PLoS ONE: kvalitativ og kvantitativ analyse af ROS-medieret Oridonin-induceret kræft i spiserøret Kyse-150 Cell Apoptose ved Atomic force mikroskopi

Abstrakt

Høje niveauer af intracellulære reaktive oxygenarter (ROS) i celler er anerkendt som en af ​​de vigtigste årsager til kræft celle apoptose og er blevet udviklet til en lovende terapeutisk strategi til cancerterapi. Men om apoptose forbundet biofysiske egenskaber af kræftceller er relateret til intracellulære ROS funktioner er stadig uklart. Her, for første gang, bestemte vi ændringerne i biofysiske egenskaber knyttet til ROS-medieret øsofageal cancer Kyse-150 celle apoptose ved hjælp af højtopløsende atomic force mikroskopi (AFM). Oridonin blev bevist at inducere ROS-medieret Kyse-150 celle apoptose på en dosisafhængig måde, hvilket kunne vendes ved N-acetylcystein (NAC) forbehandling. Baseret på AFM imaging, blev fundet den morfologiske skader og ultrastrukturelle ændringer i Kyse-150 celler at være tæt forbundet med ROS-medieret oridonin-induceret Kyse-150 celle apoptose. Ændringerne i celle stivhed bestemmes ved AFM kraftmaalingen viste også ROS-afhængige ændringer i oridonin induceret Kyse-150 celle apoptose. Vores resultater ikke kun givet ny indsigt i de anticancer effekter af oridonin, men fremhævede også brugen af ​​AFM som en kvalitativ og kvantitativ nanotool at opdage ROS-medieret kræftcelle apoptose baseret på celle biofysiske egenskaber, der giver nye oplysninger om de roller ROS i cancercelle apoptose ved nanoskala

Henvisning:. Pi J, Cai H, Jin H, Yang F, Jiang J, Wu A, et al. (2015) kvalitative og kvantitative analyser af ROS-medieret Oridonin-induceret kræft i spiserøret Kyse-150 Cell Apoptose ved Atomic force mikroskopi. PLoS ONE 10 (10): e0140935. doi: 10,1371 /journal.pone.0140935

Redaktør: Etienne Dague, LAAS-CNRS, FRANCE

Modtaget: 25. maj 2015; Accepteret: September 30, 2015; Udgivet: 23. oktober 2015

Copyright: © 2015 Pi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Macao Fund Videnskab og Teknologi Development (nr 028/2014 /A1), https://www.fdct.gov. mo /

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Reaktive ilt arter (ROS) i cellerne, såsom hydrogenperoxid, superoxid anioner og hydroxylradikaler, fungere som sekundære budbringere i reguleringen af ​​mange vigtige cellulære begivenheder, herunder transskriptionsfaktoraktivering, genekspression og cellulær proliferation, differentiering og aldring [1]. ROS har også været impliceret i den metaboliske omprogrammering af cancerceller, spiller vigtige roller i tumor initiering, progression, og metastase [2]. Og baseret på forskellige redox status af normale og cancerceller, en lovende terapeutisk strategi baseret på lægemidler, som øger ROS generering og inducerer apoptose i kræftceller kommer ud for kræftbehandling [3]. Høje niveauer af ROS kan direkte inducere oxidativ beskadigelse i lipider, proteiner og nukleinsyrer, derfor dræbe kræftceller ved at forstyrre metabolismen og signaltransduktion. Øget ROS produktion er altid involveret i anticancer mekanisme af potentielle lægemidler mod cancer, og også involveret i nogle kliniske brugte anticancer lægemidler, såsom paclitaxel, 5-fluorouracil og doxorubicin [4-6].

