PLoS ONE: Ursolic Acid Hæmmer Indledning, Progression af prostatakræft og Forlænger Survival of TRAMP Mus ved at modulere Pro-inflammatorisk Pathways

Abstrakt

Prostatakræft er en af ​​de førende årsager til kræft død blandt mænd over hele verden . I denne undersøgelse under anvendelse transgene adenocarcinom af muse prostata (TRAMP) mus, virkningen af ​​kost beriget med 1% vægt /vægt ursolsyre (UA) blev undersøgt for at evaluere den fase specifik kemoforebyggende aktivitet mod prostatacancer. Vi fandt, at TRAMP mus fodret med UA diæt i 8 uger (uge 4 til 12) forsinket dannelse af prostata intraepitelialneoplasi (PIN). Tilsvarende mus fodret med UA diæt i 6 uger (uge 12 til 18) inhiberede progressionen af ​​pinkode til adenocarcinom som bestemt ved hematoxylin og eosin-farvning. Endelig TRAMP mus fodret med UA diæt i 12 uger (uge 24 til 36) viste markant reduceret tumorvækst uden væsentlige virkninger på kroppens samlede vægt og langvarig samlet overlevelse. Med hensyn til den molekylære mekanisme, fandt vi, at UA nedregulerede aktivering af forskellige proinflammatoriske mediatorer, herunder, NF-KB, STAT3, AKT og IKKα /β phosphorylering i dorsolaterale prostata (DLP) væv, som korrelerede med reduktionen i serum niveauer af TNF-α og IL-6. Desuden UA betydeligt nedreguleret ekspressionsniveauerne af cyclin D1 og COX-2, men opreguleret niveauerne af caspase-3 som afsløret ved hjælp af immunhistokemisk analyse af tumor vævssnit. Endelig UA blev påvist i serum prøver fra forskellige mus grupper fodret med beriget kost i nanogram mængde indikerer, at det er godt absorberet i mave-tarmkanalen. Samlet set vores resultater giver stærke beviser for, at UA kan være en glimrende middel til både forebyggelse og behandling af prostatacancer

Henvisning:. Shanmugam MK, Ong TH, Kumar AP, Lun CK, Ho PC, Wong PTH, et al. (2012) Ursolic Acid Hæmmer Indledning, Progression af prostatakræft og Forlænger Survival of TRAMP Mus ved at modulere Pro-inflammatoriske Pathways. PLoS ONE 7 (3): e32476. doi: 10,1371 /journal.pone.0032476

Redaktør: Ganesh Chandra Jagetia, Mizoram University, Indien

Modtaget: Juli 8, 2011; Accepteret: 28 januar 2012; Udgivet: 12 marts, 2012 |

Copyright: © 2012 Shanmugam et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Medical Research Council of Singapore [R-184-000-168-275 og R-184-000-201-275] til GS. APK blev støttet af tilskud fra National Medical Research Council of Singapore [Grant R-713-000-119-275] og Cancer Science Institute of Singapore, Experimental Therapeutics I Program [Grant R-713-001-011-271]. KMH blev understøttet af en bevilling fra National Medical Research Council of Singapore, Biomedical Research Council of Singapore, og Singapore Millennium Foundation. De finansieringskilder ikke har nogen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald blandt mænd i de vestlige lande efter lungekræft [1]. Kronisk betændelse i stigende grad anerkendt som en mediator for mange kræftformer [2], [3], [4] og betydelige beviser tyder på, at det spiller en stor rolle i både udviklingen og progressionen af ​​prostatacancer [5]. Første, patienter med symptomatisk prostatitis er mere modtagelige for at udvikle prostatacancer. For det andet har prostatacancer været forbundet med seksuelt overførte infektioner. Tredje, nedsat risiko for prostatacancer er forbundet med øget indtag af frugt og grøntsager, antioxidanter, og ikke-steroide anti-inflammatoriske lægemidler (NSAID) [6], [7]. For det fjerde, normal prostata gennemgår proliferativ inflammatorisk atrofi (PIA), inden den prostata intraepitelialneoplasi (PIN), forløberen for prostatakræft [8]. For det femte kan PIA overudtrykke inflammatorisk enzym COX-2 [9]. For det sjette har transkriptionsfaktorer NF-KB og STAT3, begge større mediator af inflammation, er konstitutivt aktiv i prostatakræft væv [10]. Og syvende, NF-KB-regulerede inflammatoriske cytokiner, såsom interleukin (IL) -6 er en autokrin vækstfaktor kendt for at være secerneret af prostatakræft væv [11], [12]. Derfor er det rimeligt at antage, at midler, der kan undertrykke inflammatoriske mediatorer har et potentiale for både forebyggelse og behandling af prostatacancer.

