PLoS ONE: Overekspression af MicroRNA miR-30a eller miR-191 i A549 Lung Cancer eller BEAS-2B Normal Lung cellelinier Ændrer ikke Fænotype

Abstrakt

Baggrund

MikroRNA’er (miRNA) er små, ikke-kodende RNA (ribonucleinsyrer), som regulerer oversættelse. Adskillige miRNA har vist sig at ændres i hele cancervæv sammenlignet med normalt væv, når kvantificeret ved mikroarray. Baseret på tidligere sådanne beviser for differentieret udtryk, vi valgte at studere den funktionelle betydning af miRNA

miR-30a

-191

ændringer i menneskelig lungekræft.

Metode /vigtigste resultater

den funktionelle betydning af miRNA

miR-30a

-191

blev undersøgt ved at skabe stabile transfektanter af lungen adenocarcinom cellelinje A549 og udødeliggjort bronchial epitelcelle line BEAS-2B med beskedne overekspression af

mIR-30a

eller

-191

anvendelse af en lentiviral system. Sammenlignet med de tilsvarende kontroller, begge cellelinier overekspression

miR-30a

eller

-191

ikke viser nogen væsentlige ændringer i cellecyklus distribution, celleproliferation, vedhængende kolonidannelse, blød agar koloni dannelse, xenograft dannelse i en subkutan SCID musemodel, og narkotika følsomhed over for doxorubicin og cisplatin. Der er en beskeden stigning i celle migration i cellelinjer overekspression

miR-30a

forhold til deres kontroller.

Konklusioner /Betydning

Overekspression af

miR-30a

eller

-191

ikke fører til en ændring i cellecyklus, spredning, xenograft dannelse, og kemosensitivitet af A549 og BEAS-2B-cellelinjer. Brug microarray data fra hele tumorer at vælge bestemte miRNA til funktionel undersøgelse kan være en suboptimal strategi

Henvisning:. Patnaik SK, Kannisto E, Yendamuri S (2010) Overekspression af MicroRNA

miR-30a

eller

miR-191

i A549 Lung Cancer eller BEAS-2B Normal Lung cellelinier Ændrer ikke fænotype. PLoS ONE 5 (2): e9219. doi: 10,1371 /journal.pone.0009219

Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: 11. december 2009; Accepteret: 24 Januar 2010; Publiceret: 15 feb 2010

Copyright: © 2010 Patnaik et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er støttet af forskningsbevillinger fra thorax kirurgisk Foundation for forskning og uddannelse og Kræft og leukæmi Gruppe B; SY understøttes af et fællesskab fra Buswell Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

betydningen af ​​ikke-kodende RNA i reguleringen af ​​cellulære processer er kommet for at blive mere og mere værdsat [1]. De bedst undersøgte ikke-kodning RNA er microRNA (miRNA), 18-25 nt lange lille RNA, epigenetisk regulere oversættelse ved binding til en supplerende “frø” sekvens fælles for deres “mål” mRNA [2]. Da denne komplementaritet ikke at være perfekt, kan en enkelt miRNA regulere ekspressionen af ​​flere hundrede gener samtidigt [3]. Eksplosionen af ​​microarray-teknologi har ført til dens anvendelse i miRNA genomforskning. Derfor, før funktionen af ​​en betydelig del af miRNA var kendt, miRNA profilering af adskillige normale og unormale humane væv er blevet udført [4]. Den tydelige forskel mellem de opnåede data mellem miRNA profilering og mRNA profilering er i størrelsen af ​​forskellen udtryk ses i sammenligning grupper. Mens adskillige fold ændringer almindeligvis ses i mRNA-ekspression under anvendelse af disse teknologier, fold ændringer med miRNA eksperimenter er mere beskedne og er typisk i 1- til 2-fold range. Derfor eksperimenter for at studere den biologiske relevans af disse beskedne fold ændringer er vigtige at vurdere betydningen af ​​disse ændringer. Baseret på tidligere offentliggjorte miRNA microarray data, som viser forskelle i ekspression i humane cancere sammenlignet med den tilsvarende normale væv blev to miRNA valgt i denne undersøgelse for sådanne biologiske eksperimenter. Disse to miRNA blev valgt på grund af konsekvente ændringer i deres udtryk mellem normal og kræft væv af forskellige organer, en bio-informatik analyse af deres forudsagte mål, foreslog vigtige roller i celleproliferation og migration og lidt offentliggjorte arbejde på deres funktionelle roller i lungekræft .

