PLoS ONE: en højere frekvens af CD14 + CD169 + monocytter /makrofager i patienter med kolorektal Cancer

Abstrakt

Målsætning

monocytter og makrofager kan infiltrere tumor mikromiljø og regulere udviklingen af ​​tumorer. Denne undersøgelse har til formål at bestemme hyppigheden af ​​forskellige delmængder af cirkulerende monocytter og tumor infiltrerer makrofager (Tims) hos patienter med colorectal cancer (CRC).

Metoder

Hyppigheden af ​​forskellige delgrupper i cirkulerende monocytter blev karakteriseret i 46 CRC-patienter og 22 raske kontroller (HC) ved flowcytometri. Hyppigheden af ​​forskellige delmængder af makrofager blev analyseret i Tims fra 30 tumorvæv og i lamina propria mononukleære celler (LPMCs) fra 12 ikke-tumorvæv. Koncentrationerne af plasma cytokiner og carcinoembryonisk antigen (CEA) blev bestemt. Den potentielle sammenslutning af disse foranstaltninger med værdierne af kliniske parametre blev analyseret.

Resultater

I sammenligning med den i HC, de procentsatser af cirkulerende CD14

+ CD169

+ , CD14

+ CD169

+ CD163

+ og CD14

+ CD169

+ CD206

+ monocytter og Tims CD14

+ CD169

+ samt IL 10

+ CD14

+ CD169

+, men ikke IL-12

+ CD14

+ CD169

+ makrofager var væsentligt forøget, ledsaget af højere niveauer af plasma-IL-10 i CRC patienter. De procentdele af CD14

+ CD169

+ cirkulerende monocytter og TIM makrofager blev forbundet med den fase af sygdommen, og korreleret positivt med niveauerne af plasma IL-10 og CEA i CRC patienter.

Konklusion

Vores data tyder på, at en stigning i hyppigheden af ​​CD14

+ CD169

+ -celler kan være forbundet med udviklingen og progressionen af ​​CRC og er samtidig stigning af begge, pro-tumor (M2-lignende , IL-10 producerende) og anti-tumor (M1-lignende, IL-12 producerende) monocytter og infiltrerende makrofager. Hyppigheden af ​​CD14

+ CD169

+ cirkulerende monocytter og infiltrerende makrofager kan tjene som en biomarkør til evaluering af patogene grader af CRC

Henvisning:. Li C, Luo X, Lin Y, Tang X , Ling L, Wang L, et al. (2015) en højere frekvens af CD14

+ CD169

+ monocytter /makrofager i patienter med kolorektal cancer. PLoS ONE 10 (10): e0141817. doi: 10,1371 /journal.pone.0141817

Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN

Modtaget: Maj 22, 2015; Accepteret: 13. oktober 2015; Udgivet: 28 Oktober 2015

Copyright: © 2015 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:.. forfatterne modtaget nogen specifik finansiering til dette arbejde

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de mest udbredte maligne tumorer med en høj dødelighed. Dens forekomst er stigende i mange lande, og CRC påvirker 1,2 millioner mennesker om året i verden [1]. Tidligere undersøgelser har vist, at udviklingen og progressionen af ​​CRC er forbundet med lokal inflammation [2-5]. Faktisk forskellige typer af inflammatoriske infiltrater, især til makrofager, er til stede i CRC væv og balancen mellem protumor og anti inflammatoriske infiltrater menes at være kritisk for udviklingen, progression og invasion af CRC [3-4, 6]. Derfor vil illustration af forskellige typer af inflammatoriske infiltrater og deres potentielle funktioner være af stor betydning i forståelsen af ​​patogenesen af ​​CRC.

