stoffer. Vores tidligere

in vitro

undersøgelse viste, at quercetin synergieffekt med 2-Methoxyestradiol udviser forøget antiproliferativ og proapoptotiske aktivitet i begge androgenafhængige LNCaP og androgen-uafhængige PC-3 human prostatacancer-cellelinier. I den foreliggende undersøgelse, vi stilling til, om deres kombination kunne hæmme LNCaP og PC-3 xenograft tumorvækst

in vivo

og udforskede den underliggende mekanisme. Human prostatacancer LNCaP og PC-3-celler blev inokuleret subkutant i BALB /c nøgne mus. Når xenotransplantattumorer nået omkring 100 mm

3, mus tilfældigt tildelt køretøj kontrol, quercetin eller 2-Methoxyestradiol enkeltvis behandlede og kombinationen behandlingsgrupper. Efter terapeutisk intervention i 4 uger, kombinationsbehandling af quercetin og 2-ME i) signifikant inhiberede prostatakræft xenotransplantat tumorvækst med 46,8% for LNCaP og 51,3% for PC-3 sammenlignet med vehikel kontrolgruppen, mere effektiv end quercetin (28,4% for LNCaP, 24,8% for PC3) eller 2-ME (32,1% for LNCaP, 28,9% for PC3) alene; ii) var veltolereret af BALB /c mus og ingen tydelige toksiske reaktioner blev observeret; iii) førte til højere Bax /Bcl-2-forhold, spaltet caspase-3-protein-ekspression og apoptose rate; og iv) resulterede i lavere phosphoryleret AKT (Pakt) proteinniveauet, vaskulær endotel vækstfaktor-protein og mRNA-ekspression, mikrovaskulær densitet og proliferationshastighed end enkelt lægemiddelbehandling. Disse virkninger var mere bemærkelsesværdigt i forhold til køretøjets gruppe. Derfor kombination af quercetin og 2-ME kan tjene som en ny klinisk behandlingsprogram eje potentialet til forøgelse antitumorvirkning på prostatakræft

in vivo

og mindske dosis og bivirkninger af enten quercetin eller 2-ME alene . Disse

in vivo

resultater vil lægge et yderligere solidt grundlag for efterfølgende undersøgelser på denne roman terapeutiske regime i human prostatacancer

Henvisning:. Yang F, Song L, Wang H, Wang J, Xu Z, Xing N (2015) Kombination af Quercetin og 2-Methoxyestradiol Forbedrer inhibering af human prostatacancer LNCaP og PC-3 Cells xenotransplantat tumorvækst. PLoS ONE 10 (5): e0128277. doi: 10,1371 /journal.pone.0128277

Academic Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italien

Modtaget: 9. december 2014 Accepteret: April 23, 2015; Udgivet: May 26, 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:.. arbejdet blev støttet af Beijing Natural Science Foundation (. nr 7.122.075)

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den anden hyppigste dødsårsag kræft hos mænd, med en anslået 233.000 nye tilfælde og 29,480 dødsfald i USA i 2014 [1]. Selv om det kan blive helbredt ved radikal prostatektomi eller strålebehandling på et tidligt tidspunkt, vil de fleste patienter lider lokalt recidiv og fjernmetastaser senere [2]. Efter effektiv behandling af androgen ablation i de første 1-3 år, det generelt udvikler sig til kastrationsresistent prostatacancer (CRPC), kendetegnet med forhøjet prostataspecifikt antigen (PSA), højere metastase sats, mere aggressivitet, etc [3]. Kombination af docetaxel og prednison, standard first-line systemisk kemoterapi for CRPC, er ikke helbredende, og kun forlænger den samlede overlevelsestid for en kort periode. Desuden gør patienterne lider af alvorlige bivirkninger [4]. Derfor er det af presserende behov for at udvikle nye lægemidler behandlingsformer, der kan overvinde disse mangler arbejder enkeltvis eller i kombination for CRPC.

Quercetin (3, 3 ‘, 4’, 5, 7-pentahydroxyflavone, Que), et bioaktivt flavonoid rigelige i grøntsager og frugter, især i løg, æbler, te og rødvin, har udvist lovende antitumor-egenskab i mange humane cancerceller, herunder prostatacancer både in vitro og in vivo [5,6]. Men på grund af lav biotilgængelighed, har sin antitumorvirkning blevet begrænset til en stor udstrækning,. For at overvinde denne mangel har quercetin blevet kombineret med andre anticancerlægemidler kan forbedre inhibering af forskellige tumorer, herunder prostatacancer [6,7,8].