Rabdosia rubescens, en form for urtemedicin, traditionelt har været anvendt i Kina til behandling af pharyngitis og esophageal carcinoma. Oridonin, den vigtigste farmakologiske aktive stof i rabdosia rubescens med forskellige farmakologiske og fysiologiske virkninger, har udarbejdet en stigende opmærksomhed for kræft biologer på grund af sine bemærkelsesværdige anti-tumor aktiviteter [7, 8]. Det er blevet rapporteret, at oridonin kan inducere apoptose eller autofagi i forskellige former for kræftceller, såsom myelomatose celler [9], kolorektal cancer celler [10], hepatoma karcinom celle [11], prostatacancerceller [12], cervical carcinoma celler [13] and.oesophageal cancerceller [14]. Og meget interessant, eksponering af disse cancerceller til oridonin resulterer i en betydelig stigning i ROS-generering og ROS scavenger, såsom N-acetylcystein (NAC), fuldstændigt beskytter disse cancerceller fra oridonin induceret celledød [9-13]. Derfor kunne oridonin serveres som en ideel anticancermiddel til undersøgelse af ROS-medieret apoptose i cancerceller.

Som medlem af scanning tunneling mikroskopi (STM) teknikker, atomic force mikroskopi (AFM) er meget nyttig i topografi billedbehandling, mekanisk beslutsomhed og enkelt molekyle kraft undersøgelse bygger på påvisning af cantilever afbøjning induceret af kræfter mellem AFM spids og prøve. Baseret på disse fordele, har AFM blevet en af ​​de mest kraftfulde nanoteknologier til

in situ

enkelt molekyle billeddannelse af celler, især for cellemembran-detekteringer [15]. For nylig er AFM blevet indført til undersøgelsen af ​​cancercelledød induceret af lægemiddelbehandling, som ikke blot giver den høje opløsning morfologisk information, men også fremhæver de biomekaniske ændringer under celledød [16-18]. Disse værker viser, at AFM er meget nyttig for studiet af anticancer virkninger af lægemidler baseret på de cellulære biofysiske egenskaber. Tidligere AFM undersøgelser har vist, at cancer celle apoptose er tæt forbundet med det intracellulære ROS plan [19-21]. Men der er stadig ingen systematisk AFM undersøgelse eller analyse om ændringerne af biofysiske egenskaber i ROS-medieret kræft apoptose.

I den foreliggende undersøgelse, ved hjælp af høj opløsning AFM, vi systematisk undersøgt de biofysiske egenskaber af menneskelig kræft i spiserøret Kyse -150 celler, som viste sig at være tæt forbundet med ROS-medieret apoptose induceret af oridonin. Oridonin blev fundet at inhibere proliferationen, forstyrre mitochondriemembranpotential og inducere apoptose af Kyse-150 celler gennem hele produktionen af ​​ROS i Kyse-150 celler. Alle disse effekter af oridonin på Kyse-150 celler kunne vendes af ROS-scavenger NAC angivelse af ROS-medierede anticancer effekter af oridonin på Kyse-150 celler. Derefter blev høj opløsning AFM anvendt til analyse af de anticancer virkninger af oridonin på Kyse-150 celler baseret på de biofysiske egenskaber af celler. Og navnlig, fandt vi, at der for første gang, AFM detekteret morfologiske beskadigelse, membran ultrastrukturelle ændringer og biomekaniske ændringer af apoptotiske Kyse-150 celler induceret af oridonin blev også tæt forbundet med det intracellulære ROS niveau af Kyse-150 celler, hvilket viser anvendelsen af AFM som en magtfuld nanotool for studiet af ROS-medieret kræftcelle apoptose.

Materialer og metoder

Materialer

Oridonin (≥98%, HPLC) opnås fra Mingwang biotechology (Kina). Føtalt kalveserum (FCS), penicillin /streptomycin, Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM), og trypsin kit opnås fra Gibco (USA). Paraformaldehyd købes fra Sigma (USA). 3- (4, 5) -dimethylthiazo (-z-y1) -3,5-diphenyt- etrazoliumromide (MTT), N-acetyl-L-cystein (NAC), Annexin V-FITC /PI (Annexin V-fluoresceinisothiocyanat /propidiumiodid) apoptose afsløring kit, DCFH-DA (2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetat) reaktive oxygenspecies assaykit, rhodamin 123, actin-tracker grøn (phalloidin- fluoresceinisothiocyanat), 2- (4-amidinophenyl) -6 -indolecarbamidine dihydrochlorid (DAPI) og cellecyklus analyse kits (propidiumiodid) er købt fra Beyotime Institute of Biotechnology, Kina.