mIR-30a

ligger på human kromosom 6q.13 og er genereret fra en intron transkriptionel enhed, der producerer tre miRNA:

miR-30a

,

-30C

og

-30e

[5]. To modne former af genet eksisterer –

miR-30a-3p

miR-30a-5p

. Flere undersøgelser har påvist ændringer i

miR-30a

udtryk i human cancer. Calin et al. viste en nedregulering af

miR-30a

i kronisk lymfatisk leukæmi (CLL) patienter [6]. Tilsvarende

miR-30a

nedreguleres i lungekræft [7], tyktarmskræft [8], pancreascancer [9], metastatisk leverkræft (sammenlignet med primær) [10] og i akut myeloid leukæmi (AML) patienter med ved (11q23) translokation (sammenlignet med andre AML-patienter) [11].

MIR-30a

er vigtig for udviklingen af ​​det præfrontale cortex via regulering af hjerne-afledt neurotrofisk faktor (BDNF) [12] og i hvirveldyr hepatobiliære udvikling [13]. Andre eksperimentelt bekræftet mål for

miR-30a

er adenylatkinase (AK1) og GW182 protein (Tnrc6a), en komponent af RNA-interferens tavshed komplekse [13].

MiR -191

ligger på human kromosom 3p21.31 og er genereret fra en intron transkriptionel enhed, der kan producere to miRNA:

miR-191

-425

[5]. Kun en enkelt modne form af

MIR-191

vides at eksistere.

MIR-191

udtryk er opreguleret i bugspytkirtlen [14], tyktarms-, lunge- og prostatakræft [7] kræftformer. Det er også opreguleret i AML-patienter med unormale karyotyper [11], og nedreguleret i patienter med CLL [6].

MIR-191

udtryk også ændres i lungerne udsættes for cigaretrøg [15]. Ingen mRNA mål for

miR-191

er blevet eksperimentelt verificeret.

I denne undersøgelse vi evaluerer de fænotypiske ændringer ses af konstitutiv overekspression af

miR-30a

-191

, på en lunge-adenocarcinom-cellelinje (A549) [16], og en udødeliggjort bronkial epitelcellelinje (BEAS-2B) [17]. A549-cellelinien blev valgt på grund af tilstedeværelsen af ​​en stor mængde eksperimentelle data på dens anvendelse i forskellige assays. Den BEAS-2B-cellelinien blev valgt, fordi det er den immortaliserede cellelinie tættest på normal bronchial epitel. Da virkningerne af overekspression af et microRNA er kontekst-specifikke, vi sammenlignede ændringer i fænotype af maligne og non-maligne celler.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle in vivo studier blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for Roswell Park Cancer Institute.

Cell Culture

A549 menneske bronchioloalveolar lunge carcinoma og BEAS-2B normale bronchieepithelceller cellelinjer var opnået fra ATCC @ (Manassas, VA). Celler blev dyrket henholdsvis i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (+ DMEM; Invitrogen®, Carlsbad, CA) med 10% føtalt bovint serum (PAA Laboratories®, Østrig), og LHC-9-medium (Invitrogen®) ved 37 ° C i 5% CO

2. Stabilt-transficerede celler blev dyrket i nærvær af 2 ug /ml puromycin (Roche®, Indianapolis, IN).

Dannelse af stabilt transficerede cellelinjer

enkeltstrengede DNA-oligonukleotider med human

pre-miR-30a

eller -191

(miRBase tiltrædelse af iD’er MI0000088 og MI0000465 henholdsvis)

sekvenser og med restriktionsenzymsted udhæng blev opnået fra Integrated DNA Technologies® (Coralville, IA). Komplementære sekvenser blev annealet og den resulterende dobbeltstrengede DNA blev ligeret til XhoI /Notl-fordøjet pLemiR ™ vektor (Open Biosystems®, Huntsville, AL). A549-celler blev derefter inficeret med plasmider under anvendelse af Trans-Lentiviral ™ GIPZ pakkesystem (Open Biosystems, Huntsville, AL) ifølge fabrikantens protokol. Kort fortalt blev TLA-HEK293TTM celler transficeret under anvendelse Arrest-In ™ med 37,5 ug plasmid-DNA i serumfrit medium i 4 timer. Medium blev derefter erstattet med serum indeholdende medier i 36 timer. Medier blev opsamlet, centrifugeret for at fjerne cellerester og anvendes til transfektion af A549 og BEAS-2B-celler. Otteogfyrre timer efter tilsætning af virus, blev transficerede celler selekteres ved tilsætning af 2 ug /ml puromycin til vækstmediet.