UA (3β-hydroxy-urs-12-en-28-syre) , en pentacyklisk triterpenoid stammer fra bær, blade, blomster og frugter af medicinske planter, såsom

Rosemarinus officinalis

,

Eriobotrya japonica

,

Calluna vulgaris

,

Ocimum sanctum

, og

Eugenia jumbolana

er et sådant stof, der er blevet grundigt undersøgt for dets anti-inflammatoriske og anticancer virksomhed i det forløbne årti [13]. UA er blevet rapporteret at undertrykke proliferation af en række tumorceller, til at inducere apoptose, og at hæmme tumor promotion, metastase, og angiogenese [14], [15], [16], [17]. Vores gruppe er i øjeblikket undersøger uudforskede potentiale UA til forebyggelse og behandling af prostatacancer og har for nylig rapporteret i to separate undersøgelser, UA faktisk kan undertrykke væksten af ​​prostata xenograft i nøgne mus og også hæmmer fjernt sted metastase ved at modulere CXCR4 /CXCL12 signaleringskaskade [18], [19].

Den transgene adenocarcinom af muse prostata (TRAMP) model af prostatacancer er baseret på et transgen bestående af probasin (PB) promotor-drevet SV40 T-antigen (Tag) udtryk. Dette transgen mus foretrækkes implantation modeller, fordi i denne model prostatacancer udvikler spontant gennem en række veldefinerede faser. De udviser bemærkelsesværdige ligheder med human prostatacancer progression fra PIN etape til invasiv adenokarcinom der metastaserer til lever, lunge og mave-tarmkanalen via aktivering af et transgen, der er hormonalt reguleret af androgener [20], [21]. Desuden er alle TRAMP mus udvikler veldifferentieret carcinom (WDC) mellem 8-12 uger gamle og metastaser til fjerne steder mellem 18 og 24 ugers alderen [22]. I den foreliggende undersøgelse, undersøgte vi de potentielle virkninger af UA beriget kost til at forebygge udvikling, progression samt den samlede overlevelse af tumorer i TRAMP-mus. Vores data viser tydeligt for første gang, at fodring af mus med en kost rig på UA kan inhibere væsentligt progression fra pinkode til adenocarcinom, og tumorvækst. Det kan også forlænge overlevelsen af ​​mus gennem modulation af flere signalering kaskader.

Resultater

Den foreliggende undersøgelse var designet til at undersøge den mulige effekt (er) UA på tidlig tumor udvikling, tumor progression og samlet overlevelse af TRAMP-mus (figur 1A).

A, Male TRAMP-mus 4 uger gamle blev fodret med UA beriget kost i 8 uger (gruppe 1).; 12 uger gamle mus i 6 uger (gruppe 2); og 24 uger gamle mus i 12 uge (gruppe 3). Mus blev aflivet ved slutningen af ​​behandlingsperioderne. Age-matchede kontrol TRAMP-mus fik normal kost for de samme perioder. For overlevelse undersøgelser blev Grupper 1 til 3 behandlet på lignende måde, mens gruppe 4 blev fodret med UA beriget kost i 36 uger begyndende ved 4 ugers alderen. B, H hak højre pil indikerer HG-PIN.

UA undertrykker prostata intraepitelialneoplasi (PIN) dannelse

Det er tidligere blevet rapporteret, at TRAMP mus udviser øget epitelial lagdeling i dorsolaterale prostata, epitelial celler med variabelt aflange kerner med kondenseret kromatin med flade mønstre af lav kvalitet (LG) PIN (LG-PIN) med 4-8 ugers alderen og tuftede mikropapillær og en cribriform mønster af HG-PIN ved 6-10 uge gamle [ ,,,0],22] .For undersøge om UA undertrykker PIN-dannelse, blev 4 uger gamle mus fodret med UA (1%, vægt /vægt) indeholdende diæt i 8 uger og aflivet efter 12 uger gamle (gruppe 1). Den våde vægt af prostata med sædblærer ikke væsentligt ændrer både i kontrollen og UA fodret TRAMP-mus (data ikke vist). Visuel undersøgelse af bughulen også afslørede ikke usædvanlig udvidelse af de sædblærer, prostata-lapper eller bækken lymfeknuder. Forbrug af UA beriget kost var veltolereret uden tegn på toksicitet i forhold til dyrenes udseende, adfærd og kropsvægt.