2-Methoxyestradiol (2-ME), en naturlige endogene derivat af 17β-østradiol (E2) sjældent udviser østrogenaktivitet, er blevet rapporteret at påvise anti-cancer handling i en lang række tumorer [9]. Med hensyn til prostatacancer, 2-ME kan inhibere både androgen-afhængige og androgen-uafhængige cancerceller in vitro og in vivo [10,11]. Alligevel 2-ME har den ulempe begrænset biologisk tilgængelighed og hurtig nedbrydning [12]. Således at løse problemet, er lægemiddelkombination blevet foreslået og vakte forøget anti-cancer virkning med færre bivirkninger sammenlignet med enkelt behandling lægemiddel [10,13].

På trods den fælles ulempe ved lav biotilgængelighed for både quercetin og 2-ME, forekommer optimistiske, når de blev kombineret med andre stoffer grund behandlede cancer virkning. Vi har tidligere gennemført en kombineret anvendelse af quercetin og 2-ME i begge androgenafhængige LNCaP og androgen-uafhængige PC-3 human prostatacancer-cellelinier og fundet en synergistisk antiproliferativ og proapoptotiske virkning sammenlignet med quercetin eller 2-ME alene [14] . Den foreliggende undersøgelse var at undersøge den samlede virkning af quercetin og 2-ME på LNCaP og PC-3 xenograft tumor in vivo og studere den mekanisme for første gang.

Materialer og metoder

Kemisk reagenser

Quercetin, 2-Methoxyestradiol, hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPpCD) og carboxymethylcellulose (CMC) blev købt hos Sigma (St. Louis, MO, USA). RPMI-1640 medium, blev 0,25% trypsin-EDTA og kalvefosterserum fik fra Hyclone (Logan, UT, USA), og Matrigel var fra BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA).

cellelinier og celledyrkning

human prostatacancer androgenafhængig LNCaP og androgen-uafhængige PC-3-cellelinjer (to almindeligt anvendte cellelinier, som er blevet brugt af mange andre forskere [15,16,17]), opnået fra Peking Union Medical College, blev dyrket i RPMI-1640-medium (Hyclone, Logan, UT) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Hyclone) og anbragt i inkubator indeholdende 95% luft og 5% CO

2 ved 37 ° C.

Animal undersøgelse

Alle eksperiment procedurer i forbindelse med dyr blev godkendt af udvalget dyreforsøg og Etik Udvalg Capital Medical University (Permit nummer: 2013-X-83). BALB /c nøgne mus 4-6 uger gamle blev leveret af ministeriet for forsøgsdyr af Capital Medical University og holdes i patogen frit miljø med 12-timers lys /mørke cyklus, kontrolleret fugtighed og temperatur. Mus fik lov til at vænne sig til nye omgivelser i en uge før påbegyndelse af forsøget.

Før den formelle in vivo forsøg, vi evaluerede giftigheden af ​​to kombinerede lægemidler og køretøj, der ville blive administreres samtidigt ved hjælp af to grupper af mandlige BALB /c nøgne mus (n = 5 hver). Opløsningsmiddel til quercetin var 25% hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPpCD, vægt /vol i ddH

2O) og for 2-Methoxyestradiol var 25% HPpCD indeholdende 0,5% carboxymethylcellulose (CMC, vægt /vol i ddH

2O ) [10,18]. Drug gruppe fik de to lægemidler, nemlig opløst quercetin og 2-ME, og vehikelkontrolgruppe fik to stoffri køretøjer, nemlig 25% HPpCD indeholder eller ikke indeholder 0,5% CMC. Efter operationen blev toksisk reaktion observeret i mus af begge grupper repræsenteret dårlig mental tilstand, let vride kroppen, kramper og lejlighedsvis moderat hæmaturi, der var i overensstemmelse med beskrivelsen af ​​Ehteda A og kan tilskrives høj koncentration af HPpCD [10 ]. Af denne grund i den efterfølgende eksperiment, en kombination af quercetin og 2-ME blev udført på denne måde: quercetin blev givet på dag 1, efterfulgt af 2-ME givet på dag 2.