Real Time RT-PCR (qPCR) til kvantificering af små RNA’er

I alt RNA (20 ng), isoleret fra celler under anvendelse PureLink ™ Micro-til-Midi total RNA isolation kit (Invitrogen) ifølge producentens protokol, var revers transskriberet under anvendelse af TaqMan ™ revers transkription kit (Applied Biosystems®, Foster City, CA) og RNA-specifikke primere forsynet med TaqMan ™ microRNA assays (Applied Biosystems®) i 15 pi, med annealing ved 16 ° C i 30 minutter efterfulgt af forlængelse ved 42 ° C i 30 minutter. 1,33 pi af RT-reaktionen blev derefter brugt med 1 gl specifikke primere til enten

RNU6B

,

miR-30a

, eller

miR-191 Hotel (Applied Biosystems®, Foster city, CA) i tredobbelte brønde for 44-cycle PCR på en 7900HT thermocycler (Applied Biosystems®). Den denatureringstrin ved 95 ° C var i 15 s, og annealing og ekstension trin ved 60 ° C var i 1 min. SDS software (Applied Biosystems®, Foster City, CA) blev anvendt til bestemmelse cyklus-tærskel (CT) værdier af fluorescensen måles under PCR. Prism 5.0b software (GraphPad®, La Jolla, CA) blev anvendt til statistisk analyse og graftegning

Pathway Enrichment Analyse

offentligt tilgængelige miRgator software (http: //genome.ewha.. ac.kr/miRGator/miRGator.html) blev anvendt til at udføre pathway berigelse analyse. De specifikke miRNA udvalgte var

miR-191

–

30a-5p

. Målet udvælgelsesalgoritme valgt var Miranda [3]

celleproliferationsassay

celleproliferation assays blev udført ved anvendelse af Cell Titer 96® kit. (Promega, Madison, WI), som anvender omdannelsen af MTS (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium, indre salt) til formazan at måle cellernes levedygtighed. Kort beskrevet blev celler udpladet på 96 brønds plader med 4.000 celler i 100 pi per brønd. Celler blev høstet i fire eksemplarer på forskellige tidspunkter i 150 timer. Til de høstede celler, blev 20 pi assayreagens tilsat, og levedygtige celler blev målt ved absorbans ved 450 nm en time senere på en Multiskan Plus (MTX Lab Systems, Vienna, VA) pladelæser. Absorbansværdier blev normaliseret til medier kontrol.

Adhærerende kolonidannelse

Celler i kultur blev trypsinbehandlet og udpladet in duplo i 6-brønds plader ved 200 og celler per brønd for A549 og 500 celler pr for BEAS-2B-cellelinje derivater hhv. Cellerne fik lov at vokse ved 37 ° C, 5% CO2 med medier skifter hver 3-4 dage, indtil kolonierne var synlige med det blotte øje. Medier blev opsuget, og cellerne blev farvet med 0,2% methylenblåt i 40% methanol i 30 minutter. Celler blev vasket og plader blev scannet ved hjælp af en Epson Perfection V700 Photo scanner som en åbenhed. Kvantificering af kolonier blev udført ved hjælp af ImageJ software (Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda).

