PLoS ONE: Induktion af CD44 Variant 9-udtrykkende Cancer Stamceller Måske dæmpe Effekten af ​​Chemoradioselection og forværrer prognosen for patienter med fremskreden hoved- og hals Cancer

Abstrakt

Baggrund

På vores institut, har en chemoradioselection strategi blevet brugt til at vælge patienter til organopbevaring på grundlag af svar på en indledende 30-40 Gy samtidig kemostråleterapi (CCRT). Patienter med et positivt svar (dvs. chemoradioselected, CRS) har vist bedre resultater end dem med en ugunstig reaktion (dvs. nonchemoradioselected; N-CRS). Vellykket målretning af molekyler, der svækker effekten af ​​chmoradioselection kan forbedre resultaterne. Således er målet med denne undersøgelse var at evaluere foreningen af ​​en ny cancer stamcelle (CSC) markering, CD44 variant 9 (CD44v9), med cellulær resistens over for chemoradioselection i fremskreden hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC).

Materialer og metoder

Gennem en medicinsk diagram søgning, blev 102 patienter med fremskreden HNSCC behandlet med chemoradioselection 1997-2008 indskrevet. Ifølge vores algoritme, 30 patienter var CRC efter induktion CCRT og 72 patienter var N-CRS. Brug den konventionelle immunhistokemisk teknik blev biopsi prøver og kirurgisk fjernede tumor prøver immunfarvet med anti-CD44v9 specifikke antistoffer.

Resultater

De iboende ekspressionsniveauer af CD44v9 i biopsi prøver korrelerede ikke med den chemoradioselection og patient overlevelse. Men i N-CRS patienter er CD44v9-positive gruppe viste signifikant (

P

= 0,008) dårligere prognose, end CD44v9-negative gruppe. Multivariat analyser viste, at blandt fire kandidatlande faktorer (T, N, reaktion på CCRT, og CD44v9), CD44v9 positivitet (HR: 3,145, 95% CI: 1,235-8,008,

P

= 0,0163) var signifikant korreleret med den dårlig prognose, sammen med avanceret N etape (HR: 3,525, 95% CI: 1,054-9,060,

P

= 0,0228). Desuden overlevelsesraten af ​​CD44v9-inducerede gruppe var signifikant (

P

= 0,04) værre end CD44v9-ikke-induceret gruppe.

Konklusioner

CCRT-induceret CD44v9-udtrykkende CSCS synes at være en stor forhindring for at chemoradioselection. CD44v9-targeting synes at være en lovende strategi for at øge effektiviteten af ​​chemoradioselection og deraf følgende orgel bevarelse og overlevelse

Henvisning:. Aso T, Matsuo M, Kiyohara H, Taguchi K, Rikimaru F, Shimokawa M, et al . (2015) Induktion af CD44 Variant 9-udtrykke cancerstamceller Måske dæmpe Effekten af ​​Chemoradioselection og forværrer prognosen for patienter med fremskreden hoved- og halscancer. PLoS ONE 10 (3): e0116596. doi: 10,1371 /journal.pone.0116596

Academic Redaktør: Torbjörn Ramqvist, Karolinska Institutet, SVERIGE

Modtaget: September 24, 2014 Accepteret: 12. december, 2014 Udgivet: 9 mar 2015

Copyright: © 2015 Aso et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:.. Grant-i -Aid for Videnskabelig Forskning (C) til Muneyuki Masuda