Mus blev inokuleret subkutant med 5 × 10

5 PC-3 celler suspenderet i 100 pi PBS og 2 × 10

8 LNCaP celler suspenderet i 100 pi matrigel og PBS blanding (1: 1) på højre back. Når xenotransplantattumorer nåede et volumen på ca. 100 mm

3, mus blev randomiseret til fire grupper (n = 8 hver gruppe) og behandlet intraperitonealt. Terapeutisk tidsplan baseret på vores in vitro-resultater, indledende forsøg og mange andre forskeres studier var som følger: (1) Køretøjets kontrolgruppen: køretøj af quercetin på dag 1, køretøj af 2-ME på dag 2, (2) Quercetin behandlede gruppe : quercetin 75 mg /kg på dag 1, køretøj af 2-ME på dag 2, (3) 2-ME behandlede gruppe: køretøj af quercetin på dag 1, 2-ME 150 mg /kg på dag 2, (4) gruppe Kombinationsbehandling : quercetin 75mg /kg på dag 1, 2-ME 150 mg /kg på dag 2. To dage var en behandlingscyklus og hele behandlingsprocessen varede i 4 uger [13,19,20,21,22,23]. Tumorstørrelser blev overvåget hver 2 dage under anvendelse af skydelære og tumorvolumen blev beregnet efter formlen: L × S

2 × 0,5, hvori L betegner den længste diameter og S repræsenterer den korteste diameter af tumor [10]. Mus blev vejet samt. Ved afslutningen af ​​proceduren behandling, på dag 29 blev mus bedøvet med chloralhydrat og aflivet ved cervikal dislokation. Xenotransplantattumorer blev udtaget hurtigt og vejes. En del af det blev sat i flydende nitrogen straks til fremtidig biomarkør analyse og den anden side blev fikseret i 10% neutral bufferet formalin til immunhistokemisk analyse. Der blev også påvist Serum biokemiske parametre som ALT, AST, kreatinin og urea kvælstof, der afspejlede lægemiddeltoksicitet.

Western blot-analyse

tumorvæv blev blandet med RIPA Lysis buffer (Applygen Inc., Beijing , Kina) indeholdende protease inhibitor cocktail (Roche, Schweiz). Lysater blev centrifugeret, og supernatanten blev opsamlet. Efter kvantificeret ved anvendelse BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, USA), 80 ug protein blev separeret med 6% -12% SDS-PAGE og overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membran (Pall, NY, USA) som derefter blev blokeret af 5% fedtfri mælk og inkuberet med primære antistoffer: Bcl-2 (1: 1000, Cell Signaling, Beverly, MA), Bax (1: 1000, Cell Signaling), Caspase-3 (1: 1000, Cell Signaling), AKT og Pakt (1: 1000, Cell Signaling), VEGF (1: 500, Abcam) ved 4 ° C natten over, GAPDH (1: 10000, Sigma) ved stuetemperatur i 1 time, efterfulgt af peberrodsperoxidase konjugeret sekundære antistoffer (1: 2000 Cell Signaling) inkubation i yderligere 1 time ved stuetemperatur. Antigen-antistof-kompleks bånd blev detekteret ved forøget kemiluminescens-kit (ECL-Plus, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). GAPDH blev anvendt som indlæsning kontrol.

Revers transkription-kvantitativ realtids polymerasekædereaktion (RT-qPCR)

Totalt RNA af tumorvæv blev ekstraheret ved anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, USA) og først -streng cDNA blev syntetiseret under anvendelse Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Tyskland) med oligo- (dT) -primere. Sekvenser af VEGF og p-actin-primere var som følger: Humant VEGF: Forward: 5′-TCTACCTCCACCATGCCAAGT-3 ‘, revers: 5′-GATGATTCTGCCC TCCTCCTT-3’. β-actin: Fremad: 5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3 ‘, omvendt: 5’GTGGCCAT CTCTTGCTCGAA-3’. Nøjagtigheden af ​​PCR-produkter blev verificeret ved DNA-sekventering.