Mens ikke-TRAMP mus ikke udviste nogen PIN dannelse (fig. 1B, i), TRAMP mus dyr viste Lg- og HG-PIN og godt differentieret karcinom (WDC) (fig. 1B, II og III). Virkningerne af UA-behandling på dannelsen af ​​PIN er vist i fig. 1C. LG-PIN blev set i 60% af UA-behandlede mus sammenlignet med 40% i kontrol, mens HG-PIN blev set i 20% af UA-behandlede mus i modsætning til 80% i kontrol. Dette viste, at UA behandling havde reduceret dannelsen af ​​PIN samt forsinkede progression fra Lg- til HG-PIN-kode. Desuden viste kun ét dyr moderat (MDC) eller dårligt differentieret karcinom (PDC) på dette tidspunkt. Disse data tyder på, at UA har potentialet til at blive brugt som et kemoforebyggende middel.

UA forhindrer progression fra PIN til prostatakræft

For at afgøre, hvorvidt UA kan forhindre progression fra PIN til prostatacancer, blev 12-uger gamle TRAMP-mus fodret med kontrol- eller UA (1%, vægt /vægt) beriget kost i 6 uger og derefter aflivet efter 18 uger (fig. 1A, gruppe 2). Ved 18 ugers alderen, DLP af TRAMP-mus udviste højere forekomst af LG-PIN, HG-PIN, WDC og MDC (figur 2A, i . Ii) i forhold til dem, der observeres mod yngre aldre (Fig 1B C). Der blev ikke observeret signifikante ændringer i udseende, kropsvægt og fødeindtagelse mellem Gruppe 2 mus og deres kontrol. Der var imidlertid en mærkbar men statistisk insignifikant formindskelse i den våde vægt af prostata med sædblærerne i UA fodret mus (data ikke vist). UA-behandling reducerede forekomsten af ​​LG-PIN med 60%, HG-PIN med 40% og WDC med 40% (fig. 2A, iii) .Samlet, der var en mærkbar ændring i retning af de højere forekomster af ikke-kræft DLP i UA-behandlede mus

A, H . E farvede del af DLP i gruppe 2 kontrol (i) og UA-behandlet (ii) TRAMP prostata. Pil viser LG-PIN, hak højre pil indikerer HG-PIN, og blokere højre pil indikerer WDC. (Iii) Bar diagram viser forekomsten af ​​LG-PIN, HG-PIN, WDC, MDC og PDC i DLP af kontrol og Gruppe 2 mus. Reduktioner i PIN-kode, WDC og MDC blev observeret efter UA behandling. B, H Arrow hoved indikerer MDC og chevron indikerer PDC. C, Western blot af pSTAT3, Pakt, pIKKα /β, og p65 proteiner i DLP i gruppe 1, 2 og 3 mus. DLP lysater blev fremstillet og immunoblotting blev udført som beskrevet i Materialer og Metoder. Lige protein lastning for Pakt og pIKKα /β blev bestemt ved stripning og sondering for total AKT og IKKα blev p65 og STAT3 blots strippet og testet igen for β-actin til at bestemme lige protein belastning. Bandet densitet blev kvantificeret under anvendelse Billede J software. NT = ikke-TRAMP-mus; T = TRAMP kontrol; T + UA = UA-behandlede TRAMP-mus.

