PLoS ONE: 8-chlor-Cyklisk AMP og proteinkinase A I-Selective Cyklisk AMP analoger inhiberer cancercellevækst gennem forskellige Mechanisms

abstrakt

Cyklisk AMP (cAMP) inhiberer proliferation af flere tumorceller. Vi har tidligere rapporteret en antiproliferativ effekt af PKA I-selektive cAMP-analoger (8-PIP-cAMP og 8-HA-cAMP) på to human cancer cellelinjer af forskellig oprindelse. 8-CI-cAMP, en anden cAMP-analog med kendte antiproliferative egenskaber, er blevet undersøgt som et potentielt anticancerlægemiddel. Her har vi sammenlignet det antiproliferativ virkning af 8-CI-cAMP og PKA I-selektive cAMP-analoger i tre menneskelige kræftceller (ARO, NPA og WRO). 8-CI-cAMP og PKA I-selektive cAMP-analoger havde tilsvarende potente antiproliferative virkninger på BRAF-positive ARO og NPA celler, men ikke på BRAF-negative WRO celler, hvor kun 8-CI-cAMP konsekvent inhiberede cellevækst . Mens behandlingen med PKA I-selektive cAMP-analoger blev associeret med vækststandsning, 8-CI-cAMP induceret apoptose. For yderligere at undersøge handlinger 8-CI-lejren og PKA I-selektive cAMP-analoger, vi analyserede deres virkninger på signalveje involveret i celledeling og apoptose. Interessant, PKA I-selektive cAMP-analoger, men ikke 8-CI-cAMP, inhiberede ERK-phosphorylering, mens 8-CI-cAMP alene inducerede en progressiv phosphorylering af p38 mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK), via aktivering af AMPK ved dets metabolit 8-CI-adenosin. Vigtigt er det, kan den pro-apoptotiske virkning af 8-CI-cAMP i vid udstrækning forhindres ved farmakologisk inhibering af p38 MAPK. Tilsammen antyder disse data, at 8-CI-cAMP og PKA I-selektive cAMP-analoger, selv om sammenlignelige antiproliferativ virkningsstyrke, virker gennem forskellige mekanismer. PKA I-selektive cAMP-analoger inducerer vækststop i celler der bærer BRAF onkogen, mens 8-CI-cAMP inducere apoptose, tilsyneladende gennem aktivering af p38 MAPK pathway

Henvisning:. Lucchi S, Calebiro D, de Filippis T, Grassi ES, Borghi MO, persani L (2011) 8-chlor-cyklisk AMP og proteinkinase A I-Selective cyklisk AMP analoger inhiberer cancercellevækst gennem forskellige mekanismer. PLoS ONE 6 (6): e20785. doi: 10,1371 /journal.pone.0020785

Redaktør: Andrew D. Badley, Mayo Clinic, USA

Modtaget: Januar 19, 2011; Accepteret: 9 maj 2011; Udgivet: 10 juni 2011

Copyright: © 2011 Lucchi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev delvist støttet af forskningsmidler fra Istituto Auxologico Italiano. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere eksterne midler modtaget for denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Cyklisk AMP (cAMP) er en gammel og allestedsnærværende kemisk budbringer, der findes både i prokaryoter og eukaryoter. I hvirveldyr det er en stor intracellulær mediator af neurotransmittere og hormoner og regulerer essentielle cellefunktioner, såsom sammentrækning, sekretion og replikation. Mens cAMP har en antiproliferativ virkning på de fleste celletyper, det giver en modsat, dvs. pro-mitotisk, stimulus for neuroner og flere celler af endokrin oprindelse [1], [2]. Ikke overraskende da, gener, der koder nøgleelementer i cAMP-vejen virker som onkogener eller oncosuppressors, mest udsøgt i endokrine celler [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9] , [10]. Desuden har en opregulering af type I isoformer af cAMP-afhængige protein kinase A (PKA) er dokumenteret i flere maligniteter [11].

