PLoS ONE: Berigelse af Cancer Stem Fænotype i Sphere Kulturer af prostatakræft-cellelinier Optræder gennem Aktivering af Developmental Pathways medieret af Transcriptional Regulator ΔNp63α

Abstrakt

Baggrund

Kræft stamceller (CSC) drev prostatakræft tumor overlevelse og metastase. Ikke desto mindre er udviklingen af ​​specifikke behandlinger mod CSCS hindres af knaphed på disse celler i prostata væv. Suspensionskultur systemer er blevet rapporteret at berige CSCS i primære kulturer og cellelinier. Men de molekylære mekanismer bag dette fænomen er ikke blevet fuldt udforsket.

Metodologi /vigtigste resultater

Vi beskriver en prostasphere assay til berigelse af CD133

+ CSCS i fire kommercielle PCa celle linjer: 22Rv1, DU145, LNCaP, og PC3. Overekspression af CD133, som bestemt ved flow cytometrisk analyse, korrelerede med en øget klonogene, kemoresistent, og invasive potentiale in vitro. Denne fænotype er overensstemmende med den for CSCS in vivo. Genekspressionsprofilering blev derefter udført under anvendelse af Cancer referencefeltet og NCounter systemet fra NanoString Technologies. Denne analyse afslørede adskillige opreguleret udskrifter, der kan undersøges yderligere som potentielle diagnostiske markører eller terapeutiske mål. Desuden funktionel annotation analyse antyder, at ΔNp63α modulerer aktiveringen af ​​udviklingsmæssige veje ansvarlige for den øgede stilk identitet celler, der vokser i suspensionskulturer.

Konklusioner /Betydning

Vi konkluderer, at profilering de genetiske mekanismer involveret i CSC berigelse vil hjælpe os til bedre at forstå de molekylære veje, der ligger til grund for CSC patofysiologi. Denne platform kan let tilpasses til at berige og analysere faktiske patientprøver, for at designe patientspecifikke behandlinger, der er rettet specielt mod CSCS

Henvisning:. Portillo-Lara R, Alvarez MM (2015) Tilsætning til Kræft Stem Fænotype i Sphere kulturer af prostatakræft-cellelinier sker gennem Aktivering af Developmental Pathways medieret af Transcriptional Regulator ΔNp63α. PLoS ONE 10 (6): e0130118. doi: 10,1371 /journal.pone.0130118

Redaktør: Gagan Dyb, University of Colorado Denver, UNITED STATES

Modtaget: 9. februar 2015; Accepteret: 18. maj 2015; Udgivet: 25 juni, 2015

Copyright: © 2015 Portillo-Lara, Alvarez. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Most relevant data er inden for papir og dens Støtte Information fil (S1 File), som indeholder alle genekspression værdier fra vores eksperimenter. Genekspression data blev indsendt til Gene Expression Omnibus repository fra NCBI. Data kan tilgås på GEO hjemmeside https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/under tiltrædelsen nummer GSE67248

Finansiering:. Forfatterne takker støtte fra Zambrano-Hellion familie ( Projekt ZH-Stem), Tecnológico de Monterrey (Seed finansiering CAT-122), og Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología fra México (CONACYT). Forfatterne er taknemmelige for (CONACYT) for den økonomiske støtte til RPL i form af en ph.d. Scholarship

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den anden mest almindelige malignitet i mennesket på verdensplan, og alligevel sin ætiologi er stadig stort set uløst. Som det er tilfældet i andre epitelvæv, er cellulær homeostase i den voksne prostata opretholdt gennem hierarkisk opbyggede celler med forskellige proliferative potentialer [1]. Somatiske SCs placeret på toppen af ​​dette hierarki udviser nogle unikke egenskaber, herunder: evnen til at forny sig selv og differentiere langs flere cellelinier, lokaliseret vækst i specialiserede fysiologiske mikromiljøer (nicher), og selv om de er normalt hvilende, de viser en bemærkelsesværdig proliferativ potentiale [2]. Den hierarkiske stamcelle (SC) model af carcinogenese hævder, at PCa stammer gennem ændringer af genetiske og epigenetiske faktorer, der regulerer proliferation af normale SC’er [3]. Disse afvigende udtrykte veje i sidste ende føre til transformationen af ​​normale SCs til maligne cancer stamceller (CSCS). CSCS bevarer nogle af de karakteristika, der er forbundet med deres ikke-maligne modstykker, og menes at være ansvarlig for tumor initiering, progression og tilbagefald, samt metastatisk sygdom.

