PLoS ONE: prognostiske værdi af Stem Cell Kvantificering i fase II tyktarmskræft

Abstrakt

Baggrund

Kræft stamceller (CSCS) er en delmængde af tumorceller med kapacitet til selv at forny og generere de forskellige celler, der udgør tumoren. Formålet med denne undersøgelse er at vurdere den prognostiske værdi af CSCS i en meget homogen population af stadie II tyktarmskræft.

Metoder

Et hundrede stadie II tyktarmskræft patienter behandlet med samme kirurgiske hold mellem 1977 og 2005 blev retrospektivt analyseret. Ingen af ​​patienterne har modtaget adjuverende kemoterapi. Inmunohistochemistry udtryk for CD133, NANOG og CK20 blev scoret, med fire niveauer: 10%, 11-25%, 26-50% og 50% positivitet. Kaplan-Meier analyse og log rank test blev anvendt til sammenligning overlevelse.

Resultater

Den gennemsnitlige patientens alder var 68 år (patienter var mellem 45-92 år) og median opfølgning blev 5,8 år. Der var tilbagevendende sygdom i 17 (17%); CD133 ekspression (defineret ved 10% positivitet) blev vist i 60% af tumorerne, i 95% for NANOG og 78% for CK20. Ingen korrelation blev fundet blandt ekspressionsniveauer af CD133, NANOG eller CK20 og tilbagefald overlevelse (RFS), eller samlet overlevelse (OS). Imidlertid blev en statistisk signifikant sammenhæng fundet mellem etablerede patologiske prognostiske faktorer og RFS og OS.

Konklusioner

Stem Cell kvantificering defineret af CD133 og NANOG udtryk har ingen sammenhæng med RFS eller OS i denne kohorte af fase II tyktarmskræft

Henvisning:. Vaz MA, Martinez JC, Devesa JM, Trill JD, Abraira V, Riquelme A, et al. (2014) prognostiske værdi af Stem Cell Kvantificering i fase II tyktarmskræft. PLoS ONE 9 (2): e88480. doi: 10,1371 /journal.pone.0088480

Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA

Modtaget: September 7, 2013; Accepteret: 8. januar 2014 Udgivet: 21 februar 2014

Copyright: © 2014 Vaz et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyktarmskræft er en af ​​de mest almindelige årsager til. kræft død på verdensplan og overlevelse påvirkes af lokalt recidiv samt udvikling af metastatisk sygdom.

kræft stamceller teori er baseret på antagelsen om, at der findes en lille bestand af kræft-initierende celler, som udelukkende ansvarlig for vækst og opretholdelse af hele tumoren. Disse celler har lav proliferativ hastighed, høj selvfornyelse kapacitet og tilbøjelighed til at differentiere til aktive prolifererende tumorceller, og de er resistente over for kemoterapi og strålebehandling. Disse celler er blevet rapporteret i forskellige kræftformer.

De seneste forskningsresultater tyder på, at kræft stamceller model gælder også for colon carcinom. Ricci-Vitiani og O’Brien rapporteret, at CD133 positive celler i kolorektal cancer udviser egenskaberne for kræft initierende celler med selvfornyelse og høj tumorgen potentiale. Disse CSCS udtrykker pluripotens markører såsom CD133 og NANOG og ikke udtrykker markører for differentiering som cytokeratin20 (CK20) [1], [2], [3].

Den potentielle prognostiske værdi af CSCS i kolorektal cancer har blevet undersøgt med modstridende resultater. Et antal af disse serier var baseret på heterogene situationer, der involverer rektal og tyktarmskræft og forskellige tumor stadier (I-IV). Formålet med denne undersøgelse er at vurdere den prognostiske værdi af CSCS i en meget homogen population af stadie II tyktarmskræft.