UA undertrykker væksten af ​​etablerede prostatakræft

in vivo

For at afgøre, om UA kan undertrykke væksten af etableret prostatacancer blev 24 uger gamle TRAMP-mus fodret med en kontrol eller UA (1%, vægt /vægt) beriget kost i 12 uger og derefter aflivet ved 36 uger (fig. 1A, Group 3). I denne alder, visuel undersøgelse af bughulen klart afsløret forstørrede sædblærer, DLP og andre prostata lapper i kontrol- TRAMP-mus. DLP viste højere forekomst af WDC, MDC og PDC sammenlignet med dem, der observeres ved yngre aldersgrupper, hvilket antyder, at et flertal af de dyr havde kræft i DLP (Fig 2B, i . Ii). I modsætning hertil viste UA-behandlede TRAMP mus reduceret forekomst af HG-PIN med 40%, WDC med 60%, MDC med 40%, og PDC med 20% (fig. 2B iii). Samlet set viste resultaterne, at UA-behandlede mus viste ikke-kræft læsioner spænder fra LG-PIN og HG-PIN til normal stroma sammenlignet med 100% forekomst af prostatacancer i kontroldyr TRAMP-mus.

UA inhiberer aktiveringen af AKT, IKKα /β, NF-KB og STAT3 i DLP af TRAMP mus

Vi har for nylig rapporteret, at UA kan hæmme AKT, IKKα /β, NF-KB og STAT3 aktivering i androgen afhængig og uafhængig prostatacancer cellelinier [18]. I denne undersøgelse har vi yderligere undersøgt virkningerne af UA beriget kost på aktiveringen af ​​pro-inflammatoriske mediatorer i DLP af TRAMP-mus (fig. 1A). Som vist i fig. 2C, progressiv stigning i phospho (p) -Akt, -pIKKα /β, pSTAT3, og p65-ekspression blev observeret fra gruppe 1 til gruppe 3 TRAMP mus som kræft gradvist udviklet sig fra LG-PIN dannelse i gruppe 1 ved 4-12 uge gamle, HG-PIN og WD karcinom i DLP i gruppe 2 på 12-18 uger af alder, og WDC, MDC og PDC på 24-36 uger gamle. Aldersmatchede ikke-TRAMP C57BL /6 mus, der anvendes som negative kontroller, viste ikke nogen ændring i niveauet af disse proinflammatoriske proteiner. Interessant observerede vi, at UA behandling resulterede i ca. 40-50% inhibering i ekspressionen af ​​disse phosphorylerede proteiner i DLP af gruppe 2 og gruppe 3 i sammenligning med ubehandlede TRAMP-mus, mens kun et lille fald blev observeret i gruppe 1 (fig . 2C). Niveauerne af den ikke-phosphorylerede AKT og IKKα blev minimalt påvirket af UA-behandling (fig. 2C). Tilsammen vores data tydeligt, at undertrykkelsen af ​​pro-inflammatorisk AKT, NF-KB og STAT3-aktivering spiller en rolle ved inhibering af progressionen af ​​prostatacancer i TRAMP mus ved UA.

UA inhiberer serum TNF -α og IL-6-niveauer i TRAMP mus Salg

TNF-α og IL-6 er pro-inflammatoriske cytokiner, og betragtes som vigtige biomarkører for inflammation. Gruppe 1, 2 og 3 mus sammen med deres kontroller blev aflivet ved afslutningen af ​​hver behandling protokol; blod blev opsamlet via hjertepunktur. Det opnåede serum blev evalueret for niveauerne af TNF-α og IL-6 under anvendelse af et ELISA-kit. Både TNF-α og IL-6-niveauer steg fra gruppe 1 til gruppe 3 svarende til stigende alder og stadier af cancer progression (fig. 3A). UA-behandling faldt betydeligt serum TNF-α i gruppe 2 (ved -90%) Gruppe 3 (-30%) (fig. 3A, i) samt serum IL-6 i alle tre grupper ved ~40-90% ( fig. 3A, ii).

A. Undertrykkelse af serum TNF-α (i) og IL-6 (ii) ved UA-behandling. Grupper 1-3 mus blev behandlet som beskrevet i Materialer og Metoder. Sandwich-ELISA-assay blev udført som pr producenternes instruktioner (R 0,05). B, Immunohistokemisk analyse af cyclin D1, caspase 3 og COX-2 i tumorvæv i gruppe 3 TRAMP-mus. DLP tumorvæv, indlejret i paraffinblokke, blev skåret i 5 um vævssnit og probet for cyclin D1, caspase 3 og COX-2 immunoreaktiviteter som beskrevet i Materialer og Metoder. UA-behandling (1% vægt /vægt) faldt ekspressionen af ​​cyclin D1 og COX-2, men steg caspase-3-ekspression i sammenligning med kontroller. Billeder blev taget ved anvendelse af et Olympus BX51 mikroskop (forstørrelse, 20 ×). Positive celler (brune) blev kvantificeret under anvendelse Image-Pro plus v6.3 softwarepakke (Media Kybernetik, Inc.).