Da cAMP har en antiproliferativ virkning på tumorceller, celle-gennemtrængelige cAMP-analoger er blevet overvejet til terapi af human cancer [11]. 8-Cl-cAMP, bedst undersøgte af disse forbindelser, har antiproliferative egenskaber både

in vitro

in vivo

og er blevet evalueret i fase I /II kliniske forsøg [11], [ ,,,0],12], [13]. Men på trods af de veldokumenterede effekter af 8-CI-cAMP, er der ingen fælles aftale om dens virkningsmekanisme. I de banebrydende undersøgelser fra gruppen af ​​Yoon Cho-Chung blev det faktisk vist, at 8-CI-cAMP modificerer forholdet PKA regulatoriske (R) underenheder (type I vs. type II) ved at formindske niveauerne af typen IR-underenheder [11], [14]. Selvom dette fænomen blev anset ansvarlig for den antiproliferative virkning af 8-CI-cAMP, resultaterne af nyere undersøgelser tyder på, at virkningerne af 8-CI-cAMP stedet medieres af dens metabolit 8-CI-adenosin og er uafhængige af PKA-aktivering og /eller ændringer af forholdet mellem type i og type II R underenheder [15], [16], [17], [18].

i et tidligere arbejde, vi fandt, at et par af stedsspecifik cAMP-analoger (8-PIP-cAMP og 8-HA-cAMP), som, når de anvendes i kombination, selektivt aktivere PKA i, havde en potent antiproliferativ effekt på to BRAF-positive carcinom cellelinier (ARO og NPA), men ikke på BRAF-negative WRO celler [19]. I denne undersøgelse, vi sammenlignede virkningen af ​​8-CI-cAMP, og disse PKA I-selektive cAMP-analoger på samme carcinoma cellelinier (ARO, NPA og WRO), ved at se på parametre som cellevækst, apoptose og ændringer af centrale signalering kaskader, der kan være impliceret i deres antiproliferative effekter.

Resultater

effekt af 8-Cl-cAMP eller PKA i-selektive cAMP-analoger på celleproliferation

først, vi sammenlignet den antiproliferative virkning af 8-CI-cAMP og PKA i-selektive cAMP-analoger. Til dette formål, vi behandlede ARO (tyktarmskræft), NPA (melanom) og WRO (follikulært skjoldbruskkirtlen karcinom) celler med forskellige koncentrationer af 8-CI-cAMP eller PKA I-selektive cAMP-analoger for forskellige tidsperioder (24-96 h) og evalueret cellelevedygtighed under anvendelse af MTT-assayet. Resultaterne indikerede, at begge behandlinger var ligeledes kraftigt virkende til inhibering af væksten af ​​ARO og NPA celler, hvorimod kun 8-CI-cAMP havde en konsistent antiproliferativ virkning på WRO celler (figur 1). Virkningen af ​​begge behandlinger nåede et maksimum efter 72-96 timers inkubation (data ikke vist) og var dosisafhængig, med IC50-værdier på 55,3 uM i ARO og 84,8 uM i NPA celler til PKA I-selektive cAMP-analoger og mellem 2.3 og 13.6 pM for 8-CI-cAMP i alle tre cellelinier. I overensstemmelse med den tidligere konstatering af, at antiproliferativ virkning af 8-Cl-cAMP er PKA-uafhængig og i det mindste delvist medieret af dens metabolit 8-CI-adenosin [15], [16], [17], [18], er effekten af 8-CI-cAMP blev signifikant inhiberet ved behandling med phosphodiesteraseinhibitoren IBMX, som blokerer omdannelsen af ​​8-CI-cAMP til 8-CI-adenosin. Tværtimod har IBMX ikke ændre den antiproliferative virkning af PKA I-selektive cAMP-analoger (Figur S1). Desuden har antiproliferativ virkning af 8-Cl-cAMP ikke at være medieret af PKC, som behandling med en PKC-hæmmer ikke ændre respons på 8-Cl-cAMP (figur S2).

ARO, NPA og WRO celler blev dyrket i 72 timer i nærvær af de angivne koncentrationer af begge typer af cAMP-analog (er) og cellelevedygtighed blev bestemt ved anvendelse af MTT-assayet. PKA I, PKA I-selektive analoger anvendt ved ækvimolære koncentrationer.

Effekt af 8-Cl-cAMP eller PKA I-selektive cAMP-analoger på cellecyklusprogression og apoptose

Efterfølgende vi vurderet, om den antiproliferative effekt af 8-CI-cAMP og PKA i-selektive cAMP-analoger var forbundet med vækst anholdelse og /eller apoptose. Dette spørgsmål blev behandlet af en kombination af metoder.