Materialer og metoder

I alt 100 patologisk bekræftede prøver blev opnået fra tyktarmen kræftpatienter med TNM stadie II, som blev behandlet kirurgisk mellem 1977 og 2005 på Ramon y Cajal Universitetshospital. For at reducere effekten af ​​adjuverende behandling på prognose ingen af ​​de inkluderede patienter fik adjuverende kemoterapi. Alle patienter blev fulgt op for tilbagefald overlevelse og samlet overlevelse. Opfølgningen perioden blev beregnet fra datoen for operationen indtil 2010. Gentagelse blev defineret som re-udseende af den oprindelige tumor; og både metastase eller lokalt recidiv blev anset for at være tegn på tumor tilbagefald. Samlet overlevelse blev defineret som tiden fra operation til død eller på det tidspunkt, hvor patienten var sidst optagede at leve. I denne undersøgelse var kendt prognostiske kliniske faktorer også registreret. Højrisikopatienter blev anset for at være dem med mindst en af ​​de følgende træk: færre end 12 lymfeknuder stede i de kirurgiske prøve, T4 tumor, lymphovascular invasion og dårligt differentierede tumorer. Den TNM klassifikation blev brugt til patologisk iscenesættelse og WHO klassifikation blev brugt til patologisk sortering. Forskningen har godkendt etiske udvalg (Ramon y Cajal Universitetshospital). Skriftligt informeret samtykke blev opnået for brug af prøven i forskningen.

histologisk undersøgelse

Prøver blev hentet fra patologi filer af Ramon y Cajal Universitetshospital, Madrid, Spanien, og histologisk revideret. Paraffinblokke blev hentet til konstruktion vævsarrays indeholdende 1,5 mm væv diameter cylindre fra coloncancer og kontrolprøver. Hvert væv matrix paraffinblok indeholdt mindst 2 prøver af hver sag for at få den ind styring af signalet ekspression. De mest repræsentative områder af hver tumor blev udvalgt til undersøgelsen. Reaktiv lymfevæv (tonsiller) blev anvendt som negative kontroller af ekspression og inkorporeret ved triplo i hvert væv array. Histopatologiske funktioner blev uafhængigt revideret. Dette blev efterfulgt af fælles observation på en multihead mikroskop, hvor uoverensstemmelser blev løst.

Immunhistokemi (IHC)

Anti-CD133 kanin monoklonalt antistof (Cell Signaling Technology) og ged polyklonale ant menneskelig NANOG ( Novus Biologicals), blev anvendt til at identificere stamceller cellemarkører. Anti-Cytokeratin20 (CK 20) monoklonalt museantistof (Dako, Danmark) blev anvendt til at evaluere differentierede epitelceller. Immunhistokemisk farvning blev udført ved at følge Dako Fast En Vision kanin /mus metode (Dako, Danmark). Som en positiv kontrol for mønster ekspression og signal specificitet, vi anvendte føtale menneskelige hjerne vævssnit herunder hjernen ventrikulære neuro epitel. Dette var det første sted, hvor CD133 ekspressionen blev detekteret i den apikale grænse neuroephitelial celler [4]. Senere, udgivelse som membranpartikler CD133 positive, blev observeret i de ventrikulære flydende og forskellige humane kropsvæsker, herunder gut [5]. Inkubation med en ubeslægtet antistof blev ansat som en kontrol af antigen bevaring og genopretning. Inkubation udelade det første antistof blev anvendt som en negativ kontrol af en ikke-specifik detektionssystem farvning.

Immunohistokemisk Undersøgelse

Immunhistokemi undersøgelse blev udført fra paraffinindlejrede vævssnit, der omfattede de mest repræsentative tumorområder . CD133, NANOG og CK20 blev analyseret. Tumorerne fik en semikvantitativ scor med fire niveauer: 10%, 11-25%, 26-50% og 50% positivitet. Vi definerede en prøve for positiv, hvis der var . 10% positive celler

Statistical Analysis

Kaplan-Meier-analyse blev anvendt til at estimere kræftspecifikke overlevelse og grupperne blev sammenlignet med log-rank test. Statistiske procedurer blev udført ved hjælp af SPSS-version 15.0, og p 0,05 var considerer statistisk signifikant. Alle analyser blev udført ved hjælp af statistiske Package for Social Sciences (SPSS) Software.

Resultater

klinisk-patologisk Fund

De klinisk-patologiske fund er noteret på tabel 1. Den mediane alder af patienterne var 68 år (patienter spænder fra 45 til 92 år), 53% var mænd og 47% var kvinder.

Kendte høj risiko klinisk-patologiske fund til tilbagefald blev registreret, er defineret af færre end 12 lymfeknuder stede i de kirurgiske eksemplar, T4 tumorer, lymphovascular invasion og dårligt differentierede tumorer og patienter blev kategoriseret i høj risiko kategori, hvis der var en eller flere af disse risikofaktorer eller i kategorien lav risiko, hvis der ikke var nogen risikofaktorer. Fifty to procent var høj risiko og 48% var patienterne lav risiko. Tredive fem procent af patienterne havde 12 lymfeknuder i de kirurgiske prøve. Kun 4% var T4, 9% af patient havde dårligt differentieret histologi og 11% havde lymphovascular invasion. På tidspunktet for sidste opfølgning havde 17% af patienterne tilbagevendende sygdom og 61% var i live; 36% var døde, 16% af kolorektal cancer og 20% ​​af andre årsager.