UA undertrykker udtryk for cyklin D1, COX-2 og caspase-3 i DLP af TRAMP mus

Vi næste undersøgt forskellige genprodukter, der er involveret i kræft progression (COX-2), proliferation (cyklin D1) og apoptose (caspase-3) ved immunhistokemi i DLP af gruppe 3 TRAMP-mus. Som vist i fig. 3B, UA-behandling reducerede antallet af celler farvet positive for cyclin D1 fra 31% til 3% og COX-2 fra 89% til 27%. Som forventet ekspressionen af ​​caspase-3 steg fra 6% til 95%. Disse resultater viser klart indikeret, at inhibering af multiple genprodukter involveret i tumorudvikling og induktion af apoptose bidrager til de potente anti-tumor aktiviteter UA som observeret i TRAMP tumorvæv.

UA undertrykker tumorvækst og øger overlevelsen af TRAMP mus

for at afgøre, om UA kan undertrykke væksten af ​​etablerede prostatakræft, 24 uger gamle TRAMP-mus blev fodret med en kontrol eller UA (1%, w /w) beriget kost i 12 uger og derefter aflivet ved 36 uger (fig. 1A, Group 3). Den våde vægt af prostata med sædblærer viste signifikante forskelle i vægten af ​​hele prostatakirtlen. En signifikant (P 0,05) forskel i tumorvolumen blev observeret i UA-behandlede mus (figur 4A.). Vi fandt også, at den langsigtede fodring af UA beriget kost er sikkert uden nogen organ eller væv toksicitet med minimal virkning på kropsvægt (fig. 4B). Hele 36 ugers perioden, alder matchede ikke-transgen C57BL /6-mus blev anvendt som en negativ kontrol, som viste ingen af ​​de træk forbundet med prostatacancer observeret i TRAMP-mus. Alle data præsenteres på effekten af ​​UA-behandling i TRAMP mus (Grupper 1 til 3) er i overensstemmelse med overlevelse data indikerer, at en sådan behandling væsentligt kan forlænge levetiden for mus (fig. 4C). Foruden gruppe 1, 2 og 3, en 4. gruppe af TRAMP-mus blev fodret med UA beriget kost i 36 uger fra 4 ugers alderen (gruppe 4); kontrolgrupper modtog normal kost (fig. 1A). Musene blev scoret på dødstidspunktet baseret på tumor byrde. Kaplan-Meier-overlevelse parceller blev genereret for at bestemme den samlede overlevelse. Log-rank (Mantel-Cox) parceller viste stigninger i den samlede overlevelse mus i alle UA-behandlede grupper. Median overlevelse af mus i kontrolgruppen var 55 uger, sammenlignet med 75 uger for gruppe 1 og gruppe 2, og 72 uger for Group 4 (P 0,05). I gruppe 3, den mediane overlevelse var 68 uger, men ikke nåede statistisk signifikans (fig. 4C). Derfor kan det konkluderes, at UA-behandling er mest effektiv, når den blev påbegyndt tidligt når TRAMP-mus viste ingen kræft eller kun tidlige stadier af PIN udvikling.

A blev mus aflivet ved 36 uger og tumorvolumen blev målt som beskrevet i Materiale og fremgangsmåder. Fejl- søjler repræsenterer SEM. * Statistisk signifikans (P 0,05). B, Kropsvægt af Grupper 1-3 TRAMP mus og deres kontrol. C, Virkningen af ​​UA-behandling på overlevelsen af ​​TRAMP-mus lang sigt. Kaplan-Meier overlevelse analyse blev udført til kontrol og UA-behandlede TRAMP mus. Median overlevelsestid var 55 uger for kontrol (n = 5). Median overlevelsestid for gruppe 1, gruppe 2, gruppe 3 og gruppe 4 var 75, 75, 68, og 72 uger, hhv. Samlet signifikans blev bestemt ved anvendelse log-rank (Mantel-Cox) test. UA beriget kost væsentligt forlænget overlevelse.