CSCS menes også at være ansvarlig for udviklingen af resistens over for konventionelle terapier [4,5]. Traditionel radio- og kemo-terapeutiske midler undfanget under forestillingen om, at alle celler i en tumor er fænotypisk ens. Imidlertid CSCS afhængige iboende mekanismer, der gør dem relativt mere modstandsdygtig end terminalt differentierede celler, herunder deres langsomt prolifererende karakter, høj ekspression af ATP-bindende kassette (ABC) membrantransportører og resistens over for DNA-skader og oxidativ stress [6]. Derfor CSC-specifikke behandlinger har potentiale til at udrydde sygdommen på sin oprindelse, og at skåne ikke-tumorigen SCs og dermed minimere de skadelige virkninger forbundet med ellers nondiscriminating behandlinger.

Nuværende metoder til isolering og undersøgelse af CSCS er baseret på ekspressionen af ​​overflademarkører først identificeret i normale prostata SCs (CD44

+ /α

2β

1

hi /CD133

+) [7]. CD133 især er blevet bredt anvendt som en biomarkør til isoleringen af ​​celler, der udviser en stilk-lignende fænotype i en række normale og maligne væv [8,9]. Den isolerede studie af CSCS tillader analyse af molekylære mekanismer, der er ansvarlige for malignt celle overlevelse, adskilt fra dem, der forekommer i terminalt differentierede tumorceller eller i ikke-tumorigene SC befolkninger. Ikke desto mindre har udviklingen af ​​terapeutiske strategier baseret på CSC-målretning været begrænset på grund af manglen på egnede forsøgsmodeller.

humane primære tumorprøver (PTS) anses for at være den mest nøjagtige gengivelse af tumoren in vivo . Men kompleksiteten af ​​den fysiologiske sammenhæng ofte påvirker fortolkningen af ​​resultaterne. I modsætning hertil humane cancercellelinier (CCLS) er mere dynamiske værktøjer, der kan anvendes til at dissekere de mange forskellige molekylære processer involveret i carcinogenese. Selvom PTS stadig foretrækkes frem CCLS, deres højt begrænset adgang gør in vitro-modeller “gå-til” valg for mange forskergrupper verden over.

Nylige undersøgelser har vist, at CCLS ligner in vivo maligne tumorer, som de består også af organisatoriske hierarkier med forskellige grader af differentiering [10-12]. Flowcytometrianalyse af PCA cellelinier viser, at selv efter at være blevet opformeret i årevis, de stadig indeholder detekterbare antal stamceller-lignende celler, men ofte ved ekstremt lave procenter. Pfeiffer et al. rapporterede, at CD133

+ celler i DU145 cellelinje udgør ca. 0,01% af den samlede befolkning, mens DuCaP, LAPC-4, LNCaP, PC3, og 22Rv1 giver ingen påviselig CD133 udtryk, når analyseret via fluorescens cellesortering (FACS ) [13]. Selv CCLS repræsenterer en meget tilgængelig og praktisk alternativ til PTSS, forbliver isolering af CSCS fra denne kilde vanskelig på grund af det lille antal udifferentierede celler indeholdt i kommercielle cellelinier.

suspensionskultur systemer anvendes i stigende grad til berige udifferentierede cellepopulationer i PTSS og CCLS. Celler opformeret ved hjælp af ikke-klæbende substrater og serumfrie medier vokse som tredimensionelle sfæroide celleklynger (tumorspheres), der fremmer proliferation af stamceller fænotyper [14,15]. Dette er et komplekst fænomen, hvor sjældne udifferentierede celler stimuleres til at engagere sig i symmetrisk division at udvide SC rum. Selvom flere variationer af tumorsphere assayet er rapporteret, de genetiske mekanismer, der udløser stamcelleproliferation i kugleformede kulturer er ikke blevet fuldstændigt udforsket.