Den CD133 Antigen placering i Colon Cancer

Den positive inmunohistochemical reaktivitet mønster for CD133 observeret i periventrikulære neuroepitelceller (kontrol tilfælde) (fig. 1), er i holde den, der observeres i tidligere undersøgelser [5], og fungerer som en positiv kontrol for specificiteten af ​​signalet. The CD133-antigen er tidligere blevet vist at være placeret i apikale plasmamembran protusions af kulturerne cancercellelinie Caco-2 [5].

Vi observerede et polært farvning af CD133 begrænset til den apikale luminale celle overflade af kolorektal cancer kirtler. Normalt flere CD133 positive celler blev samlet. CD133 ekspressionen tendens til udtales tæt på den invasive margen af ​​tumorerne.

CD133-protein-ekspression blev observeret i den apikale grænse for tyktarmskræft celler og kirtler, ofte kaste CD133 positive affald ind i luminale kirtler (fig. 2 ). Lejlighedsvise grupper af neoplastiske celler viste positive hele cytoplasmatisk ekspression (fig. 3).

nr CD133 positivt signal blev fundet i nogen af ​​de væv tonsil prøver, eller i slimhindeoverfladen af ​​dem, anvendt som negativ kontrol. Denne regel ud muligheden for falsk positivitet, eller ikke-specifik binding af CD133-antistoffet anvendes, til mucosale /luminale rum.

Ved at se på hinanden følgende vævssnit sammenlignede vi CD133 og CK20 proteinekspression (fig. 4 ). Felter indeholdende CD133 positive celler viste regel svag eller ingen CK20 protein udtryk, mens områder med høj CK20 udtryk var normalt CD133 negative. Men grupper af neoplastiske celler, der udtrykker samtidig CD133 og CK20 blev vist samt (fig. 5).

immunhistokemisk CD133 Expression

CD133 ekspressionen blev påvist i 100% af patienterne . Fyrre procent af patienterne havde 10% positivitet; 22% af patienterne havde 11-25% positivitet; 6% af patienterne havde 26-50% positivitet og 22% af patienterne havde . 50% positivitet

Alle 100 patienter blev fulgt op for at overleve til at analysere CD133 udtryk som en prognostisk faktor. Den mediane opfølgningsperiode var 5,8 år. Af de 100 patienter, 16,3% døde af deres kræft og 20,4% af andre årsager. Der var 7 tilfælde af lokalt recidiv, 11 tilfælde af fjernmetastaser.

gentagelse-fri overlevelseskurver var ikke forskellig mellem de forskellige niveauer af CD133 positivitet udtryk. Kaplan-Meier kurve for samlet overlevelse viste ingen statistiske forskelle mellem de forskellige grupper (fig. 6).

NANOG Expression

NANOG nukleare og cytoplasmatisk udtryk blev påvist i 99% af patienterne . Fem patienter havde 10% positivitet; 9 patienter havde 11-25% positivitet; 34 patienter havde 26-50% positivitet og 51 patienter havde 50% positivitet. Positiv farvning blev hovedsageligt observeret ved han epitel neoplastiske celler, mange af dem sammenfaldende med CD133-positive celler. Imidlertid blev NANOG positive /CD133 negative neoplastiske celler vist. Desuden blev NANOG ekspression også observeret i neoplastiske stromaceller (data ikke vist).

Kaplan-Meier-kurve for tilbagefald og samlet overlevelse var ingen statistiske forskelle mellem de forskellige niveauer af ekspression (fig. 7).

CK20 Expression

CK20 udtryk blev påvist i 78% af patienterne. Tyve-to procent af patienterne havde 10% positivitet; 29% af patienterne havde 11-25% positivitet; 26% af patienterne havde 26-50% positivitet og 23% af patienterne havde . 50% positivitet

Kaplan-Meier kurve for tilbagefald og overlevelse viste ingen statistiske forskelle mellem de forskellige grupper af udtryk

.

forholdet mellem høj risiko klinisk-patologiske kendte faktorer for patienter, defineret som havende mindst en af ​​følgende: mindre end 12 lymfeknuder stede i de kirurgiske prøve, T4 tumorer, lymphovascular invasion og ringe differentierede tumorer, og tilbagefald og overlevelse var analyseret. En statistisk signifikant sammenhæng blev fundet mellem kendte kliniske faktorer og RFS og OS (p = 0,034) (fig. 8).