Først, vi analyserede virkningerne af 8-CI-lejren og PKA I-selektive cAMP-analoger på cellecyklus og apoptose ved flowcytometri analyse af DNA-indhold nukleare . Til dette formål blev ARO, NPA og WRO celler behandlet med enten type cAMP-analog (er) for forskellige perioder og analyseret efter DNA farvning med propidiumiodid. 8-CI-cAMP behandlingen var forbundet med en reduktion af celler i G0 /G1 og en ophobning af celler i S-fase. Desuden blev det ledsaget af en væsentlig stigning i fraktionen af ​​apoptotiske celler, dvs. dem med en sub-G0 /G1 DNA-indhold. Derimod har eksponering for PKA I-selektive cAMP-analoger ikke forårsage en væsentlig stigning i apoptose. Den eneste mærkbar indvirkning af PKA I-selektive cAMP-analoger var en lille stigning i antallet af celler i G0 /G1 (statistisk signifikant i ARO-celler) og en tendens mod en reduktion af cellerne i S og G2 /M-faser, både kompatibel med akkumulering i G0 /G1 (tabel 1).

Dernæst analyserede vi frigivelsen af ​​histon-bundne DNA-fragmenter i cytosolen, som en markør for apoptotisk DNA-fragmentering. ARO, NPA og WRO celler blev udsat for sub-maksimal koncentrationer af PKA I-selektive cAMP analoger eller 8-CI-cAMP, og mængden af ​​nukleosomer i cytoplasmaet blev bedømt ved en specifik ELISA. 8-CI-cAMP-behandling forårsagede en signifikant stigning i DNA-fragmentering i alle tre cellelinier, der var detekterbar startende fra 48 timer inkubation. Tværtimod blev ingen induktion af DNA-fragmentering observeret i celler behandlet med PKA I-selektive cAMP-analoger (Fig 2A og data ikke vist)

A:. Effekt på DNA-fragmentering. Celler blev eksponeret for 8-CI-cAMP (100 uM) eller PKA I-selektive cAMP-analoger (100 uM hver) i 48 timer og frigivelsen af ​​histon-bundne DNA-fragmenter i cytosolen blev evalueret af en specifik ELISA. Data er fra tre uafhængige forsøg. B: effekt på caspase 3/7. Celler blev eksponeret for 8-CI-cAMP (100 uM) eller PKA I-selektive cAMP-analoger (100 uM hver) i 72 timer og caspase 3/7 aktivitet blev bestemt med et luminescerende assay. Data er fra tre uafhængige forsøg. * P 0,001 vs. kontrolceller. Alle data er udtrykt som variationen i forhold til kontrollen cellekultur uden stoffer.

Endelig, som apoptose er associeret med caspaseaktivering [20], undersøgte vi virkningen af ​​begge behandlinger på aktiviteten af ​​caspase 3 /7, som blev målt ved anvendelse af et luminescerende assay. En betydelig stigning i caspase 3/7 aktivitet blev detekteret i ARO, NPA og WRO celler udsat for 8-CI-cAMP ud fra 24 timers behandling, men ikke i de samme celler behandlet med PKA I-selektive cAMP-analoger (figur 2B ).

samlet disse data antydede, at 8-CI-lejr, men ikke de PKA i-selektive cAMP-analoger induceret apoptose i ARO, NPA og WRO celler.

Apoptotiske veje aktiveres af 8- Cl-cAMP

for at undersøge pathway involveret i apoptose induceret af 8-CI-cAMP, evaluerede vi aktiviteten af ​​caspase 8 (ydre vej) og caspase 9 (indre vej) ved anvendelse luminescerende assays. Et tidligt og forbigående (10 min-1 h) aktivering af caspase 8, men ikke af caspase 9, blev observeret (figur 3), hvilket antyder, at 8-CI-cAMP kan inducere ydre vej. Men disse to caspaser ikke vise nogen aktivering på senere tidspunkter (24-48 timer) (data ikke vist).

ARO, NPA og WRO celler blev udsat for 8-CI-cAMP (200 uM) for forskellige perioder og aktiviteterne i caspase 8 og 9 blev målt udnytte specifikke selvlysende analyser. Data er fra tre til seks uafhængige forsøg. * P 0,05 over basal. ** P 0,01 over basal. *** P 0,001 vs. basal. Alle data er udtrykt som variationen versus baseline.

Effekt af 8-Cl-cAMP eller PKA I-selektive cAMP-analoger på niveauerne af PKA underenheder

Da det har været rapporterede, at 8-CI-cAMP forårsager en nedregulering af RIa og en opregulering af RIIβ underenheder [14], [21], vi sammenlignede virkningen af ​​8-CI-lejren og PKA i-selektive cAMP-analoger på ekspression af PKA R underenheder. Til dette formål blev ARO, NPA og WRO celler stimuleres med 8-CI-cAMP eller PKA I-selektive cAMP-analoger for forskellige perioder, og niveauerne af RIa, RIIα og RIIβ blev evalueret ved Western blot-analyse udnytte isoformspecifik antistoffer. Behandling af ARO, NPA og WRO celler med enten 8-CI-cAMP eller PKA I-selektive cAMP-analoger var forbundet med en reduktion i ekspressionsniveauerne af den RIa underenheden, mens niveauerne for de resterende underenheder ikke blev påvirket (Figur 4 ).