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

på trods af de seneste fremskridt inden for tværfaglige behandlinger, den overordnede overlevelse og livskvalitet hos patienter med fremskreden hoved- og hals pladecellekræft (HNSCC) har ikke forbedret betydeligt i det seneste årti [1, 2] . Således etablering af klinisk effektive behandlinger baseret på HNSCC biologi er bydende nødvendigt. I Institut for Hals-og ørelæge og hoved og hals kirurgi på Kyushu Universitet og dets tilknyttede institutter, har en strategi kaldet chemoradioselection blevet brugt som et redskab til at måle biologiske aggressivitet af en individuel tumor siden 1972 [3-5]. Kort sagt, er svarene fra tumorer evalueret efter 30-40 Gy af samtidig chemoradiothepapy (CCRT). Derefter patienter, der demonstrerer gunstige reaktioner (dvs. chemoradioselected, CRS), gå videre til yderligere CCRT op til 60-70Gy, mens dem med ugunstige reaktioner (dvs. ikke-chemoradioselected, N-CRS), undergår radikal kirurgi, hvilket ofte resulterer i tab af vitale organer (f.eks larynx). Interessant CRS patienter demonstrerer signifikant bedre overlevelse og orgel bevarelse uanset deres kliniske faser, hvilket tyder nøjagtigheden af ​​chemoradioselection [3, 5]. For nylig blev en lignende begreb chemoselection postuleret af en gruppe ved University of Michigan, lette forbedret orgel bevaring og overlevelse [6-8]. Hvis således effekten af ​​kemo- /radioselection er forbedret, mere forbedret overlevelse og organbevarelse i patienter, især dem med fremskreden HNSCC ville være hensigtsmæssigt [1]. Baseret på denne spekulation formålet med denne undersøgelse er at belyse mekanismer, som mildne virkningerne af chemoradioselection at udvikle klinisk effektive målrettede behandlinger.

I det sidste årti, er det blevet klart, at kræft stamceller (CSCS), som er karakteriseret ved stort potentiale for selv-fornyelse og udbredelse af heterogene tumor, kan være den vigtigste årsag til tumor resistens til konventionelle kemo- /radio behandlinger [9]. Overlevelse af en enkelt CSC kan forårsage tumor genvækst og endnu vigtigere er blevet foreslået CSCS at være en kilde af fjerne metastaser [9]. I HNSCC blev den standard form af CD44 (CD44s) først identificeret som en overflade markør for CSCS af Prins et al, og det kommer til udtryk i 10% af HNSCC celler [10]. Men resultaterne af en immunhistokemisk undersøgelse, som viste, at 60% -95% af celler i det normale epitel af hoved og hals, og 60% -100% af HNSCC celler udtrykte CD44s, har kastet tvivl om troværdigheden af ​​denne markør [ ,,,0],11]. Desuden podning af et lille antal CD44s-negative HNSCC celler forårsaget udvikling af en bulk tumor i immun-kompromitteret mus [12, 13]. I modsætning hertil gennem en række

in vitro

in vivo

assays og eksperimenter med kliniske prøver, primært udført i laboratoriet af Prof. Saya på Keio Universitet, CD44 variant 9 (CD44v9) , en splejsningsvariant af CD44, har vist sig som en hidtil ukendt markør for cancer stemness i en række faste tumorer, herunder HNSCC [14-18]. Funktionelt, CD44v9 øger intra-cellulære niveauer af reduceret glutathion (GSH) når kombineret med XCT og dermed beskytte celler fra ROS og oxidativt stress, som er en af ​​de distinkte egenskaber af CSCS [14]. Dette scenario godt forklarer den mekanisme, hvormed CSCS kan overleve kemo- /radio terapier, fordi disse midler er blevet rapporteret til at udøve cytotoksiske virkninger hovedsagelig gennem ROS produktion af [14, 19]. Ja, i HNSCC tumorprøver, dobbelt immunfarvninger med involucrin, en differentiering markering, og CD44v9 klart vist en gensidigt udelukkende farvningsmønster og induktion kemoterapi fortrinsvis dræbt involucrin-positive cancerceller, hvilket resulterer i markant induktion af CD44v9-positive celler. Ekspressionsniveauerne af CD44v9 i HNSCC cellelinjer var forbundet med øgede niveauer af intracellulær GHS og resistens over for cisplatin. Således behandlinger af CD44v9-udtrykkende HNSCC cellelinier med en inhibitor af XCT, sulfasalazin, signifikant inhiberede cellulær levedygtighed og tumorvækst i nøgne mus og forøget følsomhed over for cisplatin [16].