Moderne genanalyse værktøjer giver studiet af transskriptionelle forandringer med forøget følsomhed og specificitet sammenlignet med konventionelle microarray tilgange der er begrænset af store teknologiske udfordringer [16]. For eksempel NCounter Nanostring system leverer digitale udlæsninger af hvert molekyle af et mål-mRNA under anvendelse af minimale mængder af udgangsmateriale, og uden behov for cDNA-syntese [17]. Kort fortalt dette system gør brug af par af opsamling og reporter sonder, der er skræddersyet til hver enkelt mRNA målsekvens. Efter hybridisering, er afskrift /probekomplekser immobiliseret, justeret i et elektrisk felt, identificeret og optalt på grundlag farvekodede tags, der er koblet til den reporter sonde.

Kobling dynamikken i in vitro-modeller med høj -throughput genekspression profilering kan støtte i udviklingen af ​​mere effektive CSC-målrettede terapeutiske strategier. Her har vi tilpasset en tumorsphere kultur protokol for effektiv berigelse af CD133

+ CSCS i fire kommercielle PCA cellelinjer: 22Rv1, DU145, LNCaP, og PC3. Alle cellelinjer var i stand til at danne meget prolifererende og selvfornyende sfærer når forgyldt i serum-fri, forankringsuafhængige forhold, som vi brugte. Vi viser, at CSC-associerede funktioner (fx CD133 udtryk, samt øget proliferativ, invasive, og kemoterapi potentielle) var signifikant beriget med alle prostasphere kulturer. Gen-ekspression profilering af forældrenes og berigede kulturer ved hjælp af NCounter NanoString systemet afslørede adskillige opreguleret udskrifter, der deltager i etableringen af ​​den maligne stilk fænotype. Desuden funktionel anmærkning antyder, at CSC-berigelse observeret i prostasphere kulturer sker via aktivering af udviklingsmæssige veje moduleret delvist af den transkriptionelle regulator ΔNp63α.

Materialer og metoder

cellelinjer og kultur protokoller

Alle cellelinjer blev købt direkte fra ATCC. Cellerne blev anvendt ved følgende passage numre: 22Rv1, passage 11; DU145, passage 16; LNCaP, passage 13; PC3, passage 18. For genekspression profilering eksperimenter blev PC3-celler dyrket i 6-brønds ultralav fastgørelse dyrkningsplader med EpiGRO human Prostata Complete Media Kit (HPCM, Millipore). For resten af ​​eksperimenterne blev de fire cellelinjer formeres under anvendelse af tre forskellige kultur protokoller: a) DMEM-FBS: monolagskulturer i DMEM-F12 (Gibco) suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS, Invitrogen) og 100 U /100 ug /ml penicillin-streptomycin (Gibco); b) DMEM-PLUS: ikke-klæbende sfære (prostasphere, PS) kulturer dyrket i 6-brønds ultralav fastgørelse dyrkningsplader (Corning) med DMEM-F12 suppleret med 20 ng /pl hEGF (Gibco), 20 ng /pl bFGF (Gibco), 1x B27 uden vitamin A (Invitrogen), 1x Insulin-Transferrin-Selenium A (Invitrogen) og 100 U /100 ug /ml penicillin-streptomycin; og c) HPCM-PLUS: kugle kulturer i HPCM, yderligere suppleret med 20 ng /pl hEGF og 20 ng /pl bFGF. Monolagskulturer blev holdt ved en maksimal sammenløb på 80% og dyrkningsmediet blev udskiftet hver 48 timer. Prostasphere kulturer blev podet med en tæthed på 2×10

4 celler /ml og dyrkningsmedier var fuldt udskiftes hver 96 timer på dag 4, og 8. Parental og prostasphere kulturer blev opformeret i 12 dage ved 37 ° C ved 95% relativ fugtighed i en CO 5%

2 og 95% luft atmosfære. Ved afslutningen af ​​den kultur-protokollen blev celler vokser i monolags- og suspensionskulturer enzymatisk dissocieret anvendelse af 0,05% trypsin-EDTA-opløsning (Gibco) og StemPro Accutase (Gibco), henholdsvis i henhold til anvisningerne fra producenten.