ARO, NPA og WRO celler blev behandlet med 8-CI-cAMP (100 uM) eller PKA i-selektive cAMP-analoger (100 uM hver) for de angivne tidsperioder. Niveauerne af RIa, RIIα og RIIβ blev målt ved Western blot-analyse. Vist er repræsentative Western blots (A) samt resultaterne af densitometrisk analyse af fire uafhængige forsøg (B). * P 0,01 over basal. ** P 0,001 vs. basal. Disse data er udtrykt som variation versus baseline.

Effekt af 8-Cl-cAMP eller PKA I-selektive cAMP-analoger på ERK 1/2 og Akt

I et forsøg på at bedre at forstå virkningsmekanismen af ​​8-CI-cAMP og PKA i-selektive cAMP-analoger, vi derefter undersøgt virkningen af ​​begge typer behandling på to centrale signalleringskaskader som er involveret i cellevækst, dvs. det ekstracellulære signal-regulerede kinase 1/2 (ERK) mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) biosyntesen samt phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt pathway.

ERK1 /2-er velkarakteriserede MAPK’er, som aktiveres som reaktion på vækststimuli og spille vigtige roller i neoplastisk transformation [22]. Desuden har cAMP vist sig at inhibere ERK 1/2 aktivering i flere af de celletyper, hvor den har en antiproliferativ virkning [1], [2]. Dette synes at være tilfældet i ARO og NPA celler, hvor, som vi tidligere har vist, er den antiproliferative virkning af PKA I-selektive cAMP-analoger er forbundet med en inhibering af ERK 1/2 phosphorylering ved Thr202 /Tyr204 [19] . På dette grundlag vi evaluerede virkningen af ​​8-CI-cAMP-behandling på ERK-phosphorylering på Thr202 /Tyr204 ved Western blot-analyse med et phospho-specifikt antistof. Analyse af ERK aktivering ved tidlige tidspunkter afslørede forbigående stigninger for begge behandlinger (Figur S3). I modstrid med, hvad vi tidligere observeret som reaktion på de PKA I-selektive cAMP-analoger blev kronisk eksponering for 8-CI-cAMP ikke er forbundet med en sen og vedvarende inhibering af ERK-phosphorylering (figur 5).

ARO blev NPA og WRO celler behandlet med 8-CI-cAMP (100 uM) eller PKA i-selektive cAMP-analoger (100 uM hver) for de angivne tidsperioder. Den niveauer ERK 1/2 phosphoryleret ved Thr202 /Tyr204 og total ERK blev målt ved Western blot-analyse. Vist er repræsentative Western blots samt densitometrisk analyse af tre til fire uafhængige forsøg. De P-ERK /total-ERK-forhold er udtrykt som den relative variation versus de basale niveauer af hver enkelt eksperiment. * P 0,05 over basal. ** P. 0,01 over basal

Et andet protein, som er blevet impliceret i celleproliferation er serin /threonin-kinase Akt, som aktiveres af PI3K produkter og phosphorylering ved Ser473 og Thr308 [23] . Vi evaluerede derfor effekten af ​​8-CI-cAMP og PKA I-selektive cAMP-analoger på Akt fosforylering på Ser473 og Thr308, tegn på aktivering. I overensstemmelse med, hvad vi tidligere rapporteret [19], behandling med 8-CI-cAMP eller PKA I-selektive analoger forårsagede ikke relevante ændringer af Akt fosforylering på tidlige tidspunkter (figur S3) og i op til 72 timer (data ikke vist).

Virkning af 8-CI-cAMP eller PKA i-selektive cAMP-analoger på p38 MAPK

8-CI-cAMP har vist sig at inducere p38 MAPK-phosphorylering i HL60 og HeLa-celler [24], [25]. Derfor vurderede vi effekten af ​​8-CI-cAMP og PKA I-selektive cAMP-analoger på p38 MAPK phosphorylering. Vi fandt, at behandling af ARO, NPA og WRO celler med 8-CI-cAMP var forbundet med en progressiv stigning i p38 MAPK-phosphorylering, begyndende ved 24 timer inkubation (figur 6). Tværtimod gjorde behandling med PKA I-selektive cAMP-analoger ikke ændre fosforylering tilstand p38 MAPK (figur 6), bortset fra mindre og forbigående stigninger, der ikke nåede statistisk signifikans. Desuden har behandling med 8-CI-cAMP eller PKA I-selektive analoger ikke forårsage ændringer af p38 MAPK-phosphorylering på tidlige tidspunkter (figur S3).