makrofager, som professionelle antigenpræsenterende celler (APC’er) i det medfødte immunsystem, er de mest rigelige immun cellepopulation i tumormikromiljøet [7, 8], og spiller afgørende roller i reguleringen vævshomeostase og immunstatus. Makrofager i tarmen væv kan være fra deres selvfornyelse [9] og kan også stamme fra migrering af monocytter til tarmens lamina propria, vedligeholdelse gut homeostase [10, 11]. Makrofager kan klassisk aktiveres til M1-celler, der udtrykker inducerbare salpetersyre oxidase (iNOS), IL-12 og høje niveauer af co-stimulator-molekyler, mens hjemmehørende vævsmakrofager og tumorassocierede makrofager sandsynligvis vil udtrykke CD163, 206, arginase og IL-10 , en M2 fænotype [12-17]. Endvidere makrofager, ligesom deres parentale monocytter, udtrykke CD14, en co-receptor for TLR4, som har været almindeligt anvendt til at identificere makrofager og monocytter fra tarmslimhinden og perifert blod [18, 19]. Monocytter og tumorinfiltrerende makrofager (TIM) udtrykker også CD169, sialoadhesin, et celleadhæsionsmolekyle [20] og MAC387, en markør for umodne makrofager [21]. CD169

+ makrofager er vigtige aktører i initiering og progression af inflammatoriske og autoimmune sygdomme [22]. Endvidere har CD169

+ makrofager og monocytter været anset for at dominere pro-inflammation immunitet [22-25]. Tidligere undersøgelser har vist, at M2-celler i tumoren miljø er forbundet med progression og metastase af cancer [15, 26-27]. Desuden er CD169

+ makrofager i regionale lymfeknuder associeret med en god prognose i CRC patienter [28]. Men hvilken type makrofager i tumoren miljø er forbundet med progressionen af ​​CRC forbliver kontroversiel. Det er blevet bekræftet, at CD169

+ makrofager exit i colon lamina propria, hovedsagelig omgiver krypterne og deres udvikling er understøttet af vitamin A i mus [29]. Hyppigheden af ​​cirkulerende CD169

+ monocytter og tumor infiltrerer makrofager i CRC og deres potentielle tilknytning til udviklingen af ​​CRC er ikke blevet klarlagt.

I den aktuelle undersøgelse, vi karakteriserede hyppigheden af ​​forskellige delmængder af CD14

+ CD169

+ -celler i cirkulerende monocytter og i tims ved flowcytometri og detekterede niveauerne af plasma-IL-10 og IL-12 samt carcinoembryonisk antigen (CEA) i CRC patienter. Derudover analyserede vi den potentielle sammenslutning af de procentdele af cirkulerende CD14

+ CD169

+ monocytter og Tims med niveauerne af cytokiner og CEA samt de kliniske parametre i CRC patienter. Vi fandt signifikant øget procentdele af CD14

+ CD169

+ i både cirkulerende monocytter og Tims af CRC patienter. Desuden procentdele af CD14

+ CD169

+ cirkulerende monocytter og Tims var forbundet positivt med de patogene stadier af CRC og korreleret med niveauerne af plasma IL-10 og CEA i CRC patienter. Således støtter vores data opfattelsen af, at en forøget i hyppigheden af ​​CD14

+ CD169

+ celler kan være forbundet med udviklingen og progressionen af ​​CRC og er samtidig stigning af både pro-tumor (M2-lignende, IL -10 producerende) samt anti-tumor (M1-lignende, IL-12 producerende) monocytter og tumorinfiltrerende makrofager.