immunfluorescent mærkning, celle sortering, og flowcytometri analyse

dissocierede celler blev fluorescens-mærket i overensstemmelse med producentens anvisninger ved hjælp af to monoklonale antistoffer: Anti-human CD133 /2 (293C3)-PE (Miltenyi Biotec) og Anti-human CD44 PE-Cyanine5 (eBioscience). Magnetisk cellesortering (MACS) blev udført under anvendelse Anti-phycoerythrin mikroperler (Miltenyi Biotec) og CD133 /2 (293C3) -PE monoklonalt antistof ifølge producentens instruktioner. Flowcytometri-analyse blev udført med en FACSCanto II flowcytometer med et 488-nm-laser. Et minimum af 10

4 hændelser blev registreret for hver aflæsning. Anti-Mouse IgG2b-PE isotypekontrol (Miltenyi) og ufarvede celler blev anvendt som kontroller. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer og gentaget tre gange.

NCounter NanoString genekspressionsprofilering.

Totalt RNA blev ekstraheret fra PC3 prostaspheres og oprenses under anvendelse af RNeasy Mini eller Micro kits afhængigt af mængden af udgangsmateriale (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. Integriteten af ​​oprensede RNA-prøver blev evalueret under anvendelse af en NanoDrop ND-1000 spektrofotometer ved 260/280 nm. Påvisning af mRNA-transkripter blev derefter udført i multipleksede hybridiseringsreaktioner vha NanoString NCounter Analysis System. To forskellige NCounter genekspression kodesæt blev anvendt til analyse: GX Menneskelig Cancer reference Kit bestående af 230 kræftrelaterede gener, og skræddersyet ITESM kodesættets bestående af 14 PCa-relaterede gener (NanoString Technologies). dataindsamlings- og normalisering blev udført under anvendelse af nSolver Analysis software version 2.0 (NanoString Technologies). Gennemsnitlige fold ændringer (nøgletal, n = 3) af hvert gen blev beregnet ud fra normaliserede data og klassificeret ved hjælp af Microsoft Excel. Gener med en fold ændring 1.5 blev udvalgt til yderligere analyse (tabel 1). Generelle definitioner for hvert gen blev hentet fra GeneCards encyklopædi webside (www.genecards.org) [18].

Prostasphere selvfornyelse assay

Den procentdel af celler i berigede kulturer kan skabe nye prostaspheres blev bestemt ved udpladning af celler ved en densitet på 1×10

3 celler /ml i HPCM-PLUS medier. På dag 10 af kultur, kugler ( 100 um) blev scoret, dissocieret, og sub-dyrket under de samme betingelser. Denne fremgangsmåde blev gentaget to gange for at opnå 2

nd og 3

rd generation prostaspheres på dag 20 og 30, henholdsvis. Sphere dannelse effektivitet (SFE) blev beregnet som antallet af prostaspheres genereret af antallet af celler udsåede, multipliceret med 100. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer og gentaget tre gange. Efterfølgende eksperimenter blev udført under anvendelse af første generation kugler kun

Kolonidannelseseffektivitet celle (CFC) assays

Suspension CFC-assays blev udført ved anvendelse StemXVivo methylcellulose koncentrat. (R 1,5). gennem funktionel berigelse analyse

Statistisk analyse

Resultater for kontinuerte variable udtrykkes som betyder ± standardafvigelse (Stdafv). Parvise multiple sammenligninger blev udført under anvendelse af en envejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Tukeys HSD test (* P 0,05). Alle analyser blev udført ved hjælp af JMP version 9.0.

Resultater

22Rv1, DU145, LNCaP, og PC3 er i stand til at vokse som selvfornyende kugler, der kan serielt passerede in vitro

Tumorsphere dannende evne blev vurderet ved anvendelse af en podning densitet på 2×10

4 celler /ml i 6-brønds ultralav vedhæftede plader indeholdende 2 ml HPCM-PLUS-medium. Alle fire PCA cellelinjer dannet sfæriske kolonier ved dag 4 i kultur. Parentale adhærente kulturer blev opformeret samtidigt ved en maksimal sammenløb på 80%. Dag 12 tumorspheres og monolag (figur 1A) blev dissocieret og analyseret for ekspressionen af ​​CSC-associerede biomarkører CD133 og CD44. Ekspression af CD44 blev detekteret heterogent ved høje niveauer i PC3 og DU145 celler, hvorimod minimum til nogen detekterbar ekspression blev observeret i 22Rv1 og LNCaP-celler (S1A Fig). Figur 1B viser, at CD133 blev observeret konsekvent ved ekstremt lave niveauer ( 0,5%) i alle cellelinjer. Panelet viser også, at i modsætning til forældrenes kulturer, procentdelen af ​​CD133