På baggrund af disse resultater, vi immunhistokemisk undersøgt ekspressionsniveauerne af CD44v9-protein i kliniske prøver fra patienter med fremskreden HNSCC behandles ifølge platinbaseret chemoradioselection strategi at bestemme, om CD44v9-udtrykkende HNSCC celler besidder stemness og forårsage cellulær resistens over for chemoradioselection.

Materialer og metoder

Patient karakteristika, sub-gruppering og vævsprøver

Gennem en medicinsk diagram søgning for patienter, der blev behandlet på vores institut 1997-2008, valgte vi 102 patienter til denne undersøgelse, der mødte følgende kriterier: (1) dem med tidligere ubehandlet hypopharyngeal, larynx eller mundhule cancer patienter med stadium III eller IV tumor i henhold til UICC TNM klassifikationen (2002); (2), der behandles med chemoradioselection strategi; (3) personer uden fjernmetastaser; og (4) de med biopsi og /eller kirurgisk fjernede prøver, der tilsyneladende indeholdt invasive fronter af tumor, der var ved siden af ​​eller omgivet af tumorassocieret stroma i vores formalinfikseret paraffinindlejret væv arkiv; denne sidste kriterier var inkluderet, fordi scoring af immunfarvning blev udført i disse tumorceller fronter som beskrevet nedenfor. De virusrelaterede HNSCCs (dvs. nasofarynx og oropharynx) blev udelukket fra analyserne til at fokusere på den biologiske rolle CD44v9. Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board of National Kyushu Cancer Center (nr 2013-107). Skriftligt informeret samtykke blev givet af deltagerne for deres kliniske optegnelser, der skal anvendes i denne undersøgelse

De kendetegn for patienterne er vist i tabel 1. Alle patienter blev fulgt i . 60 måneder; den gennemsnitlige opfølgningsperiode var 51,7 måneder (interval: 2 til 151). Deres gennemsnitlige alder var 60,8 år. Der var 27 patienter med hypopharyngeal karcinom, 40 patienter med oral karcinom, og 35 patienter med larynx karcinom.

De behandlingsforløb af patienter er vist i fig. 1. Efter 30-40 Gy CCRT omfattende cisplatin (CDDP; 15mg /m

2 /dag) eller parapalatin (CBDCA; AUC = 1 /dag) fra dag 1 til 5 og ekstern bestråling (2,0 Gy /dag) 5 dage om ugen, 30 patienter blev klassificeret i CRS-gruppen (klinisk komplet respons ved det primære sted), og de resterende 72 patienter blev klassificeret i N-CRS gruppe

CCRT, samtidig kemostråleterapi.; CDDP, cisplatin; CBDCA, Paraplatin; AUC, areal under kurven; og PND, planlagt hals dissektion.

Efter en grundig undersøgelse af vævet arkiv, 30 biopsi prøver fra N-CRS patienter og 30 parrede biopsi og kirurgisk fjernede prøver fra de samme N-CRS patienter blev valgt. Men de resterende 42 patienter i N-CRS arm ikke har ordentlige biopsipræparater der opfyldte ovennævnte kriterier; derfor kun fjernes kirurgisk væv blev indsamlet fra denne population. Derfor blev i alt 132 (60 biopsi og 72 kirurgisk fjernet) vævsprøver behandles i denne undersøgelse.