I alt 20 uL reaktionsblandingen bestod af 10 uL SYBR green PCR Master Mix (Applied Biosystems), 8 uL Hedeselskabet

2O, 1 pi cDNA skabelon og 1 pi primere reagerede efter de termiske cyklusbetingelser: en cyklus ved 50 ° C i 2 minutter efterfulgt af 95 ° C i 10 minutter, 40 cykler ved 95 ° C i 20 sekunder og 60 ° C i 1 minut, hver prøve var i tre eksemplarer (VIIA 7 real Time PCR System, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). VEGF mRNA-niveau blev beregnet efter den 2

-. (ΔΔCt) metode og derefter normaliseret til p-actin udtryk

Immunhistokemi

tumorvæv blev først fikseret i 10% neutral bufferet formalin . Efter paraffin blev fjernet under anvendelse xylen serie blev objektglassene rehydreret med ethanol serie og inkuberet med 3% H

2O

2 for at eliminere endogen peroxidaseaktivitet. Efter antigen-genvinding blev objektglassene inkuberet med primært antistof CD31 (1:50, Abcam), CD34 (1: 100, Abcam), caspase-3 (1: 500, Cell Signaling) og Ki67 (1: 500, Abcam) ved 4 ° C natten over. Snittene blev vasket med PBS 3 gange og inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (1: 100, Cell Signaling) i 30 minutter ved stuetemperatur. Signaler blev visualiseret ved diaminobenzidin reaktion og modfarvet med hæmatoxylin. Antal CD31, CD34 farvede skibe og caspase-3 blev Ki67 positive celler analyseret fra 3 tilfældige høj effekt inden for hvert dias. Sektioner med primært antistof fraværende og den samme koncentration af sekundært antistof tjente som negativ kontrol.

Statistisk analyse

Eksperiment data blev udtrykt som middel ± SD. SPSS 17.0 og Sigma Plot 10.0 blev brugt til statistisk analyse og plot. Sammenligninger mellem behandlede grupper og kontrol køretøj blev udført ved hjælp af Uafhængige-Samples T Test. P-værdi 0,05 blev anset for at være signifikant forskellige.

Resultater

Kombination af quercetin og 2-ME øget hæmning af prostatakræft xenograft tumorvækst

Male BALB /c nøgne mus med PC -3 og LNCaP-celler xenotransplantattumorer blev behandlet med vehikel, Que eller 2-ME og deres kombination, og proceduren varede i 4 uger. Når tumorer blev taget ud, var det indlysende, at både PC-3 og LNCaP xenotransplantattumorer i Que eller 2-ME behandlingsgruppen var mindre end kontrol, og hæmningen var mere bemærkelsesværdig i Que og 2-ME co-behandlingsgruppe (fig 1A og 2A). PC-3 xenograft tumorer i Que blev 2-ME og kombinationsterapi grupper inhiberet med 24,8%, 28,9% og 51,3% sammenlignet med vehikelkontrol (fig 1B og 1C), og for LNCaP, inhiberingshastigheden var 28,4%, 32,1 % og 46,8% (fig 2B og 2C). Under hele indgriben processen, Que, 2-ME og deres kombination blev godt tolereret af mus ved den valgte dosis, vægttab i de tre behandlingsgrupper var ikke signifikant forskellig fra kontrol (Fig 1D og 2D). Der var ingen forskel i den daglige mad og vandforbrug mellem grupper. Andre giftige reaktion relateret til narkotika og køretøjer såsom dårlig metal tilstand blev hæmaturi ikke observeret. Signifikante forskelle blev ikke fundet i serum biokemiske parametre såsom ALT, AST, kreatinin og urea kvælstof, der afspejler lægemiddeltoksicitet på lever og nyrer mellem før og efter behandling.

(A) PC-3 xenotransplantattumorer var mindre i Que eller 2-ME behandlingsgruppen end vehikelkontrol, og inhiberingen var mere bemærkelsesværdigt i Que og 2-ME co-behandlingsgruppe. Tumorvægt (B) og tumorvolumen (C) blev reduceret betydeligt ved kombinationsterapi, mere indlysende end Que eller 2-ME alene. Der var ingen signifikant forskel i muse vægt mellem grupper (D). Data er repræsenteret som middelværdi ± SD. * P 0,05 sammenlignet med kontrol, # P 0,05 angiver en signifikant forskel mellem kombinationsbehandling gruppe og quercetin behandlede gruppe, ※ P 0,05 angiver en signifikant forskel mellem kombinationsbehandling gruppe og 2-ME behandlede gruppe

.

(A) LNCaP xenotransplantattumorer var mindre i Que eller 2-ME behandlingsgruppen end kontrol køretøj, og hæmningen var mere bemærkelsesværdig i kombination behandlingsgruppe. Que og 2-ME kombinationsterapi reduceret tumorvægt (B) og tumorvolumen (C) spænder, mere effektiv end Que eller 2-ME alene. blev ikke observeret nogen væsentlig indflydelse på mus vægt mellem grupperne (D). Data er repræsenteret som middelværdi ± SD. * P 0,05 sammenlignet med kontrol, # P 0,05 angiver en signifikant forskel mellem kombinationsbehandling gruppe og quercetin behandlede gruppe, ※ P 0,05 angiver en signifikant forskel mellem kombinationsbehandling gruppe og 2-ME behandlede gruppe

.