+ hændelser steget markant (

s

0,05) i alle prostasphere kulturer af 22Rv1 (0,067% ± 0,058% til 4,267% ± 1,419%), DU145 (0,433% ± 0,252% til 2,433% ± 0,709%), LNCaP (0,033% ± 0,058% til 4,033% ± 1,966%), og PC3 (0,133% ± 0,058% til 4,467% ± 1,358%) celler . Prostaspheres hurtigt nås diametre 100 um ved dag 12 kultur (figur 2A). De 22Rv1 og DU145 celler dannede kompakte og runde-formede kugler med godt afgrænsede grænser, mens LNCaP og især PC3 celler dannet mere uregelmæssige strukturer bestående af større individuelle celler. Kuglen-dannende effektivitet (SFE) blev evalueret for første- (dag 10), anden- (dag 20), og tredje- (dag 30) generation sfærer. SFE uvægerligt forhøjet (

s

0,05) med hver ny generation i alle cellelinier (figur 2B). Interessant direkte observation af PC3 og DU145 celler dyrket i suspension afslørede yderligere knopskydning fra prostaspheres på dette sted (S1B Fig). Denne observation tyder på potentielle dannelse af forgrening strukturer fra etablerede sfærer.

A) Mikroskopisk undersøgelse af forældrenes monolag (ADH) ved siden af ​​prostasphere-beriget (SUS) kulturer. ADH kulturer i DMEM-FBS udviser karakteristisk epithelmorfologi, og er i tæt kontakt med hinanden. SUS kulturer i HPCM-PLUS vise heterogene morfologier, der spænder fra stramme, runde-formede kugler (22Rv1 og DU145) til større mere uregelmæssige strukturer (LNCaP og PC3). Billederne er repræsentative for 12-dages gamle monolag og primære sfære kulturer. Scale bar = 200 um. B) Flowcytometrisk analyse af frisk isoleret parental (ADH) og prostasphere (SUS) celler til identifikation af CD133

+ subpopulationer. Repræsentative dot plot af PE-mærket CD133

+ (293C3) celler. Procenter vist svarer til gennemsnittet af tre uafhængige forsøg.

A) Morfologisk karakterisering af primære prostaspheres dyrket i HPCM-PLUS. Alle PCA cellelinjer dannet mærkbar kugler ved dag 4 i kultur. 22Rv1 og DU145 sfærer består af mindre og mere tætpakkede sammen celler. LNCaP og PC3 celler synes større og mere løst organiseret. Scale bar = 100 um. B) Sphere-dannende effektivitet (SFE) af prostasphere kulturer. PCA-celler blev podet ved en densitet på 1×10

3 celler /ml i 6-brønds ultralav fastgørelsesplader i HPCM-PLUS og inkuberet i 10 dage. De resulterende prostaspheres kunne seriel passage in vitro i op til tre generationer (G1-G3). SFE af kugler steget konsekvent i alle PCA cellelinier med hver generation. Ingen yderligere amplifikation blev forsøgt på dette tidspunkt. Tre uafhængige forsøg blev udført, hver i tre eksemplarer. Scale bar = 100 um. (*

s

0,05)

CD133

+ prostasphere celler udviser øget clonogenicity i både klæbende og halvfaste kolonidannende celle (CFC) analyser

kolonidannende effektivitet (CFE) af de parentale kulturer samt prostasphere-afledte celler blev analyseret parallelt i halvfast stof (fig 3A) og adhærente (figur 3C) CFC-assays. CFE værdier for monolags- og prostasphere kulturer var ens assays, men vi observeret en konsekvent højere antal individuelle kolonier i halvfast stof (Fig 3B) sammenlignet med adhærente betingelser (fig 3D). Alle fire prostasphere-beriget cellelinjer vises højere clonogenicity i begge assays sammenlignet med deres ikke-berigede modstykker (

s Restaurant 0,05). PC3 celler udviste den højeste clonogenicity for adhærente og halvfaste assays. CFE-værdier var konsekvent højere i CD133

+ -celler (

s Restaurant 0,05) sammenlignet med parentale og usorterede prostasphere celler for alle cellelinjer med undtagelse af LNCaP-cellelinjen. Vi var ikke i stand til at observere en statistisk signifikant forskel mellem CD133

+ celler og usorterede prostaspheres (

s

0,05) i det vedhængende CFC-analysen. Men CD133

+ LNCaP celler synes at være mere klonogene end usorterede prostaspheres ved brug af suspension variant af analysen.