Materialer og metoder

Fag og prøver

Den skriftlige informerede samtykke blev opnået fra de enkelte deltagere. Den eksperimentelle protokol blev oprettet i henhold til retningslinjerne i Helsinki-deklarationen og blev godkendt af menneskelige etiske komité i Jilin Universitet (Jilin University, Changchun, Kina). I alt 46 patienter med CRC blev rekrutteret i døgnbehandling tjeneste af Institut for kolorektal Anal kirurgi, blev det første hospital, Jilin Universitet i perioden februar 2013 til december 2014. Enkelte patienter diagnosticeret af positiv fækal okkult blodprøve, histologisk undersøgelse på biopsi tumorvæv opnået under koloskopi, og en computertomografi (CT) scanning. Individuelle tumor prøver blev evalueret for deres tumor klassificering, histologiske kvaliteter, og lymfeknude metastaser status ved patologer i et blindet måde og iscenesat ifølge tumor-node-metastaser (TNM) klassifikationssystem for International Union mod Kræft (Edition 7) [ ,,,0],30]. For lagdeling analyse, patienter med stadium I /II i CRC blev behandlet på tidligt tidspunkt, mens dem med stadium III /IV i CRC blev behandlet på fremskredent stadium. Enkelte patienter blev ekskluderet, hvis hun /han fik strålebehandling, kemoterapi eller immunterapi. Desuden blev patienterne også udelukket, hvis hun /han havde dårlig fysisk tilstand. Yderligere 22 aldersrelaterede og køn-matchede raske forsøgspersoner og 12 ikke-tumor fag blev rekrutteret på fysisk undersøgelse Center og en anden afdeling af samme hospital. Alle deltagere havde ingen historie af kræft, autoimmune sygdomme, seneste infektionssygdomme, inflammatoriske tarmsygdomme og familiær polypose. Blodprøver blev opnået fra 46 nye onset CRC patienter og 22 raske kontroller (HC). Kirurgiske kolorektal resektion vævsprøver blev opnået fra 30 CRC patienter og 12 ikke-tumor kontrol, som gennemgik kirurgisk resektion af blandede hæmorider. Inflammation kan være forbundet med udviklingen af ​​hæmorider. Imidlertid har en tidligere undersøgelse identificeret, hæmorider synes ikke at være forbundet med en øget risiko for anal cancer [31], og arten af ​​inflammation mellem miljøer i CRC og hæmorider er anderledes. Det er rimeligt at anvende disse væv som ikke-tumor kontrol i vores undersøgelse. De demografiske og kliniske data for de enkelte deltagere blev indsamlet fra sygehusjournaler og gennemgået af erfarne kirurger. Deres demografiske og kliniske karakteristika er vist i tabel 1.

Isolering af mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er)

Fastende venøse blodprøver blev indsamlet fra de enkelte deltagere, og en portion af blod blev anvendt til fremstilling af mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er) ved densitetsgradient centrifugering under anvendelse af Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare). De resterende Blodprøverne blev centrifugeret til fremstilling plasmaprøver.

Isolering af lamina propria mononukleære celler (LPMCs) og Tims

lamina propria mononukleære celler (LPMCs) blev isoleret fra dem 12 ikke-tumor patienter og TIMS blev isoleret fra 30 frisk resektion kirurgiske tumorprøver, som tidligere beskrevet med mindre modifikation [29, 32]. Kort fortalt blev frisk reseceret slimhinde eller CRC væv behandlet inden for 30 minutter efter opsamling og inkuberet i calcium- og magnesium-fri Hanks balancerede saltopløsning (HBSS, Sigma-Aldrich) indeholdende 2,5% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS) og 1 mM dithiothreitol (Sigma-Aldrich) på is. Vævene blev inkuberet i calcium- og magnesium-fri HBSS buffer indeholdende 5 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 2,5% varmeinaktiveret FBS, 0,1% volumen /volumen β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) ved 37 ° i 25 minutter under konstant omrøring for at fjerne slim og epitelceller. Efterfølgende blev de resterende segmenter skåret i små stykker og fordøjet med 250 ug /ml DNAse (Roche) og 125 ug /ml liberaseTM (Roche) i HBSS ved 37 ° i 30 minutter under konstant omrøring. Efter centrifugering blev cellerne resuspenderet med RPMI-1640 og filtreres gennem en 40 uM cellefilter, efterfulgt af pålæsning på overfladen af ​​Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare). Efter centrifugering ved 800 g i 20 min, blev LPMCs og Tims genvundet fra grænsefladen og vaskes med PBS to gange for flowcytometri.

Flowcytometrianalyse

For at bestemme hyppigheden af ​​forskellige delmængder af CD14

+ celler, PBMC’er eller LPMCs (10

6 celler /rør) blev farvet med Alexa Fluor 647-anti-CD169 (Biolegend), APC-H7-anti-CD14 (BD PharMingen), BV421-anti- CD163 (BD ​​PharMingen) og PerCP-Cy5.5-anti-CD206 (Biolegend) ved 4 ° C i 30 minutter henholdsvis. Efterfølgende blev cellerne fikseret, og permeabiliseret under anvendelse af permeabilisering opløsning (BD Biosciences), efterfulgt af intracellulær farvning med FITC-konjugeret anti-MAC387 (Abcam).