ARO, NPA og WRO celler blev behandlet med 8- Cl-cAMP (100 uM) eller PKA i-selektive cAMP-analoger (100 uM hver) for de angivne tidsperioder. Niveauerne af phosphoryleret og total p38 MAPK blev målt ved Western blot-analyse. Vist er repræsentative Western blots samt densitometrisk analyse af tre uafhængige forsøg. P-p38 /total-p38-forholdet normaliseres til basale niveauer. * P 0,05 over basal. ** P 0,01 over basal. *** P. 0,001 vs. basal

Endelig har vi vurderet, om den pro-apoptotiske effekt af 8-Cl-cAMP var afhængig af p38 MAPK aktivering. Til dette formål har vi behandlet i 48-72 timer alle tre cellelinier med 8-CI-cAMP i nærvær eller fravær af selektive p38 MAPK-inhibitorer (SB 202190 eller SB203580) og analyserede cellecyklusfordeling ved flowcytometri som beskrevet ovenfor. Interessant, inhibering af p38 MAPK vid udstrækning forhindret den pro-apoptotiske virkning 8-CI-cAMP (figur 7).

Celler blev stimuleret med 8-CI-cAMP (100 uM) enten i nærværelse eller i fravær af p38 MAPK-inhibitorer (10 uM SB203580 eller SB202190) i 72 timer og apoptose blev vurderet med flowcytometri analyse efter propidiumiodidfarvning. Data er fra mindst tre uafhængige forsøg. Data er udtrykt som variationen i forhold til kontrollen cellekultur. * P 0,05 og ** P. 0,001 vs. celler behandlet med 8-CI-cAMP alene

Alle disse data tyder på, at den pro-apoptotiske effekt af 8-CI-cAMP på ARO er NPA og WRO celler medieret af p38 MAPK.

Inddragelse af AMPK i aktiveringen af ​​p38 MAPK med 8-CI-cAMP

En nylig undersøgelse [25] har rapporteret, at de antiproliferative virkninger af 8-CI-cAMP kunne være medieret af en aktivering af AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) efter sin metabolisering til 8-CI-adenosin. For at verificere denne hypotese vi evaluerede virkningerne af både en aktivator, AICAR, og en inhibitor, forbindelse C, på AMPK. Behandling med AICAR efterlignede virkningerne af 8-CI-cAMP på p38 MAPK phosphorylering og på caspase 3/7 aktivitet. Derudover forbindelse C var i stand til i høj grad hindre såvel phosphorylering af p38 MAPK og aktiveringen af ​​apoptose induceret af 8-CI-cAMP (figur 8).

ARO, NPA og WRO celler blev stimuleret med 8- Cl-cAMP (100 uM) eller AMPK aktivator (AICAR, 1 mM) i 72 timer enten i nærvær eller fravær af forbehandling med et AMPK inhibitor (forbindelse C, 2,5 uM). A: niveauerne af phosphoryleret og total p38 MAPK blev målt ved Western blot-analyse. Vist er resultaterne af repræsentative Western blot-eksperimenter samt densitometrisk analyse af tre uafhængige forsøg. Data er normaliseret til kontrolniveauer. B: caspase 3/7 aktivitet blev bestemt med et luminescerende assay. Vist er resultaterne fra mindst tre uafhængige forsøg. Data er normaliseret til at styre cellekultur. Forklaring: A: kontrol, B: 8-Cl-cAMP, C: AICAR, D: Forbindelse C, E: 8-Cl-cAMP + Forbindelse C, F: AICAR + Compound C. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 over for kontrol. # P 0,05, ## P 0,01, ### P 0,001 vs. 8-CI-cAMP. § P 0,05, §§ P 0,01, §§§ P. 0,001 vs. AICAR