Diskussion

CD133 er epitop i et glycosilated form for human prominin-1, som er medlem af den pentaspan transmembrane glycoprotein [1], og ekspression af CD133 er blevet rapporteret at være lokaliseret i den normale neonatale og voksne precursorcelle samt kræft initierende celler [2], [3]. Bemærkelsesværdigt er prominin-1 specifikt forbundet med plasmamembran protusions [4]. I løbet neurogenese, partikler, der udtrykker CD133 har vist i det neurale rør lumina, hvor frigivelsen af ​​CD133 udtrykke membran partikler synes at være en udbredt begivenhed [6]. Endvidere human CD133 stamceller, celle antigenet udtrykkes også ved forskellige humane epitelceller, herunder tarm, og målrettet til plasma membran protusions [5].

CD133 der for tiden anses en nyttig markør til at identificere CSCS i colorektal cancer. Det er af interesse, om CD133-positive celler kan betragtes som en prognostisk faktor. Denne undersøgelse har immunhistokemisk analyseret CD133 udtryk og vurderet overlevelse i en stor serie af trin II tyktarmskræft, og vi fandt, at CD133 ekspressionen ikke var en selvstændig risikofaktor i forbindelse med tilbagefald eller patient overlevelse.

Forholdet mellem CD133 udtryk og prognose i colorektale carcinomer blev undersøgt tidligere. Horst

et al

rapporterede, at CD133 ekspressionen er et selvstændigt prognostisk markør [7], mens denne form for korrelation ikke blev observeret af Kojima

et al

[8]. Et antal af disse serier var baseret på heterogene situationer, der involverer rektal og tyktarmskræft og forskellige tumor stadier (I-IV). Li

et al

analyseret en homogen IIIB gruppe (104 patienter) og viste, at CD133 positive cancerceller bidraget til udviklingen af ​​tyktarmskræft [9]. Nian-Hua Zang

et al

analyserede en gruppe af fase II og III tyktarmskræft stiftende en negativ sammenhæng overlevelse hos patienter med co-ekspression con CDXCR4 og CD133 [10].

Forskellen mellem de forskellige undersøgelser kan være afledt af utilstrækkelig patient mængde og den blandede tumor (stadium i-IV og tyktarm og endetarmskræft).

på den anden side, er det usandsynligt, at CSCS kan karakteriseres ved kun én markør . Stamcelle-lignende egenskaber er for nylig blevet rapporteret i CD133 negative celler, så godt. Derfor kan CD133-positive tumorceller ikke repræsentere hele cancer-initierende befolkning. En kombination af celleoverflademarkører er behov for definitionen af ​​tyktarmskræft stamceller. Imidlertid kræft stamcellepopulation er heterogen. Derfor niveauerne af ekspression af de forskellige cancer stamceller markører er variabel, som et resultat af den biologiske funktion diversitet for hver af dem.

NANOG, en homeodomæne transskription faktor, er en væsentlig regulator til fremme af selvstændig -renewal af embryonale stamceller og inhibering af deres differentiering. Tidligere undersøgelser indikerede, at NANOG udtrykkes i colon cancerceller, og foreslog, at deres udtryk bidrager til spredning af tyktarmskræft celler [11]. Desuden har flere undersøgelser vist, at NANOG regulerer forskellige funktioner cancerudvikling, såsom tumorcelleproliferation, lægemiddel-modstand og cancer celle kommunikation med omgivelserne stroma, hvilket fører til cellemotilitet, epithelial-mesenchymal overgang og immun unddragelse [12].

Vi besluttede at analysere NANOG i denne kohorte af patienter. NANOG og CD133 ekspressionen blev observeret i den samme delmængde af neoplastiske celler. Men NANOG niveauer af ekspression var højere end CD133, som bestemt af NANOG positive /CD133 negative neoplastiske celler, der blev vist så godt. Derudover blev NANOG udtryk også observeret i stroma celler, sandsynligvis relateret til mikromiljø kommunikationsfunktion.