lipopolysaccharid (LPS) kan aktivere monocytter eller makrofager ved at interagere med TLR4 og CD14 og inducere genereringen af ​​cytokiner såsom IL-6, IL-10 og IL-12 [33-34]. At påvise funktion, PBMC’er eller LPMCs (10

6 celler /brønd) blev stimuleret in duplo med 50 ng /ml lipopolysaccharid (LPS) og phorbolmyristatacetat (PMA) og 1,0 ug /ml ionomycin (Sigma-Aldrich ) i 10% FBS RPMI-1640 medium ved 37 ° C i 2 timer i 5% CO

2 og udsat for Brefeldin A (GolgiPlug; BD Biosciences) i yderligere 4 timer, som tidligere beskrevet i vores laboratorium (21). Efter at være blevet vasket, blev farvet med Alexa Fluor 647-anti-CD169, APC-H7-anti-CD14, fikseret og permeabiliseret under anvendelse af permeabilisering opløsningen efterfulgt af intracellulær farvning med PE-CF594-anti-IL-10 (JES3-9D7 , BD Biosciences) eller PE-anti-IL-12 (BD PharMingen). De matchede mus isotypekontroller af APC-H7-IgG1, FITC-IgG1, PE-Ig2a, PerCP-Cy5.5-IgG1, PE-CF594-IgG1 og AlexaFluor-IgG1 tjente som kontrollerne. De mononukleare celler blev gated ifølge cellestørrelse og interne struktur. For bedre at skelne positive fra negative population, udførte vi Fluorescens Minus One (FMO), hvorved blev cellerne inkuberet med alle de fluorochromer undtagen den, der blev målt (CD14, CD169, CD163). Hyppigheden af ​​forskellige delgrupper i CD14

+ mononukleære celler blev bestemt ved flowcytometri analyse på en BD FACSCalibur (Becton Dickinson), og data blev analyseret ved hjælp FlowJo 7.6.2 software.

enzymmaerket assay (ELISA)

koncentrationerne af plasma IL-10 og IL-12p70 i enkelte deltagere blev bestemt ved ELISA under anvendelse af humane IL-10 og IL-12p70 ELISA kits, ifølge producenternes instruktion (R 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Karakterisering af cirkulerende CD14

+ CD169

+ monocytter i CRC patienter

for at bestemme de potentielle roller cirkulerende CD14

+ CD169

+ monocytter i udviklingen af ​​CRC, en gruppe af CRC patienter og alder og køn-matchede HC blev rekrutteret. Som vist i tabel 1, var der ingen signifikant forskel i fordelingen af ​​alder og køn, antallet af WBC og monocytter mellem patienter og HC. Endvidere var der ingen signifikant forskel i tumoren placering og deres differentielle kvaliteter mellem patienter med tidlig og fremskreden CRC. Som forventet patienterne viste signifikant højere niveauer af plasma CEA end HC (P 0,05).

tidligere undersøgelse har vist, at CD14

+ monocytter repræsenterer 80-90% af den samlede cirkulerende monocytter [35] . CD14

+, CD169

+ og CD163

+ -celler blev gated ifølge tilsvarende isotypekontroller og FMO kontroller (S1 Fig). Vi analyserede hyppigheden af ​​forskellige undersæt af cirkulerende CD14

+ CD169

+ monocytter fra CRC patienter og HC ved flowcytometri (fig 1A og 1B). Kvantitativ analyse viste, at procentdelen af ​​cirkulerende CD14

+ CD169

+ monocytter fra patienterne var væsentligt højere end fra HC (18,21% vs. 1,42%, P 0,0001, Fig 1C). Derfor signifikant øget procenter af cirkulerende CD14

+ CD169

+ monocytter eksisterede i CRC patienter.