Soft Agar Colony Formation Assay

Base agar /media mix blev sat til 6-godt plader (slutkoncentration på 0,7% agar, 1x + DMEM, 10% FBS, 2 ug /ml puromycin) til at coate pladen og tillades at polymerisere. Celler suspensioner blev gjort til 100 celler /ml i medium /agar blanding (slutkoncentration på 0,35% agar, 1x + DMEM, 10% FBS, 2 ug /ml puromycin). 1,5 ml af cellesuspensionen blev udpladet på toppen af ​​basen agar i hver brønd og fik lov til at polymerisere. 2 ml komplet medium blev tilsat på toppen af ​​agar gang polymeriseres. Pladerne blev sat i 37 ° C, 5% CO2, og overlay medier blev udskiftet hver 3-4 dage. Kulturer blev dyrket, indtil et par kolonier var synlige med det blotte øje, 2 mg /ml thiazolylblåt tetrazoliumbromid i PBS blev tilsat til cellerne, og blev returneret til inkubatoren, indtil kolonier blev plettet. Når kolonier blev farvet blå, blev pletten fjernet fra brøndene og billeder blev taget ved hjælp af Cannon Powershot A590IS kamera.

In Vitro Scratch Assay

For at estimere forskelle i celle migration, en in vitro ridse blev udført. Trådkorset blev trukket i bunden af ​​6-brønds plader til orientering til billeddannelse. Celler blev udpladet i tredobbelte brønde på ved høj tæthed at nå 100% sammenløb 24 timer senere. En ridse blev derefter gjort direkte ud til lodret linie på pladen under anvendelse af moderat og ensartet tryk ved anvendelse af en 10 pi spids og pladen låget som en lige kant. Ridser blev afbildet med det samme på en Axio Observer mikroskop (Zeiss, Maple Grove, MN) på 5x forstørrelse og orientering til trådkorset noteret. Cellerne blev derefter returneret til 37 ° C, 5% CO2 og afbildet på forskellige tidspunkter, indtil alle ridser blev lukket.

xenograft Dannelse Assay

Alle in vivo-undersøgelser blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for Roswell Park Cancer Institute. Kontrol og over-udtrykkende A549-cellelinier (6,0 × 105 celler) blev injiceret subkutant mellem skulderbladene på 4-5 uger gamle SCID-mus (5 mus i hver kohorte). Tumorer blev monitoreret 2-3 gange ugentligt tykkelsesmålinger indtil den største tumoren var 2 cm i længste retning, hvorefter alle mus blev aflivet. Tumorer blev dissekeret og vejet.

Cell Cycle Analysis

Celler dyrket til 70% -90% konfluens blev løsnet ved trypsinbehandling, fikseres i 70% ethanol ved 4 ° C i 1-2 dage, vasket med PBS, og inkuberes ved en densitet på 1-2 x 10

6 celler /ml med 0,3 uM 4,6-diamidino-2-phenylindol, dihydrochlorid (DAPI; MP Biochemicals®, Solon, OH) i PBS ved rum temperatur i mørke i 100 min. Efter vask en gang med PBS, blev DAPI fluorescens fra celler analyseret ved flowcytometri under anvendelse af en LSR II (BD Biosciences®, San Jose, CA) instrument udstyret med en 408 nm violet laserdiode og en 450/50 nm emission filter.

Drug Sensitivity Assay

Efter cellerne blev dyrket til 50% -60% konfluens i 96-brønds plader (5 brønde pr cellelinje), blev mediet erstattet med det, der indeholder 1 ug /ml doxorubicin-hydrochlorid (Enzo Life Sciences®, Farmingdale, NY) eller cisplatin (Calbiochem®, San Diego, CA). Efter 1,5-2 dages kultur blev levedygtigheden af ​​celler målt som beskrevet for celleproliferation assay og sammenlignet med dem, der ikke blev udsat for narkotika.

Resultater

Oprettelse af stabile cellelinier med overekspression af miR-30a og -191

Stald cellelinjer overekspression

miR-30a

-191

blev genereret ved hjælp af et lentiviral system, som beskrevet ovenfor.

MIR-30a

blev overudtrykt ca. 2 folde og -3 fold i både A549 (A-30a) og BEAS-2B (B-30a) sammenlignet med kontroller (A0 og B0 henholdsvis). Sammenlignet med kontroller,

MIR-191

blev overudtrykt ca. 2 fold og -7 fold i A549 (A-191) og BEAS-2B (B-191) (fig 1). Overekspression blev også bekræftet ved visualisering af RFP indeholder celler ved mikroskopi.

Expression normaliseres at styre cellelinier (A0 eller B0).