A) Repræsentative mikrografier af suspension kolonier fra forældrenes (ADH) og CD133

+ -celler. B) halvfast kolonidannende celle (CFC) assay. Parental (ADH) og prostasphere (SUS) kulturer blev dissocieret på dag 12 af kulturen. CD133

+ -celler blev isoleret via MLA ved hjælp af 293C3 antistoffet. 1×10

3 celler fra hver tilstand blev udsået i 35 mm petriskåle med StemXVivo methylcellulose koncentrat blandet med DMEM-FBS eller HPCM-PLUS. Resultater udtrykkes som middelværdi ± Stdafv. (*

s

0,05). C) Repræsentative mikrografier af adhærente kolonier fra parental (ADH) og CD133

+ -celler. D) Klæbende kolonidannende celle (CFC) assay. Celler blev behandlet som beskrevet før for halvfast CFC-assay. Derefter 1×10

3-celler blev podet i 35 mm petriskåle med DMEM-FBS eller HPCM-PLUS. Resultater udtrykkes som middelværdi ± Stdafv. (*

s

0,05).

Prostasphere kulturer er mere modstandsdygtige over for det kemoterapeutiske stof Docetaxel

CSCS er en hypotese at være ansvarlig for PCa modstand mod kemoterapeutiske lægemidler. Vi vurderede den basale kemoresistens af de parentale monolag celler ved at inkubere alle cellelinjer med stigende koncentrationer af docetaxel (0,625-10 ug /ml) i 24 timer (Fig 4A). Cellelevedygtighed faldt konsekvent, men 22Rv1 og LNCaP-celler udviste en højere følsomhed over for lægemidlet. Vi observerede en differentieret respons på 5 og 10 ug /ml docetaxel; Derfor brugte vi disse koncentrationer til yderligere vurdering af kemoresistens af prostaspheres. Kemoresistens til begge koncentrationer af Docetaxel steget markant (

s

0,05) fra der blev observeret i de parentale cellelinjer i alle tumorsphere kulturer (Fig 4B). Prostasphere-afledte DU145 celler, især viste den højeste cellelevedygtigheden ved begge koncentrationer: 85,58% ± 7,32% ved 10 ug /ml, og 91.35% ± 8,74% ved 5 ug /ml. Ingen statistisk blev fundet signifikante forskelle mellem CD133-sorteret og usorteret prostasphere kulturer.

A) Etablering af basal følsomhed forældrenes kulturer til Docetaxel. 1×10

4-celler fra 12 dage gamle monolagskulturer blev inkuberet med 100 pi DMEM-FBS ved en slutkoncentration på 10, 5, 2,5, 1,25, og 0,625 ug /ml docetaxel. 22Rv1 og LNCaP-celler klynge sammen og udviser en højere følsomhed over for lægemidlet sammenlignet med DU145 og PC3-celler. Resultater udtrykkes som middelværdi ± Stdafv. B) Evaluering af kemoresistens deres familiemæssige og prostasphere celler. 1×10

4 celler fra vedhængende (A) og prostasphere (S) kulturer blev inkuberet med 100 pi DMEM-FBS eller HPCM-PLUS medier, i en endelig koncentration på 5 og 10 ug /ml docetaxel. Prostasphere celler udviser signifikant forøget kemoresistens til Docetaxel. Figuren viser andelen af ​​levedygtige celler i forhold til den ubehandlede kontrol. Resultaterne er udtrykt som middelværdi ± Stdafv (*

s

0,05).