Påvisning af UA i serum

UA blev påvist i serum af alle 3 grupper af TRAMP-mus fodret med UA beriget kost. Koncentrationerne detekteret varieret fra ca. 600 til 1300 ng /ml med nogen statistisk signifikans mellem grupperne (fig. 5B). Som var forventet UA serumniveauer at have nået steady state koncentration i alle tre grupper, forskellene i koncentration afspejles dermed individuelle variationer. Uden ekstra toppe blev detekteret i serummet, hvilket indikerer, at UA ikke frembringer metabolitter (fig. 5A III og IV). Vores undersøgelse præsenterer den første eksperimentelle beviser for, at UA absorberes godt efter oral fodring og serumkoncentrationerne opnåede er tilstrækkelige til at fremkalde biologiske effekter som tydeligt ved hæmning af prostata tumorvækst i TRAMP-mus.

A, (i) Ion kromatogrammer af serum ekstrakter fra mus, der ikke havde modtaget UA (blank). (Ii) Fuld scanning spektrum viser m /z top med en molekylmasse på 469 svarer til intern standard (IS) glycyrrhetinsyre. (Iii) Fuld scanning spektrum viser m /z top med en molekylmasse på standard UA ved 455 og er på 469 og (iv) Fuld scanning spektrum af prøven, retentionstid var 1,7 og 1,96 min for henholdsvis både IS og prøve. Kromatogrammerne er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter. B, blev Serumkoncentrationer af UA beregnet ved hjælp Analyst software 1.4.2 fra den lineære regressionsligning af toparealforholdet mod koncentrationen af ​​kalibreringskurven. Fejl søjler repræsenterer SEM.

Diskussion

TRAMP musemodel er en veletableret spontant at udvikle prostatakræft model, der efterligner naturlige prostata tumor progression, fra PIN til yderst invasiv metastatisk prostatacancer [ ,,,0],20] i mennesker. I TRAMP-mus, tumor stammer fra både DLP og ventral prostata (VP) som følge af Tag-ekspression, der primært er begrænset til de prostata lapper [22], mens human prostatacancer stammer fra den perifere zone, der svarer til DLP hos mus [23]. Anticancer virkningerne af forskellige kemoforebyggende midler, herunder oleanolsyre analoger, sulforaphane, polyphenoler opnået fra grøn te, hvidløg bestanddele, curcumin, 3, 3′-diindolylmethane og genistein er blevet vurderet tidligere på spontant udvikler prostata tumorigenese i TRAMP-mus [24], [25], [26]. Desuden er lycopen, γ-tocopherol, silbinin og tomat beriget kost alle vist sig at forøge overlevelsen og forsinke progression fra pinkode til adenokarcinom og mindske forekomsten af ​​dårligt differentieret carcinom [23], [27], [28], [ ,,,0],29], [30]. Imidlertid har chemoprevention studie med UA i prostatakræft modellen ikke blevet udført tidligere, og kun vores gruppe har for nylig rapporteret for første gang, at UA beriget kost kan faktisk hæmme prostata tumor metastase ved at modulere de CXCR4 /CXCL12 akse i TRAMP mus [19 ]; selv om det ikke blev vurderet effekten af ​​UA på tumor udvikling og progression. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi effekten af ​​UA behandling på tre forskellige stadier af udvikling af cancer i TRAMP-mus. Vi fandt, at UA signifikant kan inhibere kræft udviklingen og progressionen på alle tre faser. I gruppe 1 mus, observerede vi målbare undertrykkende effekter af UA på PIN udvikling, mens der i Gruppe 2 mus, blev udvikling af høj PIN kvalitet hæmmes, hvilket fremgår af reduktionen i godt differentieret PIN-kode. Desuden UA hæmmede signifikant progressionen af ​​præ-neoplastisk PIN i DLP og tumor volumen uden observerbare bivirkninger i Gruppe 3 mus. Udviklingen af ​​en overflod af ikke-kræft læsioner i denne gruppe i modsætning til overvægten af ​​kræft i kontroldyr TRAMP mus er indlysende. Resultater af histologisk klassificering endvidere foreslået, UA overvejende kan hæmme udviklingen af ​​præcancerøse læsioner i de fleste mus og derved forebygge udvikling af meget invasive maligne læsioner. UA også signifikant øget overlevelse på så meget som 20 uger forsinket progression fra PIN til adenocarcinom, og faldt forekomsten af ​​PDC.