Virkning af quercetin med 2-ME kombinationsbehandling på Bax og Bcl-2-protein-ekspression

Western blot viste, at kombinationen af ​​Que og 2-ME forøget induktion af apoptose ved at regulere proapoptotiske protein Bax og anti-apoptotisk protein Bcl-2-ekspression. Som figur 3A viser, Bax steget og Bcl-2 faldt i enkelte eller kombinerede lægemiddel behandlede grupper af både PC-3 og LNCaP xenograft tumorvæv. Virkning af induceret apoptose blev bestemt ved forholdet Bax /Bcl-2, som blev forøget i Que eller 2-ME behandlede gruppe sammenlignet med kontrol, og kombineret terapi førte til en yderligere stigning (figur 3B og 3C).

(A) Western blot detekteret Bax og Bcl-2-protein-ekspression. (B, C) blev Bax /Bcl-2-forhold repræsenteret som middelværdi ± SD (gennemsnit i tre eksemplarer). * P 0,05 sammenlignet med ubehandlet kontrol # P 0,05 angiver en signifikant forskel mellem kombination behandlingsgruppe og quercetin behandlede gruppe, ※ P 0,05 angiver en signifikant forskel mellem kombinationsbehandling gruppe og 2-ME behandlede gruppe

Virkning af quercetin med 2-ME kombinationsbehandling på forholdet mellem spaltede caspase-3 /caspase-3

Virkning af quercetin og 2-ME på spaltet caspase-3 /caspase-3-forhold blev bestemt ved Western blot. Som vist i fig 4A og 4B, spaltet caspase-3 /caspase-3-forhold forhøjet i quercetin eller 2-ME behandlede PC-3 tumorvæv og denne virkning var mere indlysende i co-behandlingsgruppe. Det samme fænomen blev observeret i LNCaP tumorvæv (figur 4A og 4C).

(A) Western blot detekteres spaltet caspase-3 og caspase-3-protein-ekspression. (B, C) spaltet caspase-3 /caspase-3-forhold blev repræsenteret som middelværdi ± SD (gennemsnit i tre eksemplarer). * P 0,05 sammenlignet med ubehandlet kontrol # P 0,05 angiver en signifikant forskel mellem kombination behandlingsgruppe og quercetin behandlede gruppe, ※ P 0,05 angiver en signifikant forskel mellem kombinationsbehandling gruppe og 2-ME behandlede gruppe

Virkning af quercetin med 2-ME kombinationsbehandling på tumorproliferation (Ki67) og apoptose (caspase-3)

Immunhistokemisk analyse viste, at proliferationshastighed af PC-3 og LNCaP tumorvæv blev reduceret med 36,2 % og 44,5% i co-behandlingsgrupper sammenlignet med kontrol (p 0,05 og 0,01 henholdsvis), mere indlysende end quercetin (22,6% for PC-3, 27,3% for LNCaP) og 2-ME (26,7% for PC-3 , 32% for LNCaP) alene (fig 5A-5C). Mens quercetin eller 2-ME enkelt behandling i høj grad øget caspase-3 positive celler (quercetin: 1,35 gange til pc-3, 1,77 gange for LNCaP 2-ME:. 1.8 fold til PC-3, 1,95 gange for LNCaP sammenlignet med kontrol) , co-behandling resulterede i flere caspase-3 positive celler (2,43 gange til PC-3, 2,56 fold for LNCaP, sammenlignet med kontrol) (p 0,01) (fig 5D-5F). Disse resultater indikerede, at quercetin kombineret med 2-ME inhiberede proliferation og fremmes apoptose af både PC-3 og LNCaP tumorvæv i højere grad.

(A, D) Immunohistokemisk detektion viste Ki67 og caspase-3-positive celler i både PC-3 og LNCaP xenograft tumor. Antal Ki67 (B, C) og caspase-3 (E, F) positive celler var repræsenteret som middelværdi ± SD, nummer var fra tre tilfældige højt powered felter pr glideren (lysmikroskopi, HPF, 400 ×). * P 0,05 sammenlignet med kontrol, # P 0,05 angiver en signifikant forskel mellem kombinationsbehandling gruppe og quercetin behandlede gruppe, ※ P 0,05 angiver en signifikant forskel mellem kombinationsbehandling gruppe og 2-ME behandlede gruppe

.