Diskussion

cAMP-analoger hæmmer udbredelsen af ​​flere tumorceller. Den bedst undersøgte af disse forbindelser er 8-Cl-cAMP, som har demonstreret antiproliferativ virkning både

in vitro

in vivo

og er blevet evalueret i fase I /II kliniske forsøg [11 ], [12], [13]. I en nylig undersøgelse har vi beskrevet den antiproliferative virkning af et par cAMP analoger selektiv for PKA I på humane carcinoma-cellelinier [19]. Målet med dette arbejde var at sammenligne effekten af ​​disse cAMP-analoger til det eller de undersøgte 8-CI-cAMP og yderligere at undersøge deres mekanisme (r) for. Resultaterne antyder, at 8-CI-cAMP og PKA I-selektive cAMP-analoger, selv af lignende styrke, afviger i celletype selektivitet og mekanisme (r) for. PKA I-selektive cAMP-analoger inducerer vækststandsning, men ikke apoptose, og som vi tidligere har vist, deres virkninger synes at være medieret af en PKA-afhængig inhibering af ERK-aktivering. Derimod er 8-CI-cAMP virkninger mest sandsynligt udøves af dens metabolit 8-CI-adenosin, er uafhængige af PKA-aktivering, og er tilsyneladende medieret af AMPK aktivering og efterfølgende p38 MAPK-afhængig induktion af apoptose.

Vores data indikerer, at 8-CI-cAMP og PKA i-selektive cAMP-analoger have en tilsvarende potent antiproliferativ virkning, hvilket antyder, at de begge kan bibeholde et potentiale for cancerterapi. PKA I-selektive cAMP-analoger synes at kræve tilstedeværelsen af ​​konstitutiv ERK-aktivering, som antydet af at de er meget aktive kun i BRAF

V600E-muteret ARO og NPA-celler, hvor de inhiberer ERK phosphorylering. Derimod 8-CI-cAMP inhiberer kraftigt cellevækst også i BRAF-negative WRO celler, hvilket antyder, at det kan være effektivt i et bredere område af cancerceller.

Flere resultater viser, at 8-CI-cAMP og PKA I-selektive cAMP-analoger virker via forskellige mekanismer. Først vises effekten af ​​8-Cl-cAMP skal hovedsagelig medieret efter aftale med tidligere bemærkninger [15], [16], [17], [18], ved dens metabolit 8-CI-adenosin, der handler via AMPK, og ikke ved stimulering af PKA, som foreslået af virkningen af ​​IBMX og selektiv AMPK aktivering /hæmning; Tværtimod betyder IBMX ikke ændre den antiproliferative reaktion på PKA I-selektive cAMP-analoger. For det andet, 8-CI-cAMP og PKA I-selektive cAMP-analoger producere uens modifikationer af cellecyklus. Især 8-CI-cAMP, men ikke de PKA I-selektive cAMP-analoger, inducere apoptose. For det tredje PKA I-selektive cAMP-analoger, men ikke 8-CI-cAMP, reducere ERK fosforylering i ARO og NPA celler. Fjerde, 8Cl-cAMP, men ikke de PKA I-selektive cAMP-analoger, øge p38 MAPK-phosphorylering.

Virkningsmekanismen af ​​8-CI-cAMP meget omdiskuteret. Cho-Chung og kolleger har gjort et betydeligt arbejde om dette emne, hvis resultater viser, at 8-CI-cAMP inducerer væksthæmning ved at øge RI til RII forhold [14], [21]. På den anden side, nyere undersøgelser tyder på, at denne regulering ikke hovedårsagen til den observerede vækstinhibering [17]. I denne rapport finder vi, at 8-CI-cAMP reducerer ekspressionen af ​​RIa i ARO, NPA og WRO celler. Imidlertid finder vi, at IBMX, som blokerer omdannelsen af ​​8-CI-cAMP til 8-CI-adenosin, en metabolit ikke kan aktivere PKA, reducerer den antiproliferative virkning af 8-CI-cAMP signifikant.

A nyere undersøgelse [25] har vist, at 8-CI-adenosin er i stand til at stimulere AMPK, så vi undersøgt inddragelse af denne vej i 8-CI-cAMP-induceret apoptose. Vore data viser, at induktion af apoptose med 8-CI-cAMP er ledsaget af aktivering af caspase 3/7, og lignende resultater blev opnået ved AICAR, en aktivator af AMPK. Endvidere Forbindelse C, en AMPK inhibitor, forhindrer caspase 3/7 induktion af både AICAR og 8-CI-cAMP hhv. I sidste ende, foreslår vi, at den pro-apoptotiske virkning af 8-CI-cAMP medieres af AMPK.