Immunhistokemi og scorer

Anti-human CD44v9 rotte IgG monoklonalt antistof (RV3), som specifikt genkender human CD44v9, blev genereret og venligst stillet til rådighed af prof Saya, Keio Universitet. Dette antistof er blevet anvendt i tidligere undersøgelser [15, 16, 18]. Immunfarvning for CD44v9 blev udført som tidligere [15] beskrevne. Kort fortalt blev et Vectastain Elite ABC Standard Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) med en opvarmet-induceret, antigen-hentning trin bruges til at udføre immunhistokemisk farvning for CD44v9. Xylen blev anvendt til afparaffiniser sektioner, som blev rehydreret i en serie af ethanoler. Heat epitopgenfinding blev udført i Target Retrieval Solution (S-1699 DAKO, Tokyo, Japan) i en autoklave ved 121 ° C i 15 min. Efter afkøling ved stuetemperatur i 20 min, blev objektglassene vasket grundigt i Tris-bufret saltvand (TBS), pH 7,6. Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret ved stuetemperatur ved behandling med 0,3% hydrogenperoxid i methanol i 30 min. Snittene blev vasket i TBS og overføres derefter til en Shandon Sequenza farvningssystem i et fugtigt kammer (Thermo Fisher Scientific K.K., Yokohama, Japan). Ikke-specifik antistofbinding blev inhiberet ved at inkubere sektionerne i 10% normalt kaninserum. Objektglassene blev inkuberet med monoklonalt muse-antistof mod CD44v9 (RV3) (fortyndet 1: 12500; 0.2μg /ml) ved 4 ° C natten over. Disse snit blev vasket tre gange med TBS og inkuberet i 30 minutter i biotinyleret kanin-anti-rotte-IgG (Dako, Tokyo, Japan) fortyndet 1: 200 i Antibody Diluent. Metal Enhanced DAB Substrate Kit (Thermo Scientific) blev anvendt til at visualisere CD44v9-ekspression. Objektglassene blev modfarvet med hematoxylin. Passende negative og positive kontroller blev anvendt i hver farvningskørsel. Der var 2 typer negative kontroller: 1) ikke-immunt rotte-IgG2a-Negativ isotypekontrol (Millipore, Billerica, MA, USA) med den samme koncentration som det primære antistof og 2) fortyndingsbuffer uden det primære antistof. Brystkræftvæv blev anvendt som positiv kontrol,

I betragtning af at de basale celler i normalt epitel af den øvre aerodigestive tarmkanalen show positiv farvning for CD44v9 (fig. 2A), blev tælling af CD44v9-positive celler udført ved de invasive fronter af tumorer, der var ved siden af ​​eller omgivet af tumorassocieret stroma til udelukkende at tælle cancerceller. Denne fremgangsmåde blev også baseret på spekulationer om, at CSCS, herunder HNSCC, ofte bor i den niche placeret i tumor-associerede stroma [9, 20]. Mikroskopisk analyse blev udført med 2 uafhængige observatører, herunder en specialiseret histopatolog (KT) og den gennemsnitlige værdi blev vedtaget for scoring.

farvning intensitet opnået i de basale celler med normal epitel blev brugt som kontrol (A) . Tumorprøver viste stærk (B), moderat (C), og svag (D) intensiteter i forhold til kontrollen (A). Respektive positive (E) og negative (F) farvninger. Bar indikerer 200 um.

CD44v9 farvning score blev bestemt ved summen af ​​mængden score (dvs. procentdelen af ​​positive kræftceller) og kvaliteten score (dvs. intensiteten af ​​farvning i forhold til farvningen af ​​normale basale celler) under anvendelse af en fremgangsmåde oprindeligt foreslået af Bankfalvi et al [21]. De mængde scoringer blev defineret som følger: 0%, ingen positiv celle; 1, 1% -25%; 2, 26% -75%; og 3, 76% -100%. De kvalitetskrav scoringer blev defineret som følger: -1, homogent svag farvning; 0, heterogent lignende eller stærk farvning; og 1, homogent lignende eller stærk farvning. Baseret på denne pointsystem blev prøver med scoringer fra -1~1 kategoriseres som CD44v9-negative og prøver med scoringer fra 2~5 blev kategoriseret som CD44v9-positive.

Sortering af tumor respons på CCRT

de terapeutiske virkninger af CCRT på de kirurgiske prøver blev evalueret i henhold til kriterierne i de generelle regler for kliniske undersøgelser på hoved- og halscancer (5

th Edition) redigeret af Japan Society for hoved- og halscancer. Kort fortalt er virkningerne inddeles i 4 kvaliteter: Grad 0, ingen virkning; Grade 1, svag effekt med ≤1 /3 cancerceller stadig levedygtige; Grade 2, stærk effekt med 1/3 kræftceller levedygtige; og grad 3, komplet respons uden levedygtige celler.