Virkning af quercetin med 2-ME kombinationsbehandling på phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /AKT signalvej

Western blot viste, at der var ingen signifikant forskel i AKT-proteinekspression mellem grupperne i både PC-3 og LNCaP-xenograft tumorvæv (figur 6A, 6D og 6E). Betragtninger, blev Pakt protein i høj grad faldt i monoterapi grupper sammenlignet med vehikel behandlede gruppe og hæmningen var meget mere bemærkelsesværdig i quercetin og 2-ME kombination behandlede gruppe (figur 6A-6C).

(A) Pakt og AKT proteinekspression blev undersøgt ved western blot. Værdier af Pakt (B, C) og AKT (D, E) var repræsenteret som middelværdi ± SD (værdier fra tre uafhængige forsøg). * P 0,05 sammenlignet med ubehandlet kontrol # P 0,05 angiver en signifikant forskel mellem kombination behandlingsgruppe og quercetin behandlede gruppe, ※ P 0,05 angiver en signifikant forskel mellem kombinationsbehandling gruppe og 2-ME behandlede gruppe

Virkning af quercetin og 2-ME kombineret behandling på VEGF-proteinet og mRNA-ekspression

af fig 7A-7C, kunne det ses, at kombinationen af ​​quercetin og 2-ME signifikant reduceret VEGF proteinekspression i forhold til individuel behandling, som igen udviste stærkere hæmning end vehikelkontrol. Som for VEGF-mRNA, Q-PCR viste et lavere niveau i individuel terapi grupper end kontrol, og undertrykkende virkning blev yderligere forstærket i co-behandlingsgruppe uanset i PC-3 eller LNCaP tumorvæv (p 0,01) (Fig 7D og 7E ).

VEGF protein (A) og mRNA (D, E) ekspression blev undersøgt ved Western blot og kvantitativ realtids-PCR. Værdier af VEGF-proteinet (B, C) og mRNA (D, E) var repræsenteret som middelværdi ± SD (værdier fra tre uafhængige forsøg). * P 0,05 sammenlignet med ubehandlet kontrol # P 0,05 angiver en signifikant forskel mellem kombination behandlingsgruppe og quercetin behandlede gruppe, ※ P 0,05 angiver en signifikant forskel mellem kombinationsbehandling gruppe og 2-ME behandlede gruppe

effekt af quercetin med 2-ME kombinationsbehandling på mikrokardannelse tæthed

Hæmning effekt på mikrokardannelse tæthed repræsenteret af CD31 og CD34 i PC-3 og LNCaP xenograft tumorvæv af quercetin og 2-ME blev yderligere undersøgt ved immunhistokemi. I PC-3 tumorvæv kombineret behandling resulterede i en bemærkelsesværdig reduktion af CD31 og CD34 (60.87% og 56,1% henholdsvis) ekspression i sammenligning med vehikelbehandlede gruppe (P 0,01), mens den reducerer hastigheden var 26,09% for CD31, 39.02 % for CD34 i quercetin anvendt gruppe og 43.38% for CD31, 36,59% for CD34 i 2-ME anvendte gruppe (fig 8A, 8B, 8D og 8E). I LNCaP-tumorvæv blev CD31 og CD34 faldt med 50% og 49,09% i kombination behandlingsgruppen sammenlignet med vehikelkontrol (P 0,01), og på samme tid, quercetin eller 2-ME alene også medført nedregulering af CD31 og CD34 (Quercetin: 27,45% for CD31, 30% for CD34 2-ME:. 29,41% for CD31, 32,73% for CD34). (fig 8A, 8C, 8D og 8F)

(A, D) immunhistokemisk undersøgelse udviste CD31 og CD34 positive kar i både PC-3 og LNCaP-xenograft tumorvæv. Antal CD31 (B, C) og CD34 (E, F) positive skibe blev repræsenteret som middelværdi ± SD, nummer var fra tre tilfældige høje powered felter pr slide (lysmikroskopi, HPF, 400 ×). * P 0,05 sammenlignet med kontrol, # P 0,05 angiver en signifikant forskel mellem kombinationsbehandling gruppe og quercetin behandlede gruppe, ※ P 0,05 angiver en signifikant forskel mellem kombinationsbehandling gruppe og 2-ME behandlede gruppe