Derudover viser vi, at den pro-apoptotiske virkning af 8-CI-cAMP er ledsaget af en progressiv stigning af p38 MAPK phosphorylering. P38 MAPK er en vigtig regulator af celleoverlevelse [26], [27], og har været impliceret i den pro-apoptotiske virkning af 8-CI-cAMP i HL60 og HeLa-celler [24], [25]. For at undersøge, om p38 MAPK aktivering er afhængig af AMPK vi ansat en aktivering /hæmning strategi ligner den, der blev vedtaget for caspase 3/7. Da AMPK blokade stort set forhindret og AMPK aktivering efterlignede virkningerne af 8-CI-lejr på p38 MAPK, vores data tyder på, at 8-CI-cAMP efter konverteringen i dens metabolit 8-CI-adenosin aktiverer p38 MAPK gennem stimulering AMPK.

i et forsøg på at tydeliggøre, der fører til caspase 3/7 aktivering, målte vi aktiviteten af ​​de opstrøms caspaser 8 og 9, som er involveret i ydre og indre apoptotiske veje, henholdsvis. Henviser iagttoges ingen aktivering af caspase 9, blev påvist en tidlig og kun forbigående (5 min-1 h) aktivering af caspase 8. Disse data kan indikere en involvering af den ydre vej i de pro-apoptotiske virkninger af 8-CI-cAMP. Men i betragtning af observerede lange forsinkelse mellem aktivering af caspase 8 og 3/7, og den forbigående karakter af caspase 8-aktivering, er det muligt, at andre mekanismer, sandsynligvis uafhængigt af opstrøms caspaser, kan være involveret i aktiveringen af ​​caspase 3 /7. Interessant, selvom de mekanismer, hvorved p38 MAPK kan aktivere caspaser ikke er fuldt belyst, en mulig direkte aktivering af caspase 3 af p38 MAPK er også blevet rapporteret [28].

Som konklusion indikerer vore data, at både 8-CI-cAMP og PKA i-selektive cAMP-analoger har en tilsvarende potent antiproliferativ effekt på kræftceller af forskellig oprindelse. Således de begge bevarer et potentiale som anticancerlægemidler. 8-CI-cAMP synes at være effektiv i en bredere vifte af celletyper og inducerer apoptose. På den anden side, den mekanisme (r) for 8-Cl-cAMP og PKA I-selektive cAMP-analoger er forskellige, hvilket antyder, at de kan have uens farmakologiske og toksikologiske profiler, samt unikke antitumorale egenskaber. Future

in vivo

eksperimenter vil være forpligtet til at sammenligne deres effekt og tolerabilitet i prækliniske kræftmodeller.

Materialer og metoder

Kemi

Cell kultur reagenser var købt hos Invitrogen (San Giuliano Milanese, Italien). 8-chloradenosin-3 ‘, 5′-cyklisk monophosphat (8-CI-cAMP), 8-piperidinoadenosine-3′, 5’-cyklisk monophosphat (8-PIP-cAMP) og 8-hexylaminoadenosine-3 ‘, 5’cyclic monophosphat (8-HA-cAMP) blev indkøbt fra Biolog Life Science Institute (Bremen, Tyskland). BCA kit og nitrocellulosemembraner blev indkøbt fra Pierce Biotechnology (Rockford, IL). PKARIα, PKARIIα, PKARIIβ og p-actin antistoffer blev indkøbt fra BD Biosciences Pharmingen (Milano, Italien). Phospho-ERK, phospho-Akt, phospho-p38 MAPK, ERK, Akt og p38 MAPK antistoffer blev købt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). HRP konjugeret mus og kanin sekundære antistoffer blev købt hos Chemicon International (Temecula, CA). ECL-plus-kit blev indkøbt fra Amersham Biosciences Europe (Freiburg, Tyskland). Celledøden Detection ELISA Plus kit blev indkøbt fra Roche Applied Science (Mannheim, Tyskland). Den CellTiter-Blå cellelevedygtighed og caspase-Glo 3/7, 8 eller 9 assays blev anskaffet fra Promega Corporation (Madison, WI, USA). 4- (4-fluorphenyl) -2- (4-methylsulfinylphenyl) -5- (4-pyridyl) 1H-imidazol (SB203580) blev indkøbt fra Biosource (Nivelles, Belgien). 3-isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), 4- (4-fluorphenyl) -2- (4-hydroxyphenyl) -5- (4-pyridyl) -1 H-imidazol (SB202190), bisindolyl-maleimid I (GF109203X), AICAR, 6- [4- (2-piperidin-1-ylethoxy) phenyl] -3-pyridin-4-ylpyrazolo [1,5-a] pyriimdine (forbindelse C) og alle andre reagenser blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (Milano , Italien).