Perifere mononukleære blodceller (PBMC’er) blev indhentet fra de enkelte fag og farvet med anti-CD14 og anti CD169. Hyppigheden af ​​cirkulerende CD14

+ CD169

+ monocytter blev karakteriseret ved flowcytometri. Cellerne blev gated i første omgang på mononukleære celler og derefter på CD14

+ celler. Efterfølgende procentdele af CD14

+ CD169

+ monocytter blev bestemt. For at karakterisere forskellige delmængder af CD14

+ CD169

+ monocytter, blev PBMC’er farves med fluorescerende antistoffer mod CD14, CD169 og CD163, CD206 eller MAC387. Cellerne blev gated på CD14

+ CD169

+ monocytter og de procentdele af CD14

+ CD169

+ CD163

+, CD14

+ CD169

+ CD206

+ og CD14

+ CD169

+ MAC387

+ makrofager blev bestemt. Data er repræsentative diagrammer af flowcytometri og udtrykkes som værdier enkelte fag. De vandrette linjer angiver medianen for enkelte grupper. (A) Flowcytometrianalyse af CD14

+ CD169

+ monocytter /makrofager. (B) Flowcytometri analyse af forskellige delmængder af cirkulerende CD14

+ CD169

+ monocytter /makrofager. (C) De procentdele af CD14

+ CD169

+ monocytter. (D) Hyppigheden af ​​CD14

+ CD169

+ CD163

+ makrofager. (E) Hyppigheden af ​​CD14

+ CD169

+ CD206

+ makrofager. (F) Hyppigheden af ​​CD14

+ CD169

+ MAC387

+ makrofager.

Yderligere karakterisering viste, at procentdelen af ​​CD14

+ CD169

+ CD163

+ -celler i alt cirkulerende CD14

+ CD169

+ monocytter fra CRC patienter var signifikant højere end i HC (74,27% versus 60,14%, P 0,0001, figur 1D). Desuden hyppigheden af ​​cirkulerende CD14

+ CD169

+ CD206

+ monocytter i alt cirkulerende CD14

+ CD169

+ monocytter fra CRC patienter var også signifikant højere end i HC (3,35% vs. 0,82%, P 0,0001, fig 1E). I modsætning hertil procentdele af cirkulerende CD14

+ CD169

+ MAC387

+ monocytter i alt cirkulerende CD14

+ CD169

+ monocytter i CRC patienter var lavere end i HC (76,31% vs. 80,15%, P = 0,0041, figur 1F). Kollektivt, CRC patienter viste en ubalance af forskellige delgrupper i cirkulerende CD14

+ CD169

+ monocytter.

Analyse af CD14

+ CD169

+ makrofager i kolorektale neoplasmer

Perifere monocytter migrere ind organer og væv til at regulere inflammation. For at forstå betydningen af ​​forskellige delgrupper i CD14

+ CD169

+ makrofager i udviklingen af ​​CRC, de procentdele af forskellige delgrupper i CD14

+ CD169

+ makrofager i LPMCs fra 12 ikke-tumor patienter og i Tims fra 30 CRC patienter blev analyseret ved flowcytometri (fig 2A). Skønt tidligere undersøgelser har vist, at makrofager i tarmen lamina propria kan udtrykke forskellige niveauer af CD14 [18, 36], en del af CD14

+ makrofager blev præsenteret i lamina propria (S1 Fig A) og vi fokuserede på denne population af intestinale makrofager. Den CD14

+, CD169

+ og CD163

+ celler i LPMCs eller Tims blev gated ifølge FMO kontroller i S1 Fig. De procentdele af CD14

+ CD169

+ makrofager i Tims var væsentligt højere end i LPMCs af ikke-tumor patienter (25,36% mod 1,83%, P 0,0001, Fig 2B). Derudover analyserede vi de procentdele af CD14

+ CD169

+ CD163

+ eller CD14

+ CD169

+ CD206

+ celler i LPMCs eller Tims ved flowcytometri (fig 2C) . De procentdele af CD14

+ CD169

+ CD163

+ eller CD14

+ CD169

+ CD206

+ makrofager i Tims var væsentligt højere end i LPMCs (78,05% vs. 64,21 %, P 0,0001; 3,85% vs. 1,63%, P 0,0001, fig 2D og 2E). Interessant, vi har registreret også væsentligt højere procenter af CD14

+ CD169

+ CD163

+ eller CD14

+ CD169

+ CD206

+ makrofager i Tims end i cirkulerende monocytter af CRC patienter (data ikke vist), hvilket antyder, at perifert blod CD14

+ CD169

+ monocytter kan migrere ind i lamina propria og blev M2-lignende celler.