.

diskussion og konklusioner

med den øgede forekomst og dødelighed af prostatakræft og er baseret på den nuværende ugunstige situation for kastrationsresistent prostatacancer (CRPC) behandling [1,4], har narkotika kombination tiltrukket stor opmærksomhed på grund af fordelen ved forøget anti-cancer virkning, mindre lægemiddeldosis, reducerede bivirkninger, etc. Heri efter vores tidligere in vitro-forskning [14], vi har foretaget en undersøgelse for at kombinere quercetin med 2-ME til at handle på human prostatacancer LNCaP og PC-3 xenograft tumor i BALB /c nøgne mus og fandt, at kombineret anvendelse forbedret inhibering af xenograft tumorvækst, som blev tilskrevet induktion af apoptose, inhibering af phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt signalvej og angiogenese.

Quercetin og 2-ME er lovende anti-prostata cancer stoffer. Som et enkelt middel, er quercetin blevet verificeret at hæmme prostatakræft vækst både in vitro og in vivo [5,6]. Vores tidligere undersøgelse viste også, at quercetin inhiberede væksten LNCaP-celler via nedregulering af androgen receptor og dens inducerbare gener [24]. Hvad mere er, quercetin er af meget lav toksicitet og sjældent frembringer nogen bivirkninger selv ved høj dosis på 200 mg /kg givet til rotter og SCID-mus [19,20] og kliniske forsøg viste, at det samlede forbrug af 1000mg quercetin per dag kunne være veltolereret i menneskelig ikke forbundet med nogen bivirkninger [25,26]. 2-ME også hæmmet vækst af prostata kræftceller og xenograft tumor ikke producerer hæmatologiske toksiciteter som andre MTA’er [10,11,13]. Høj dosis på 150 mg /kg for dyr i prækliniske stier [13] og 1000 mg eller 1500 mg oralt fire gange dagligt til human in fase I og II forsøg kunne godt tolereret uden nogen åbenlyse toksiske virkninger [27,28].

på trods af disse inspirerende resultater for prostatacancer, quercetin og 2-ME har begge den ulempe, lav biotilgængelighed, som indregner deres anti-prostatacancer virkning. Derfor er de blevet kombineret med andre midler, for eksempel, quercetin med grøn te, kosten phytoestrogens og tamoxifen [6,20,29,30], 2-ME med albendazol, docetaxel og eugenol [10,13,31], og alle viste forøget anti-prostatakræft effekt selv ved lav dosis, som i høj grad gale op den utilstrækkelige biotilgængelighed. Chang et al rapporterede, at kombinationen af ​​quercetin og 2-ME øget cytotoksisk virkning på hepatocellulært carcinom (HCC) celler i sammenligning med quercetin eller 2-ME alene [32]. Det spekuleres, at samtidig anvendelse af quercetin og 2-ME ville skabe større anti-prostatacancer effekt med mere sikkerhed og mindre toksicitet. Vores tidligere in vitro forsøg viste, at kombineret anvendelse af quercetin og 2-ME udviste synergistisk inhibering af proliferation og induktion af apoptose i både androgenafhængige LNCaP og androgen-uafhængige PC-3 humane prostatacancer-cellelinier i sammenligning med enkelt lægemiddel, og det blev tilskrevet standse cellecyklus og faldende Bcl-2 /Bax-forhold [14]. Men det er uvist om in vivo virkning på prostatacancer og in vitro resultater kan ikke anvendes direkte på kliniske. Derfor har vi kombineret quercetin med 2-ME til at handle på LNCaP og PC3 xenograft tumor og fandt, at kombinationsbehandlingen inhiberede xenotransplantat tumorvækst med 46,8% for LNCaP og 51,3% for PC3 sammenlignet med vehikelkontrol, mere effektiv end quercetin (28,4% for LNCaP, 24,8% for PC3) eller 2-ME (32,1% for LNCaP, 28,9% for PC3) alene. Desuden blev de veltolereret og ingen indlysende toksisk reaktion blev observeret i hele behandlingsprocessen. Det kontrolleres, at kombinationen af ​​quercetin og 2-ME kunne hæmme prostatakræft vækst in vivo i en større grad med mere effektivitet og sikkerhed.