CD133

+ prostasphere celler udviser en øget invasiv potentiale i forhold til forældrenes monolagskulturer in vitro

Avanceret PCa har en tendens til at sprede sig til knogler og lymfeknuder. Derfor udførte vi en Transwell invasion assay for at bestemme den metastatiske potentiale parentale og berigede kulturer. Efter inkubation i 48 timer, antallet af celler, der invaderede gennem Transwell insert var signifikant højere for prostaspheres end for forældrenes monolag celler (

s

0,05) (Fig 5A). Dernæst vi yderligere undersøgt rollen som CD133

+ celler i migreringen af ​​PCA celler og dermed etablering af metastatiske læsioner. Den CD133

+ celler i alle cellelinjer var betydeligt mere indgribende end de usorterede prostaspheres (

s

0,05). Interessant, CD133

+ DU145 celler udviste den højeste invasive potentiale (416,55 ± 40,161 /felt). Fig 5B viser repræsentative mikrofotografier af tilfældige felter med invaderende celler fra vedhængende, prostasphere, og CD133

+ -celler.

A) Transwell invasion assay. 1×10

5 forældre (ADH), prostasphere (SUS), og CD133

+ celler blev podet i 200 pi serumfrit DMEM-F12 uden phenolrødt på Transwell indstik belagt med 50 pi Geltrex LDEV-fri reducerede vækstfaktor basalmembranmatrix. Cellerne fik lov til at invadere gennem matrixen i 24 timer. Resultater udtrykkes som middelværdi ± Stdafv. (*

s

0,05). B) Repræsentative billeder af Transwell indsætter viser invaderende celler farvet med krystalviolet løsning.

Identifikation af overudtrykte gener i prostasphere beriget kulturer og CD133

+ celler

Genekspression profilering af kræft væv har potentiale til at forbedre de nuværende diagnostiske og prognostiske klassifikationer, og at afsløre indsigt i den underliggende CSC patofysiologi. Her har vi til formål at identificere overudtrykte gener i magnetisk sorterede og usorterede PC3 prostasphere celler, i forhold til forældrenes monolagskulturer. Genekspression data blev forelagt Gene Expression Omnibus repository fra NCBI og kan tilgås på GEO hjemmeside (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) under accessionsnummer GSE67248. Tabel 1 viser opregulerede udskrifter (forholdet 1,5) i CD133 + sorteres og usorterede prostasphere celler (se tabel A i S1-fil for det fulde datasæt). Figur 6A viser den hierarkiske gruppering af de relative fold ændringer i de 244 gener analyserede, i hele 12 dage i kultur. Denne grafiske repræsentation viser, hvordan dyrkningsbetingelser inducerer globale ændringer i genekspression gennem tiden. Funktionel annotation gruppering af opregulerede gener med lignende biologisk funktion inkluderet: proteiner indeholdende forudsagte glycosyleringssites og sekvenser rettet mod dem til den sekretoriske pathway, membranassocierede proteiner, proteiner, der deltager i celleadhæsion og overfladestruktur organisation og proteiner med tyrosinkinaseaktivitet.

A) Heat kort, der viser fold ændringer i genekspression fra prostaspheres på dag 4 (P2), dag 8 (P3), dag 12 (P4), og isoleret CD133

– (P4_N) og CD133

+ (P4_P) fraktioner i forhold til parentale kulturer på dag 0. værdier svarer til log2 transformerede forhold af organerne (n = 3). Figuren viser forløbet af de 244 gener analyseret hele den tid cellerne holdes i kultur. B) Gene Ontology (GO) analyse af opreguleret udskrifter i CD133

+ celler. GO Biologiske processer beriget med CD133

+ celler er alle relateret til udviklingsmæssige veje (

s

* 0,01). Kanten bredde afspejler den relative overlapning mellem knudepunkterne (% delte gener). Kanten farve koder antallet af delte medlemmer mellem hele GO kategori og den brugerdefinerede baggrund (kodesæt). Sphere størrelse er i forhold til antallet af gener knyttet til den pågældende kategori. C) Molekylære vekselvirkninger mellem transkriptionelle regulator ΔNp63α med opreguleret gener detekteret i CD133

+ celler.

ATM

,

TP63

,

IGFBP3

,

NOTCH1

,

BRCA2

,

IL1A

og

top2

gener er opreguleret i CD133

+ celler og synes at mægle downstream aktivering af udviklingsmæssige molekylære veje. Den ΔNp63α tetramer vist i midten af ​​figuren er kendt for at interagere fysisk med disse gener. Wang et al.