Cell kultur

ARO, NPA og WRO celler blev venligst stillet til rådighed af I. Bongarzone (Milano, Italien). En nylig DNA-profilering analyse har afsløret, at ARO-celler svarer til HT-29 coloncancer cellelinie og NPA celler matche M14 /MDA-MB-435s melanom cellelinie [29]. WRO celler stammer fra et follikulært thyreoideakarcinom [30]. Alle celler blev holdt i DMEM-medium suppleret med 10% FCS, 1% penicillin og 1% streptomycin ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO

2.

Selektiv aktivering af PKA I

for selektivt at aktivere PKA i, vi udnyttet det almindeligt anvendte strategi samtidig ved hjælp to forskellige cAMP-analoger, dvs. 8-piperidinoadenosine-3 ‘, 5’-cyklisk monophosphat (8-PIP-cAMP) og 8-hexylaminoadenosine-3 ‘, 5’cyclic monophosphat (8-HA-cAMP), hver med høj selektivitet for binding til enten sted A (8-PIP-cAMP) eller B (8-HA-cAMP) af type i PKA R underenheder [19].

Proliferationsassay

Celleproliferation blev vurderet under anvendelse af 3- (4,5-dimetylthiazole-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay som tidligere beskrevet [19 ]. Kort fortalt blev cellerne podet i plader med 96 brønde, og 24 timer efter udpladning blev behandlet med de angivne koncentrationer af 8-CI-cAMP eller PKA I-selektive cAMP-analoger (8-PIP-cAMP + 8-HA-cAMP). For inhibering af PKC blev celler inkuberet i 30 minutter med GF109203x før tilsætning af 8-CI-cAMP eller PKA I-selektive cAMP-analoger. MTT (0,5 mg /ml) blev tilsat til celler tre timer før målingen, og formazankrystaller, der dannes ved mitokondrie reduktion af MTT, blev solubiliseret i DMSO /ethanol 01:01. Relative vækst blev beregnet fra absorbansen ved 550 nm under anvendelse af følgende ligning: Relativ vækst (%) = (OD

550 nm af behandlede brønde /OD

550 nm af kontrolbrønde) × 100

Detection. af apoptotisk DNA fragmentering

DNA-fragmentering blev evalueret udnytte Cell Død Detection ELISA Plus kit. Dette assay tilvejebringer en kvantitativ bestemmelse af histon-associerede DNA-fragmenter (mono- og oligo-nukleosomer) i cytoplasmatiske fraktion af cellelysater. Kort fortalt blev cellerne podet i plader med 96 brønde og 24 timer senere behandlet med 8-CI-cAMP eller PKA I-selektive cAMP-analoger i 48 timer. Prøverne blev derefter behandlet og analyseret i tre eksemplarer, ifølge producentens instruktioner.

Bestemmelse af caspase aktiviteter

Caspase-aktivitet blev målt under anvendelse af luminescerende Caspase-Glo 3/7, 8 eller 9 assays efter producentens anvisninger. Caspase 3/7 aktivitet blev normaliseret til antallet af celler indeholdt i hver brønd, bestemmes under anvendelse af fluorometriske CellTiter-Blå celleviabilitetstest. Aktiveringsniveauer af caspaser 8 og 9 er udtrykt i forhold til ikke-behandlede prøver. Selvlysende og fluorescerende målinger blev udført udnytte Fluoroskan Ascent FL multiplate læser (Thermo Labsystems, Helsinki, Finland).

Analyse af cellecyklus ved flowcytometri

Cellerne blev høstet ved trypsinisering, vasket i PBS og herefter fikseret med iskold 70% ethanol. Fikserede celler blev vasket med PBS og farvet med PBS indeholdende 40 ug /ml propidiumiodid og 100 pg /ml RNAse A ved 37 ° C i 30 minutter. Prøver blev analyseret med FACSCalibur flowcytometer (Becton Dickinson, Buccinasco, Italien).

Western blot-analyse

Til påvisning af PKA-regulatoriske underenheder blev celler lyseret i RIPA modificeret buffer indeholdende proteaseinhibitorer ( 10 mM Tris-HCI pH 7,5, 500 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% NP40, 1% Na-deoxycholat, 2 mM EDTA, 2 mM Na

2VO

4, 2 mM Na

4P

2O

7, 2 mM NaF). Til påvisning af ERK, Akt, og p38 MAPK-phosphorylering blev celler lyseret med SDS-prøvebuffer (62,5 mM Tris-HCI pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerol, 50 mM DTT, 0,01% bromphenolblåt), umiddelbart opvarmet i 5 min ved 95 ° C og sonikeret.