Målrettet terapi har været anset for afgørende for kemoterapeutiske effekt af naturlige produkter og fytokemikalier [33 ]. Quercetin og 2-ME kan virke på nogle signalveje fører til effektivt at inhibere prostatakræft vækst især når de kombineres.

Bcl-2 familie proteiner, herunder antiapoptotisk Bcl-2 og proapoptotiske Bax, er vigtig mediator af mitokondrie apoptose pathway. Aktiveret Bax hjælper anden mitokondrier afledt aktivator af caspase (Smac) og cytochrom-c-frigivelse, som derved aktiverer caspase-3 ind spaltet caspase-3 fører til celle apoptose, mens antiapoptotisk protein Bcl-2 forhindrer Bax-aktivering ved binding og binding det lade cancerceller flygte fra apoptose [30,34]. Således Bax /Bcl-2-forhold og niveauet af spaltet caspase-3 indikerer det terapeutiske respons og er meget vigtige i apoptoseinduktion [33]. Quercetin steg Bax /Bcl-2-forhold med 1,3-fold af androgen-sensitive LAPC-4 prostatacancercelle xenograft tumor [6]. Kumar et al rapporterede, at quercetin terapi signifikant forøget Bax /Bcl-2-forhold og caspase-3-aktivitet i PC-3-celler [30]. 2-ME inhiberede proliferation og apoptose af LNCaP og PC3-celler in vitro og in vivo gennem phosphorylering af Bcl-2 [35,36]. Vores foreliggende undersøgelse viste, at quercetin og 2-ME anvendes alene øgede proapoptotiske protein Bax, nedsat antiapoptotisk protein Bcl-2 og forhøjede Bax /Bcl-2-forhold derved fører til caspase-3-aktivering, som igen induceret apoptose og hæmmede xenograft tumorvækst. Disse resultater blev yderligere bekræftet ved immunohistokemisk analyse af caspase-3 og Ki67-positive celler. Desuden blev alle disse virkninger forøget ved kombination af quercetin og 2-ME resulterer i tumor inhibering i højere grad.

AKT, en serin /threoninproteinkinase tilhører PI3K /AKT overlevelse pathway, spiller en vigtig rolle i celle overlevelse og apoptose, når den aktiveres til phosphoryleret AKT (Pakt). Pakt opreguleres og spiller en vigtig rolle i overlevelse og proliferation af humane prostatacancerceller [37]. Højt Pakt er beslægtet med høj kvalitet og høj Gleason score på prostata tumorer og tjener som en uafhængig prædiktor for biokemisk recidiv [38]. Derfor har AKT blevet betragtet som et lovende terapeutisk mål for prostatacancer. Kim et al viste, at quercetin reduceret Pakt protein lette trail induceret apoptose i LNCaP og DU145 cellelinier [39]. Lee et al viste, at quercetin reduceret Pakt niveau resulterer i suppression af phosphoryleret Bad og påvirke forholdet mellem Bd-XL og Bax, som derefter øget aktivitet af Bax og endelig ført til LNCaP-apoptose [40]. 2-ME sensibiliseret PC-3-celler til fas medieret apoptose via hæmning af Pakt [41]. I vort eksperiment, quercetin og 2-ME kan henholdsvis formindsket Pakt proteinekspression i både LNCaP og PC-3 xenograft tumorvæv, men Pakt faldt meget mere indlysende, når kombinationsbehandlingen blev anvendt. Gennem hæmning af Pakt signal vej, blev tumorvækst undertrykt mere effektivt.

Angiogenese refererer til generering af nye blodkar fra allerede eksisterende vaskulære system sikrer tumorer for at opnå tilstrækkelig ilt og næringsstoffer og reguleres af mange angiogene faktorer, blandt hvilke vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) er den mest afgørende on [42]. Anticancerlægemidler kan inhibere angiogenese ved nedregulering VEGF hvorigennem tumorvækst inhiberes. Pratheeshkumar et al fandt, at quercetin reduceret VEGF-niveauer i PC-3-celler og inhiberede blodkarsdannelse både in vitro og in vivo. På denne måde blev PC-3-celler og xenotransplantattumorer inhiberede [43]. Quercetin også signifikant reduceret VEGF-sekretion i LNCaP-celler [44]. Mabjeesh et al belyst, at 2-ME bemærkelsesværdigt formindsket VEGF-niveau på en dosisafhængig måde i PC-3-celler, og derefter angiogenese og tumorvækst blev inhiberet [45].