statistiske analyser

En Wilcoxon rank sum test blev anvendt til at analysere relevansen af ​​CD44v9 udtryk i biopsi prøver at chemoradioselection (dvs. CRS versus N -CRS). Vi analyserede sammenhænge mellem ekspressionsniveauerne af CD44v9 i biopsiprøver og CD44v9 induktion og behandlinger effekter i kirurgisk fjernet prøver beskæftiger en Fishers eksakte test. At sammenligne de sygdomsspecifikke overlevelse (DSS) kurser mellem specifikke grupper, blev Kaplan-Meier-kurver frembragt, og en Wilcoxon test blev anvendt til at analysere de statistiske forskelle. Univariate og multivariate Cox proportional hazard model blev brugt til at beregne effekten af ​​clinicopathlogical faktorer på DSS satser. Værdier på

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle analyser blev bekræftet af en specialiseret statistiker (MS).

Resultater

immunfarvninger

De repræsentative billeder af CD44v9 farvning er vist i fig. 2. Fordelingen af ​​scoringer for de 60 biopsi prøver var som følger: score -1, 0; score 0, 13; score 1,15: score 2, 24; score 3, 4; score 4, 4; og score 5, 0. På den anden side viste de 72 kirurgiske prøver følgende fordeling: score -1,0; score 0, 11; score, 1,30: score 2, 18; score 3, 13; score 4, 0; og score 5, 0. Følgelig CD44v9-positive sats var 53% (32/60) for biopsi prøver, og 43% (31/72) for de kirurgiske prøver. Tre primære steder, mundhulen, hypopharynx og strubehovedet, viste lignende ekspressionsniveauer af CD44v9 i biopsi (

N

= 60,

P

= 0,39) og kirurgisk fjernet (

N

= 72,

P

= 0,092) prøver. Når farvning scoringer blev sammenlignet mellem de parrede biopsi og kirurgiske prøver opnået fra de identiske 30 patienter, 12 patienter viste en stigning i CD44v9 udtryk i kirurgiske prøver (udpeget som CD44v9-induceret gruppe), mens der i de resterende 18 patienter (betegnet som CD44v9-ikke-induceret gruppe), blev scorerne faldet eller uændret. De parvise biopsi prøver blev sammensat af tumorer fra hypopharynx (9), mundhulen (13), og strubehovedet (9). Hvert tredje steder viste tilsvarende satser for CD44v9 induktion (38-44%).

Kliniske kurser, reaktioner på CCRT og postoperative CCRT

Kaplan-Meier kurver (fig. 3A) blev anvendt til at analysere de kliniske resultater af CRS og N-CRS patienter (fig. 1). I overensstemmelse med vores tidligere fund, CRS patienter viste signifikant (

P

0,001) bedre overlevelse [3, 5]. De 72 kirurgisk fjernede prøver viste G1 (

N

= 58) eller G2 (

N

= 14) svar til induktion CCRT. Blandt de 72 N-CRP patienter, 54 undergik pot-operative CCRT. blev ikke observeret nogen signifikant forskel mellem de Kaplan-Meier kurver af patienter med eller uden pot-operative CCRT (

P

= 0,507).

(B) sygdomsspecifikke overlevelseskurver baseret på CD44 v9 positivitet af biopsi prøver (n = 60) opnået fra 30 chemoradioselected (CRS) patienter og 30 ikke-chemoradioselected (N-CRS) patienter. (C) sygdomsspecifikke overlevelseskurver baseret på CD44 v9 positivitet af biopsi prøver fra 30 N-CRS patienter.

Foreningen af ​​primær tumor site med chemoradioselection og prognose

Vi derefter undersøgt, om den primære tumorsted påvirket chemoradioselection og patienter overlevelse. De kræft i mundhulen viste markant lavere chemoradioselection (1/40, 3%) end oropharynx (14/27, 52%) og strubehovedet (15/35, 42%), i overensstemmelse med en generel enighed om, at mundhulen kræft er relativt resistent over for kemo /strålebehandling blandt HNSCCs [22]. Men i Kaplan-Meier-analyser af de fjernes kirurgisk prøve (

N

= 72), 5-yr DSS på mundhulen kræft (50%) var ens (P = 0,80) til de af hypopharynx (65%) og strubehovedet (55%).