Desuden observerede vi, at de anti-proliferative og pro-apoptotiske virkninger af UA er forbundet med undertrykkelse af cyclin D1 og COX-2 og inhiberingen af ​​NF-KB, STAT3, AKT og IKKα /β-aktivering i prostata af TRAMP-mus. Sådan inhibering korreleret med længden af ​​fodring periode som tydeligt ved væsentligt større inhibering i gruppe 3 mus, der modtog UA kontinuerligt for12 hinanden følgende uger. Reduktionen i TNF-α og IL-6-niveauer også korreleret med længden af ​​behandlingsperioden. Undertrykkelsen af ​​cyclin D1 og COX-2 kan meget vel være en konsekvens af den reducerede aktivering af NF-KB og STAT3 da disse proinflammatoriske transkriptionsfaktorer regulere ekspressionen af ​​cyclin D1 og COX-2 [2], [3], [ ,,,0],31]. Øget caspase-3-ekspression er indikativt for apoptose. Taget sammen viser disse resultater tyder klart, at inhibering af celleproliferation og stigningen i apoptose spiller en central rolle i UA-medieret inhibering af prostata tumor progression i TRAMP-mus. Den omstændighed, at UA blev detekteret i alle serumprøver i betydelige koncentrationer indikerer yderligere, at UA absorberes godt og oral indgift kan betragtes som en foretrukken indgivelsesvej for en potentiel kemoforebyggende og terapeutisk middel til prostatacancer. Derfor kan det konkluderes, at UA-behandling inhiberede progressionen af ​​pinkode til adenocarcinom, reducerede tumorvækst og også forlængede overlevelsen af ​​mus. Tilsammen indikerer disse resultater, at UA kan have et enormt potentiale til anvendelse som et kemoforebyggende middel samt et lovende middel til prostatacancer behandling.

Sammenfattende vores data viser tydeligt, at UA fodring forsinker progression af prostata kræft i mus gennem modulering af forskellige pro-inflammatoriske molekyler. Fordi TRAMP er en spontan model for prostatakræft, der nøje efterligner progressive former for menneskelig sygdom, resultaterne af denne undersøgelse giver et godt grundlag for at forfølge yderligere undersøgelser om brugen af ​​UA enten alene eller i kombination med anden behandling til forebyggelse og /eller behandling af prostatacancer.

Materialer og metoder

Reagenser

UA (98% rent) blev købt fra Guangxi Changzhou Naturprodukter Development Company Ltd (Kina). UA blev blandet med normalt muse kost ved 1% vægt /vægt og opbevaret ved 4 ° C. Tris, glycin, NaCI, SDS, glycyrrhetinsyre og β-actin-antistof blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) og HRP-konjugeret sekundært antistof blev opnået fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Antistoffer mod phospho-STAT3 (Tyr 705), phospho-AKT (Ser 473), STAT3 blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Antistoffer mod AKT, p65, phospho-specifik IKKα /β (Ser 180 /Ser 181), og IKKα blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). TNF-α og IL-6 ELISA-kits indkøbtes fra Research Instruments (MA, USA). Bradford reagens blev indkøbt fra Bio-Rad (Hercules, CA). Immunhistokemi farvningssæt blev købt fra Dako (Danmark).