i alt 30 friske kirurgiske CRC tumorvæv var spaltet til karakterisering af tumorinfiltrerende makrofager (Tims). Desuden blev 12 lamina propria væv fra ikke-tumor patienter fordøjet til karakterisering af makrofager i total lamina propria mononukleære celler (LPMCs). Efterfølgende blev cellerne farvet med anti-CD14, CD169 og CD163 eller CD206. Hyppigheden af ​​CD14

+ CD169

+, CD14

+ CD169

+ CD163

+ og CD14

+ CD169

+ CD206

+ makrofager i LPMCs og Tims blev bestemt ved flowcytometri. Data er repræsentative diagrammer eller udtrykkes som værdien af ​​de enkelte fag. De vandrette linjer angiver medianen for enkelte grupper. (A) Flowcytometrianalyse af CD14

+ CD169

+ i LPMCs og Tims. (B) De procentdele af CD14

+ CD169

+ makrofager i LPMCs og Tims. (C) Flowcytometrianalyse af CD14

+ CD169

+ CD163

+ og CD14

+ CD169

+ CD206

+ makrofager i alt CD14

+ CD169

+ LPMCs og Tims makrofager. (D) Hyppigheden af ​​CD14

+ CD169

+ CD163

+ makrofager i LPMCs og Tims. (E) Hyppigheden af ​​CD14

+ CD169

+ CD206

+ makrofager i LPMCs og Tims.

En højere frekvens af IL-10

+ CD14

+ CD169

+ monocytter og makrofager i CRC patienter Salg

Tidligere undersøgelser har vist, at IL-10

+ M2-celler er forbundet med udviklingen af ​​CRC [26, 37-38]. For at bestemme funktionen af ​​cirkulerende CD14

+ CD169

+ monocytter og Tims blev de isolerede celler stimuleret in vitro og procentdelene af IL-10

+ eller IL-12

+ CD14

+ CD169

+ cirkulerende monocytter og Tims blev bestemt ved flowcytometri (fig 3A). Procenterne af IL-10

+ CD14

+ CD169

+ cirkulerende monocytter og Tims i alt CD14

+ CD169

+ celler fra CRC patienter var signifikant højere end fra den ikke-tumor forsøgspersoner (3,79% vs. 0,76%, P 0,0001 til cirkulation monocytter, 7,12% vs. 1,23%, P. 0,0001 for Tims fig 3B). I modsætning hertil var der ingen signifikant forskel i hyppigheden af ​​IL-12

+ CD14

+ CD169

+ cirkulerende monocytter og Tims mellem CRC patienter og ikke-tumor forsøgspersoner (0,24% versus 0,22%, P = 0,2854 for cirkulerende monocytter, 0,37% vs. 0,36%, P = 0,4729 for Tims fig 3C).. Yderligere analyse af CD14

+ CD169

– celler afslørede der ingen signifikant forskel i hyppigheden af ​​IL-10

+ eller IL-12

+ CD14

+ CD169

– celler i alt CD14

+ CD169

– celler mellem CRC patienter og ikke-tumor emner i denne population (IL-10: 0,017% vs. 0,024%, P = 0,6428 for cirkulerende monocytter, 0,018% vs. 0,014% , P = 0,8125 for TIMS; IL-12: 0,019% vs. 0,013%, P = 0,1628 for cirkulerende monocytter, 0,015% versus 0,013%, P = 0,8678 for Tims S2 fig).. Vigtigere de procentdele af CD14

+ CD169

+ IL-10

+ celler blev korreleret positivt med procentdele af CD14

+ CD169

+ cirkulerende monocytter og Tims i CRC patienter (R = 0,5375, P = 0,0001 for cirkulerende monocytter; R = 0,5637, P = 0,0009 for Tims, fig 3D og 3E). Derfor CRC patienter viste en højere frekvens af IL-10

+ CD14

+ CD169

+ makrofager.