Vi fandt ingen sammenhæng mellem CD133 eller NANOG udtryk og overlevelse (tilbagefald overlevelse og samlet overlevelse).

Derfor CD133-positive celler sig selv ikke have biologisk evnen forbundet med maligne potentiale i colorektal cancer.

Tidligere undersøgelser under anvendelse af cellesuspensioner på tyktarmskræft prøver viste, at CD133-positive celler var CK20 negative [3]. I vores kohorte var 78% af prøverne CK20 positive (defineret ved 10% positivitet), og heller ingen korrelation blev fundet med overlevelse

Flere faktorer kan forklare uoverensstemmelserne med tidligere rapporter: a.) Blandet tumor etaper hvor vi analyserer et meget homogent, b) forskellige antistoffer anvendes til påvisning af cD’en 133 molekyle. Faktisk kan forskellige resultater opnås ved anvendelse af forskellige antistoffer [13], [14] c) forskellige kriterier, der anvendes til at identificere positiv farvning og anderledes afskæring anvendt til at skelne positive og negative tumorer. I vores undersøgelse har vi etableret fire niveauer af positivitet: 10%, 11-25%, 26-50% og 50%. Andre anses for positivt, hvis 50% positivitet, (Horst

et al

), 10% (Kojima

et al

) eller 5% (Li

et al

), d) utilstrækkelig patient kohorte, dette kunne forklare de negative resultater for korrelation i sådan en kohorte med lav forventede tilbagefald, hvilket resulterer kun i en 17% af tilfældene. Ikke desto mindre kunne vi påvise en sammenhæng med kendte clinicopathologic faktorer og overlevelse.

Desuden har vi observeret en høj grad af CD133 og NANOG positivitet i denne gruppe af patienten i en mere indledende fase, 60% CD133 positivitet. Desuden er der i 22% var højere end 50%. Vi fandt også 94% NANOG positivitet og 51% af dem var højere end 50%. Disse resultater går imod med dem, der findes af Li

et al,

hvor op til 40% af tilfældene i trin IIIB havde 5% positivitet

Denne uventede opførsel af CD133-ekspression fundet i. vores undersøgelse, højere i lavere stadie tumorer end i mere avancerede læsioner, er blevet observeret i andre rapporter [15]. Denne fordeling er i overensstemmelse med tidligere resultater i en musemodel af kolon carcinogenese [16] og i humane primære coloncancerformer [16]. I mus kolon Carcinogenese er observeret en signifikant øget udtryk af CD133, vurderet ved immunhistokemi i tidlige neoplastiske læsioner, som havde en tendens til at falde med tumor udvikling [17] og en øget CD133 udtryk blev rapporteret i Dukes A i forhold til Dukes B og C tyktarmskræft [16]. Tidligere undersøgelser rapporteret, at intensiteten af ​​CD133 er cellecyklus-afhængige og øget CD133 positive celler er korreleret med øget DNA-indhold, og alle disse resultater er i overensstemmelse med den foreslåede proteinets evne til specifikt at identificere tumor initierende celler, der er relateret til vækst i både primær og metastatisk sygdom [18] og dermed hovedsageligt involveret i de mest aktive faser af tumor udvikling.

Denne forskellige CD133 udtryk gennem forskellige stadier er også blevet foreslået af Shmelkov

et al

, som foreslog, at under metastase, CD133-positive tumorceller generere CD133-negative celler, som er mere aggressive og også i stand til at initiere tumorer i nøgne mus. Forfatterne rapporterede, at 40% af metastatiske tumorer i deres undersøgelse var CD133 negative [19].

Som konklusion i denne undersøgelse af 100 patienter tyktarmskræft stadie II, Stem Cell kvantificering defineret af CD133 og NANOG udtryk har ingen korrelation med RFS eller OS. Imidlertid blev en korrelation med etablerede prognostiske patologiske faktorer fundet. Derfor er vores resultater tyder på, at CSCS ikke kan spille en stor rolle i tidlige faser af tyktarmskræft.

Tak

Vi takker Drs Y Castro og ME Fernandez-Santos PhD, for at læse manuskriptet og giver nyttige råd og idéer. MA Gonzalez-Nicolas BSc En Acosta BSc bidrog med deres fremragende tekniske bistand til gennemførelsen af ​​de farvning eksperimenter på føtale hjerne prøver til studiet af CD133 udtryk, såvel som for deres nyttige kommentarer og præcise fortolkning.