Angivelse af CD44v9 i biopsiprøver

for at vurdere den kliniske betydning af effekten af ​​iboende CD44v9 udtryk på chemoradioselection og patienterne overlevelse, vi sammenlignet ekspressionsniveauerne af CD44v9 i de 60 ubehandlede biopsiprøver opnået fra CRS (

N

= 30) og N-CRS (

N

= 30) patienter. Der var ingen signifikant forskel i CD44v9 ekspressionsniveauerne mellem CRS og N-CRS prøver (

P

= 0.8289). Desuden har CD44v9 positivitet ikke påvirke Kaplan-Meier DSS kurver enten i CRS plus N-CRS kohorte (

P

= 0,64;. Figur 3B) eller i N-CRS kohorte (

P

= 0,97;. figur 3C). Lignende resultater blev opnået med den univariate Cox proportional hazard model (HR: 1,086, 95% CI: 0,68-1,72;

P

= 0,72). Disse resultater antyder, at ekspressionsniveauerne af iboende CD44v9 i biopsiprøver ikke er anvendelig som en forudsiger af chemoradioselection og patientoverlevelse.

Ekspression af CD44v9 i de kirurgisk fjernede prøver Salg

I betragtning af ovenstående resultater vi analyseret, om ekspressionsniveauerne af CCRT-induceret CD44v9 blev korreleret med de ugunstige resultater i kirurgisk fjernede prøver opnået fra N-CRS patienter. Grundlaget for denne analyse var den tidligere observation, at induktion kemoterapi tilsyneladende forbedret den delmængde af CD44v9-udtrykkende celler i HNSCC tumorer [16]. I N-CRS patienter er CD44v9-positive gruppe (

N

= 31) viste signifikant (

P

= 0,008) værre DSS end CD44v9-negative gruppe (

N

= 41) (fig. 4A). Da det blev bekræftet, at den primære tumor webstedet ikke påvirkede DSS som nævnt ovenfor, vi undersøgt virkningerne af fire forhold, f.eks, T, N, tumor respons på CCRT, og CD44v9 positivitet på DSS sats for patienter ved både univariate og multivariate analyser med en Cox proportional hazard model (tabel 2). De univariate analyser viste signifikant øget risiko for sygdomsspecifikke død i CD44v9-positive patienter (HR: 2,033, 95% CI: 1,071-3,859;

P

= 0,03) og med avanceret N (HR: 3,091, 95 % CI: 1,045-9,060;

P

= 0,0397). I multivariate analyser, CD44v9 positivitet (HR: 3,145, 95% CI: 1,235-8,008,

P

= 0,0163) og avancerede N etape (HR: 3,525, 95% CI: 1,054-9,060,

P

= 0,0228) var signifikant korreleret med dårlig prognose (HR: 3,140, ​​95% CI: 1,230-8,017;

P

= 0,0167), hvilket tyder på, at der blandt disse fire faktorer, CD44v9 udtryk niveau er en nyttig biomarkør i N-CRS befolkning, sammen med avanceret N stadium.

(B) Diseasespecific overlevelseskurverne for 30 N-CRS patienter, der havde parrede biopsi og kirurgisk fjernet prøver. Patienterne blev delt i 2 grupper efter deres niveauer af CD44v9 udtryk før og efter samtidige kemostråleterapi.

Sammenligning af parrede prøver

Vi analyserede derefter, om CD44v9-positivitet i biopsiprøve korrelerede med induktion af CD44v9 i kirurgisk fjernet prøver. Interessant nok blev stigningerne i CD44v9 score observeret overvejende (

P

= 0,0236) hos patienter med CD44v9-negative biopsi prøver (64%, 9/14) end CD44v9-positive patienter (19%, 3/16) . Ekspressionsniveauerne af CD44v9 i biopsi prøver korrelerede ikke med indplacering af tumor respons på CCRT evalueret i de parrede kirurgisk fjernede prøver (