PBMC’er og Tims blev isoleret fra enkelte fag og stimuleret med LPS og PMA /ionomycin . Cellerne blev farvet med anti-CD169 og anti-CD14 i 30 minutter, fikseret og permeabiliseret, efterfulgt af intracellulær farvning med anti-IL-10 eller anti-IL-12. Cellerne blev først gated på CD14

+ CD169

+ celler og de procentdele af CD14

+ CD169

+ IL-12

+ M1 og CD14

+ CD169

+ IL-10

+ M2 celler i PBMC’er eller Tims fra enkelte fag blev bestemt ved flowcytometri. Niveauerne af plasma IL-10 og IL-12 i enkelte fag blev bestemt ved ELISA. Data er repræsentative diagrammer eller udtrykkes som værdien af ​​de enkelte patienter. De vandrette linjer angiver medianen for enkelte grupper. (A) Flowcytometrianalyse. (B) De procentdele af CD14

+ CD169

+ IL-10

+ M2 celler. (C) De procentdele af CD14

+ CD169

+ IL-12

+ M1 celler. De vandrette linjer angiver median værdier. (D) Den potentielle associering mellem De procentdele af cirkulerende CD14

+ CD169

+ IL-10

+ celler og CD14

+ CD169

+ celler i CRC patienter. (E) Den potentielle associering mellem De procentdele af Tims CD14

+ CD169

+ IL-10

+ celler og CD14

+ CD169

+ celler i CRC væv. (F) Niveauerne af plasma IL-10. (G) Niveauerne af plasma-IL-12. (H) Korrelationen af ​​plasma IL-10 niveauer med procentdele af CD14

+ CD169

+ IL-10

+ monocytter i PBMC’er fra CRC patienter. (I) Sammenhængen mellem niveauerne af plasma IL-10 og CEA i CRC patienter.

Vi målte koncentrationerne af plasma IL-10 og IL-12 i enkelte fag ved ELISA. Som vist i fig 3F og 3G, koncentrationerne af plasma-IL-10, men ikke IL-12, i CRC patienter var signifikant højere end i HC (P 0,0001). Koncentrationerne af plasma IL-10 var korreleret positivt med de procentsatser af cirkulerende IL-10

+ CD14

+ CD169

+ monocytter (R = 0,6018, P 0,0001, Fig 3H) og niveauerne af plasma CEA i CRC patienter (R = 0,413, P = 0,0043, fig 3I).

lagdeling analyser af frekvensen af ​​CD14

+ CD169

+ monocytter og makrofager i CRC patienter

Dernæst vi stratificeret patienterne, i henhold til deres tumor patologisk TNM etaper, og vi fandt, at de procentdele af CD14

+ CD169

+ cirkulerende monocytter var signifikant lavere hos de patienter med tidlige fase af CRC end dem med fremskreden fase af CRC (11,81% versus 15,91%, P = 00003, fig 4A). Tilsvarende de procentdele af CD14

+ CD169

+ makrofager i Tims fra patienter med tidligt i CRC var væsentligt lavere end i dem med fremskredent stadium af CRC (22,45% mod 26,93%, P 0,0001, fig 4A). Desuden procentdele af CD14

+ CD169

+ cirkulerende monocytter fra patienter med enten tidligt eller fremskredent stadium af CRC var betydeligt lavere end det i Tims fra den samme gruppe af patienter (P 0,00001, P 0,0001 henholdsvis, fig 4A). De procentdele af CD14

+ CD169

+ cirkulerende monocytter var positivt korreleret med procentdele af CD14

+ CD169

+ makrofager i Tims fra patienter med tidlig (R = 0,4361, P = 0,0073. Fig 4B) eller fremskreden (R = 0,8191, P = 0.0001.Fig 4C) i CRC.

CRC patienter blev stratificeret så tidligt (i /II, n = 21) eller fremskreden (III /IV, n = 25) og de procentdele af CD14

+ CD169

+ cirkulerende monocytter og Tims i de enkelte patienter blev analyseret. Endvidere den potentielle sammenhæng mellem de procentdele af CD14

+ CD169

+ cirkulerende monocytter eller Tims og niveauet for plasma CEA i individuelle grupper af patienter blev analyseret,. Data er gennemsnittet af individuelle emner. (A) Procentdelen af ​​CD14

+ CD169

+ monocytter i PBMC’er (n = 21 for tidligt, n = 25 for fremskredent stadium af CRC patienter) og procentdele af CD14