TRAMP mus avl og genotyping

Dyreforsøg blev gennemført i overensstemmelse med Singapore NACLAR retningslinjer (lov fra november 2004) til laboratoriebrug dyr og pleje og godkendt af NUS Institutional Animal care og brug Udvalg protokol nummer 052/09. Kort fortalt blev 4 uger gamle TRAMP hunmus købt fra The Jackson Laboratory parret med C57BL /6 mandlige på NUS CARE (Singapore). Hvalpene blev genotypebestemt for transgenet (Tag) ved 3 ugers alderen; DNA blev ekstraheret fra halen saksen hjælp TRIZOL® reagens (Invitrogen, USA) og kvantificeres ved hjælp af NanoDrop spektrofotometer (Thermo Scientific, USA). Et ug af DNA’et blev taget til PCR-analyse. Polymerasekædereaktion (PCR) Reaktionsblandingen indeholdt 10 pi 5 x QIAGEN PCR-buffer, 1 pg DNA, 0,6 uM hver af forward og reverse primere, 2 pi dNTP-blanding og 1 pi Taq polymerase enzym i et endeligt volumen på 50 pi. Primere anvendt til genotypebestemmelse, forward primer: 5′-CCG GTC GAC CGG AAG CTT CCA CAA GTG CAT TTA-3 ‘, reverse primer: 5′-AGG CAT TCC ACC ACT GCT CCC ATT CAT C-3’. PCR-betingelserne var 94 ° C i 3 minutter, 94 ° C i 30 sek, 62 ° C i 1 min, 72 ° C i 1 min, gentag trin 2-4 i 35 cykler, 72 ° C i 2 minutter og holdes ved 4 ° C. PCR-produkter blev kørt på 1% agarosegel indeholdende 1 × GelRed nukleinsyre gel plet fra Biotium (Hayward, CA). Farvede bånd blev visualiseret under UV-lys og fotograferet under anvendelse Biorad Gel Doc EZ-systemet (Bio-Rad, USA). Transgenpositivt unger blev derefter anvendt til de efterfølgende eksperimenter.

Patologisk sortering af tumorvæv

Den patologiske sortering af TRAMP prostatakræft blev udført i overensstemmelse med klassificeringssystem beskrevet tidligere [22]. Prostata læsioner i DLP blev histologisk klassificeret som normale (kanal foret med enkelt lag af sekretoriske epitelceller omgivet af to eller tre cellelag i fibrousmuscular stroma), lav kvalitet prostata intraepitelialneoplasi (PIN) [epitelceller med variabelt aflange kerner med kondenseret kromatin], high-grade PIN (epitelial lagdeling og tufting, tilstedeværelse af mikropapillær og cribiform strukturer), veldifferentieret carcinom (WDC) (epitelceller invaderer fibromuskulær stroma), og moderat differentieret (MDC) til dårligt differentieret (PDC) adenocarcinom prostata (ark neoplastiske celler med lidt eller ingen kirtelstrukturer). 15 tilfældigt udvalgte mikroskopiske felter på hæmatoxylin og eosin (H Gruppe 2: 12 uger gammel TRAMP-mus blev fodret med UA beriget kost i 6 uger; Gruppe 3: 24 uger gamle TRAMP-mus blev fodret med UA beriget kost i 12 uger. Kontrol TRAMP mus modtog normal kost. Legemsvægt og tumorstørrelse blev registreret to gange hver uge og tumorstørrelsen blev bestemt ved Vernier caliper og beregnet efter formlen [længde × (bredde)

2] /2. Mus blev aflivet ved CO

2 inhalation efterfulgt af cervikal dislokation. Blodprøver, indsamlet ved hjertepunktur blev holdt ved 4 ° C natten over og centrifugeret ved 10.000 rpm i 20 min for at opnå serum, som blev opbevaret i portioner ved -80 ° C. Tumorvolumen blev målt og vejet. Prostata blev microdisected fra sædblærerne under et stereomikroskop, fikseret i 10% phosphatpufret formalin i H & E og immunhistokemisk analyse

ELISA assay for TNF-α og IL-6

Lagret. serumprøver blev analyseret for TNF-a og IL-6-niveauer under anvendelse af ELISA-kit (R & D Systems, USA) ifølge producentens instruktioner. Sandwich ELISA protokoller blev anvendt og kalibrering blev udført med standard TNF-α og IL-6 tilvejebragt i kittet.

Western blotting

dorsolaterale prostata tumorvæv blev lyseret i lysisbuffer indeholdende (20 mM Tris (pH 7,4), 250 mM NaCl, 2 mM EDTA (pH 8,0), 0,1% Triton X-100, 0,01 mg /ml aprotinin, 0,005 mg /ml leupeptin, 1 mM PMSF, og 4 mM NaVO4). Lysater blev derefter centrifugeret ved 13.000 rpm i 10 minutter til fjernelse af uopløseligt materiale og 50 ug protein blev opløst på en 10% SDS gel. 5A.