P

= 0.3992). Vi yderligere i forhold DSS kurver mellem CD44v9-induceret gruppe (

N

= 12) og CD44v9-ikke-induceret gruppe (

N

= 18), og fandt, at den tidligere havde en signifikant (p = 0,04) værre DSS sats (fig. 4B).

tilsammen disse resultater kraftigt indikerede, at CCRT-induceret CD44v9 udtryk snarere end iboende udtryk er en terapeutisk forhindring for chemoradioselection.

diskussion

i løbet af det sidste årti, har grundpillen i behandling for fremskreden HNSCC flyttet fra indledende radikal kirurgisk resektion kombineret med postoperativ strålebehandling til dosis-intensiveret behandlingsprotokoller, som primært sigter mod bevarelse af organer [23, 24]. Denne tendens er blevet markant fremført af den nylige indførelse af CCRT (f.eks kliniske forsøg ledet af strålebehandling Oncology Group (RTOG)) og sekventiel behandling omfatter induktion kemoterapi og CCRT (fx Skat 324 protokoller), som har resulteret i yderligere forbedringer i orgel konservering, locoregional kontrol, og overlevelse [25-28]. Ikke desto mindre, som det fremgår af de seneste undersøgelser eller anmeldelser, disse protokoller synes at have nået den øvre grænse for menneskelig tolerance af akutte og subakutte toksicitet, som har forårsaget hyppige laryngoesophageal dysfunktion og mulige behandlingsrelaterede dødsfald [29-31]. Derfor er det nødvendigt at mindske den nuværende overdrevne intensiteten af ​​behandling for avanceret HNSCC ved at optimere det terapeutiske forhold. På den anden side, har vi brugt en chemoradioselection strategi at benytte komplette fordele ved radikal resektion og CCRT, og samtidig undgå de alvorlige akutte og sene toksiciteter. I vores tidligere undersøgelser, CRS patienter viste signifikant bedre overlevelse med en funktionel strubehoved end N-CRS patienter [3, 5], i overensstemmelse med resultaterne af den foreliggende undersøgelse. Disse resultater antyder, at chemoradioselection strategi kan være en lovende fremgangsmåde til avanceret HNSCC, som kan optimere den terapeutiske forhold. Men det er indlysende, at andelen af ​​CRS patienter bør øges til yderligere at forbedre satserne for orgel konservering og patient overlevelse. Identifikation og målretning molekyler, der omgår virkningerne af chemoradioselection synes at være en meget effektiv strategi for at opnå dette [1] mål. Som nævnt ovenfor, inden for den nuværende begrebsramme for kræft biologi, CSCS er sandsynligvis de vigtigste årsager til cellulær resistens til CCRT; derfor forventes CSCS at være relateret til den mekanisme, der dæmper virkningen af ​​chemoradioselection [1, 9].

I den forbindelse vi den hypotese, at i avanceret HNSCC ekspressionen af ​​en formodet CSC markering, CD44v9, kan være ansvarlig for den cellulære resistens over chemoradioselection. Vores data viste klart, at ekspressionen af ​​CD44v9 var korreleret med dårlige resultater af patienter behandlet med chemoradioselection strategi, som bekræftede vores hypotese. Desuden har vi forudsat den første kliniske beviser for, at CD44v9 kan være en nyttig biomarkør og dermed en kommerciel udnyttelse af molekylære mål i behandlingen af ​​fremskreden HNSCC. Desuden blandt andre klinisk-patologiske faktorer, der er blevet anvendt som konventionelle prognostiske markører for HNSCC, ekspressionen af ​​CD44v9 var signifikant relateret til dårlig prognose af patienter i multivariate analyser, sammen med avanceret N stadium (tabel 2). Det er at bemærke, at CD44v9 viste lavere