+ CD169

+ makrofager i Tims fra tidligt (n = 14) eller avanceret (n = 16) etape af CRC patienter. De vandrette linjer angiver medianen for enkelte grupper. (B) Sammenhængen mellem de procentdele af CD14

+ CD169

+ cirkulerende monocytter og Tims i tidligt i CRC patienter. (C) Sammenhængen mellem de procentdele af CD14

+ CD169

+ cirkulerende monocytter og Tims i fremskredent stadium af CRC patienter. (D) Sammenhængen mellem niveauerne af plasma CEA og procentdele af CD14

+ CD169

+ cirkulerende monocytter i CRC patienter. (E) Sammenhængen mellem niveauerne af plasma CEA og procentdele af CD14

+ CD169

+ Tims i CRC patienter.

Niveauerne af plasma CEA forblive en værdifuld biomarkør for evaluering af CRC progression [39]. Således har vi undersøgt den potentielle sammenhæng mellem de procentdele af CD14

+ CD169

+ cirkulerende monocytter og Tims med niveauet af plasma CEA i CRC patienter. Vi fandt, at niveauerne af plasma CEA blev korreleret positivt med procentdele af CD14

+ CD169

+ cirkulerende monocytter (R = 0,7655, P 0,0001, Fig 4D) og CD14

+ CD169

+ makrofager i Tims (R = 0,5768, P = 0,0009, fig 4E) i CRC patienter. Sammen procentdele af CD14

+ CD169

+ cirkulerende monocytter og Tims var positivt associeret med de patologiske stadier af CRC i denne population af patienter.

Diskussion

For at vurdere markør potentiale CD14

+ CD169

+ celler i den patogene progression af CRC, vi undersøgte fænotype og kliniske relevans af cirkulerende CD14

+ CD169

+ monocytter og Tims i CRC patienter. Vores data viste, at cirkulerende CD14

+ CD169

+ M2-lignende monocytter og Tims akkumuleret i neoplasmer og korrelerede med niveauerne af plasma-IL-10 og CEA i CRC patienter. Det er klart, blev frekvensen af ​​CD14

+ CD169

+ cirkulerende monocytter og Tims forbundet med de patogene stadier af CRC. Så vidt vi ved, var dette den første rapport, der signifikant højere procentdele af cirkulerende CD14

+ CD169

+ M2-lignende monocytter eller Tims var forbundet med patogene progression af CRC i mennesker.

Inflammatoriske infiltrater i tumor mikromiljø er afgørende for udviklingen og metastase af tumorer [7, 8]. Tidligere undersøgelser har vist, at alternativt aktiverede makrofager M2 kan deltage i den patogene proces med forskellige typer af faste tumorer ved at fremme angiogenese og metastase og hæmmende antitumoraktivitet [16, 40-41]. I denne undersøgelse, vi har registreret en signifikant højere frekvens af cirkulerende og tumor infiltrerer CD14

+ CD169

+ CD163

+ og CD14

+ CD163

+ CD206

+ M2-lignende makrofager i CRC patienter. Disse resultater tyder på, at perifere monocytter kan migrere ind tumorvæv og regulere tumorvækst og immunitet. De procentdele af CD14

+ CD169

+ cirkulerende monocytter og Tims hos patienter med fremskreden fase af CRC var væsentligt højere end dem med tidligt i CRC. Disse data yderligere vist, at frekvensen af ​​CD14

+ CD169

+ cirkulerende monocytter og Tims var forbundet med de patogene grader af CRC. Vores data udvidet tidligere bemærkninger om inflammatorisk sygdom og foreslå, at CD169

+ kan udtrykkes af makrofager i tumorvæv [23-25, 42]. Faktisk er der påvist CD169

+ makrofager i normal colon lamina propria [29]. Da CD169 er et adhæsionsmolekyle det muligt, at CD14

+ CD169

+ cirkulerende monocytter kan migrere og blive aktiveret i tumoren miljø til at regulere progression og metastase af CRC. Vores resultater var forskellige fra en tidligere observation, at CD169

+ makrofager i regionale lymfeknuder var forbundet med en gunstig prognose i CRC patienter [28].