Pathway Enrichment Analyse

Target forudsigelse af Miranda algoritmen identificeret 731 mål for

miR-30a-5 p

og 570 mål for

miR-191

. De ti bedste veje identificeret af vejen berigelse analyse omfattede veje påvirker cellecyklus, celleproliferation, lægemiddelresistens og celle motilitet, blandt andre (tabel 1).

overekspression af

miR- 30a

eller

-191

ændrer ikke Foranstaltninger af spredning både in vitro og in vivo i A-549 og BEAS-2B cellelinier

Pathway berigelse analyse foreslog, at

miR -30a

og

-191

påvirket cellecyklus og celledeling. For at undersøge effekten af ​​overekspression af

miR-30a

-191

på A549 og BEAS-2B blev vækstkurver plottet baseret på målinger af cellernes levedygtighed på forskellige tidspunkter over en 150- timers periode. Ingen forskel i vækstkurverne blev set i A-30a og A-191 sammenlignet med A0 og i B-30a og B-191 sammenlignet med B0 (figur 2A, 2B). Celleproliferation i forskellige cellelinier blev også sammenlignet under anvendelse af klæbende kolonidannelse. Ingen forskel blev set i enten antallet eller størrelsen af ​​vedhængende kolonier i cellelinjer overudtrykker

miR-30a

eller

-191

sammenlignet med den tilsvarende kontrol cellelinje (Figur 2C).

A, B. Celleproliferation kurver for cellelinier A0, A-30a og A-191 (A) og B0, B-30A og B-191 (b) godtgøre nogen ændring i celleproliferation. C. methylenblåt farvede cellekulturplader demonstrerer ingen forskel i vedhængende kolonidannelse i A-30a og A-191 sammenlignet med A0 og i B-30a og B-191 sammenlignet med B0. D. xenograft dannelse i SCID mus ved A549 ændres ikke af overekspression af

miR-30a

eller

-191

.

Anchorage uafhængighed er en af kendetegnende for transformation. Vi har forsøgt at bestemme virkningen af ​​overekspression af

MIR-30a

eller

-191 til salg på forankringsuafhængig vækst af A549 og BEAS-2B-celler under anvendelse af blød agar koloni assay som beskrevet ovenfor. Alle linjer dannet meget få kolonier, der var synlige ved mikroskopi med kun 2-3 kolonier synlige med det blotte øje. Ingen forskelle blev set efter farvning eller ved mikroskopi (data ikke vist).

xenograft dannelse menes at repræsentere en biologisk relevant mål for tumor aggressivitet. Vi vurderede effekten af ​​overekspression af

miR-30a

eller

-191

på xenograft dannelse i SCID mus ved A549 celler. Sammenlignet med kontrolgruppen cellelinje (A0), behøver A-30a og A-191 ikke danne større xenografter (Figur 2D). Forøgelsen af ​​tumorvolumen over tid er også ikke anderledes i disse cellelinjer sammenlignet med kontrol (data ikke vist). Da BEAS-2B cellelinie er ikke-tumorigen, vi ikke vurdere xenograft dannelse ved hjælp B0, B-30a eller B-191.

Virkningen af ​​overekspression af

miR-30a

eller

-191

på Cell migration og Cell Cycle Fordeling af A-549 og BEAS-2B cellelinier

øget indvandring celle er en vigtig mekanisme, som menes at øge metastatiske potentiale kræftceller . Dette kan være uafhængige af celleproliferation satser. Derfor undersøgte vi effekten af ​​

MIR-30a

eller

-191 til salg på cellemigrering af A549 og BEAS-2B cellelinjer under anvendelse af scratch assay som beskrevet ovenfor. Der er en beskeden stigning i migration af A-30a og B-30a i forhold til A0 og B0 hhv. Der var ingen signifikant forskel i migreringen afstanden mellem cellelinier overudtrykker

MIR-191

sammenlignet med kontrolgrupperne cellelinjer (figur 3A).

A. Cellemigrering af A-30a og B-30a øges sammenlignet med kontroller; ingen effekt af overekspression af

miR-191

ses. B. Cell cyklus analyse af stabile transfektanter demonstrerer ingen forskel mellem celler overudtrykker

miR-30a

-191

sammenlignet med kontrolgruppen.