P

-værdi end N scenen. Ikke desto mindre, vores resultater, at CCRT-inducerede CD44v9 udtryk snarere end iboende udtryk havde prognostisk værdi skal fortolkes forsigtigt. Formentlig CD44v9 udtryk alene er ikke tilstrækkeligt at angive ejendom stemness i cancerceller; CD44v9-udtrykkende cancerceller sandsynligvis være sammensat af CSCS og ikke-CSCS. Følgelig kunne den kliniske betydning af CD44v9-ekspression i chemoradioselection strategi forklares med mindst 3 scenarier, som afbildet i fig. 5. Når tumorer ikke indeholder CD44v9-udtrykkende CSCS, total celledrab ved CCRT er muligt (dvs. CRS. Figur 5A). På den anden side, når tumorer indeholder CD44v9-udtrykkende CSCS de kan overleve CCRT (dvs. N-CRS. Figur 5B). Desuden er der en mulighed for, at CCRT, der arbejder som et selektivt tryk kan fremkalde stemness i CD44v9-udtrykkende ikke-CSCS og føre til cancer celleoverlevelse (dvs. N-CRS. Figur 5C). Disse selektive overlevelse af CSCS anses for at være kilder til lokal invasion samt regionale og fjernmetastaser, som derefter forværre resultaterne af N-CRS patienter. De tidligere resultater, der induktionskemoterapi øger CD44v9-udtrykkende cellepopulation i oral cancer [16], når de tages sammen med vores konstatering af, at CCRT-induceret CD44v9 udtryk signifikant korrelerer med dårlig prognose, støtte vores teori, at kemo- /strålebehandling, i en given omstændighed, kan arbejde som en kraft på selektiv sweep eller selektivt pres, som driver HNSCC evolution, hvilket fører til fremkomsten af ​​pluripotente CSCS [1]. Disse scenarier (fig. 5) synes at forklare, hvorfor ikke den indre, men CCRT-inducerede CD44v9-ekspression var nyttig som en biomarkør i vores chemoradioselection strategi. I de biopsiprøver, er det ikke muligt at specifikt at detektere den CD44v9-udtrykkende CSC eller CD44v9-udtrykkende ikke-CSC befolkning, der vinder erhverve stemness efter CCRT: nemlig at skelne mønstret B og C fra A. På den anden side, i kirurgisk fjernede prøver af N-CRS patienter, som gennemgik CCRT, er CD44v9-udtrykkende celler formodes at være stærkt beriget af CSCS, øge værdien af ​​CD44v9 udtryk som biomarkør.

(a) CD44v9-udtrykkende ikke -CSCs er følsomme over for CCRT. Intrinsic CD44v9-udtrykkende CSCS (B) eller CCRT-induceret CD44v9-udtrykkende CSCS (C) kan overleve CCRT. Disse CD44v9-udtrykkende CSCS anses for at være yderst invasive og metastatiske. CSC, cancer stamceller; CCRT, samtidig kemostråleterapi; CRS, chemoradioselected; og N-CRS, ikke-chemoradioselected.

sulfasalazin er et godt karakteriseret specifik hæmmer af XCT-medieret cystin transport [17], og forventes derfor at fratage CD44v9-udtrykkende cancerceller fra forsvarsmekanisme mod ROS. Faktisk administration af sulfasalazin forbedret den intracellulære aktivitet af ROS i

in vivo

analyser [17] og sensibiliserede HNSCC cellelinier til CDDP [16]. Derfor forventes det, at kombinationsbehandlingen af ​​sulfasalazin og CCRT betydeligt kan forstærke effekten af ​​chemoradioselection ved sensibiliserende både iboende og CCRT-induceret CD44v9-udtrykkende CSCS (fig. 5A og 5B) til CCRT, og forbedre resultaterne af patienter med fremskreden HNSCC. I betragtning af, at sulfasalazin er en kommercielt tilgængelig stof, der længe har været anvendt til behandling af patienter med colitis ulcerosa og leddegigt, kliniske afprøvninger af denne protokol, er nu under overvejelse.

Som konklusion kan CD44v9 målretning giver en ny tilgang til klinisk gennemførlige CSC-målrettet terapi for HNSCC der kan potensere effekten af ​​chemoradioselection og forbedre orgel bevarelse og overlevelse.

anerkendelser

forfatterne takker Prof. Hideyuki Saya for at give os den CD44v9 antistof ( RV3) og for hans konstruktive kommentarer til denne undersøgelse.