En undersøgelse af de forudsagte mål for

miR-30a

-191

og cellulære processer påvirket af dem viser en statistisk signifikant berigelse af enzymsystemer, der involverer cellecyklus. Derfor vi undersøgt effekten af ​​overekspression af

miR-30a

eller

-191

på cellecyklus distribution. Flowcytometri efter farvning med DAPI blev anvendt til at udføre cellecyklus analyse af alle cellelinier. Sammenlignet med kontrollerne, cellelinjer overudtrykker

miR-30a

eller

-191

ikke viser betydelige ændringer i cellecyklus distribution (figur 3B).

Over -Expression af

miR-30a

eller

-191

Ændrer ikke kemosensitivitet til doxorubicin eller cisplatin

Doxorubicin og cisplatin er almindeligt anvendte kemoterapeutiske midler. A549 er moderat følsomme over for cisplatin og doxorubicin (https://dtp.nci.nih.gov), der gør det muligt at vurdere både øget og nedsat følsomhed over for disse lægemidler. Overekspression af

miR-30a

eller

-191

ændrer ikke kemosensitivitet af A549 og BEAS-2B til enten lægemiddel (figur 4).

følsomhed A549 celler ( A, B) og BEAS-2B celler (C, D) for doxorubicin og cisplatin. Grå angiver kontrol celler.

Diskussion

miRNA ændringer almindeligt set i kræft væv i forhold til deres normale modstykker. Størrelsen af ​​disse ændringer er beskedne og deres funktionelle betydning i ukendt. En af vanskelighederne i studiet af miRNA er, at en miRNA har flere hundrede forudsagte mål og disse bio-databehandling forudsigelser er ikke særlig præcis. Også den rolle miRNA i en celle afhænger af den genetiske konstitution og transkriptomet af en celle på et givet tidspunkt og denne kompleksitet er ikke fanget blot ved deres tvungne overekspression. Men fænotypiske ændringer sekundært til tvungen overekspression kan give spor til at forstå deres bidrag til den maligne fænotype. I denne undersøgelse, genereret vi stabile transfektanter der konstitutivt over-express

miR-30a

eller

-191

og ikke demonstrere væsentlige ændringer i fænotype i de forskellige analyser, der blev udført. En række mulige forklaringer kan forklare denne mangel på ændring af fænotype. For det første er det muligt, at niveauet af ekspression af miRNA opnåede ikke er nok til at skabe en forskel. Selvom fold ændringer, der ses ved microarray eksperimenter er typisk beskedne, kan sådanne forsøg undervurdere egentlige ændringer i maligne epitelceller grund af fortynding af ændringer i maligne epitelceller ved stromale celler, der udgør en betydelig del af patologiske prøver. Også størrelsen af ​​ændringer, der ses ved mikroarrays er ofte mindre end de tilsvarende ændringer, der ses ved RT-PCR. Derfor kan de faktiske ændringer i maligne celler være mere end det opnået i vores model system. Omvendt er det muligt, at ændringer, der ses i miRNA microarrays spuriously overvurdere ændringer. For eksempel, i en undersøgelse af Peltier et al [18], der omhyggeligt vurderede flere ansøgerlande miRNA for stabilitet af udtryk på tværs af fem typer af kræft og normale væv ved RT-PCR,

miR-191

var så stabilt udtryk for, at det blev foreslået som et gen, der skal anvendes til normalisering. Dette taler imod en rolle for

miR-191

i carcinogenese. Derfor udvælgelse miRNA baseret på microarray data kan ikke være en god strategi. For det tredje, alle miRNA kan ikke være i stand til at medføre fænotypiske ændringer på egen hånd; deres virkning kan være kontekst specifik og skal muligvis kombineret med ændringer i ekspressionen af ​​enten andre miRNA eller mRNA at ændre fænotype.

Sammenfattende konkluderer vi, at overekspression af

miR-30a

eller

-191

ikke fører til en ændring i cellecyklus, spredning, xenograft dannelse og kemosensitivitet af A549 og BEAS-2B-cellelinjer. Brug microarray data fra hele tumorer at vælge bestemte miRNA til funktionel undersøgelse kan være en sub-optimale strategi. Det er vigtigt at bekræfte den funktionelle betydning af ændringer set i miRNA udtryk data i specifikke tumortyper at definere de biologiske roller specifikke miRNA.