Cell kultur

Menneskelig kræft i spiserøret Kyse-150 cellelinje købes fra tumorcelle bibliotek af Chinese Academy of Medical Sciences (Beijing, Kina), som er dyrket med DMEM-medium suppleret med 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 100 g /ml streptomycin i en befugtet atmosfære af 5% CO

2 ved 37 ° C.

cellelevedygtighed måling

MTT-assay blev anvendt til at teste cellelevedygtigheden af ​​Kyse-150 celler udsat for oridonin. Cellerne blev podet i plader med 96 brønde med en densitet på 5 x 10

3 celler /brønd i 24 timer og inkuberet med forskellige koncentrationer af oridonin i 24 timer. Til at fjerne de ROS produceres af oridonin blev celler forbehandlet med 2,5 mM NAC i 1 time og derefter behandlet med oridonin i 24 timer. Efter oridonin behandling, MTT-reagens (10 pi, 5 mg /ml) blev derefter tilsat til hver brønd i 4 timer inkubation blev mediet fjernet, og cellerne blev suspenderet i 150 pi DMSO at inkubere i 10 min. Et spektrofotometer (TECAN, Switzer-jord) blev anvendt til at teste absorbans ved 490 nm.

Intracellulær ROS niveau bestemmelse

Den intracellulære ROS niveau af Kyse-150-celler blev bestemt ved en DCFH-DA baseret reaktive oxygenspecies assaykit. Cellerne blev podet i plader med 6 brønde med en tæthed på 1 x 10

5 celler /brønd i 24 timer og inkuberet med forskellige koncentrationer af oridonin i 3 timer. Til at fjerne de ROS produceres af oridonin blev celler forbehandlet med 2,5 mM NAC i 1 time og derefter behandlet med oridonin i 3 timer. Efter oridonin behandling blev cellerne høstet, vasket tredobbelt med PBS og inkuberet med DCFH-DA-opløsning i 30 minutter i mørke ved 37 ° C. Flowcytometri (BD, USA) blev anvendt til påvisning af intracellulære ROS niveau efter at cellerne blev opsamlet og vasket to gange med PBS.

Cell apoptose afsløring

Annexin V-FITC /PI apoptose afsløring kit blev anvendt til at detektere apoptose af oridonin behandlet Kyse-150 celler ifølge producentens instruktioner. Cellerne blev podet i plader med 6 brønde med en tæthed på 1 x 10

5 celler /brønd i 24 timer og inkuberet med forskellige koncentrationer af oridonin i 24 timer. Til at fjerne de ROS produceres af oridonin blev celler forbehandlet med 2,5 mM NAC i 1 time og derefter behandlet med oridonin i 24 timer. Efter inkuberet med oridonin, Kyse-150 celler blev høstet, vasket tredobbelt med PBS, suspenderet i Annexin V bindingsbuffer og inkuberet med FITC-mærket Annexin V og PI i 5 minutter ved stuetemperatur i mørke. Derefter blev prøverne straks analyseret ved flowcytometri (BD, USA).

Mitokondriel membranpotentiale analyse

rhodamin 123-baseret flowcytometri blev anvendt til bestemmelse af ændringer i mitokondrisk membranpotentiale (MMP ) af Kyse-150 celler efter oridonin behandling. Cellerne blev podet i plader med 6 brønde med en tæthed på 1 x 10

5 celler /brønd i 24 timer og inkuberet med forskellige koncentrationer af oridonin i 24 timer. Til at fjerne de ROS produceres af oridonin blev celler forbehandlet med 2,5 mM NAC i 1 time og derefter behandlet med oridonin i 24 timer. De høstede og vaskede Kyse-150 celler blev inkuberet med rhodamin 123 i 60 minutter i mørke ved 37 ° C. Flowcytometri (BD, USA) blev anvendt til at detektere fluorescens-signalet af rhodamin 123 efter at cellerne blev opsamlet og vasket to gange med PBS.

forberedelse AFM prøve

I AFM målinger, Kyse-150 celler blev høstet med 0,25% trypsin og dyrket ved en densitet på 5 x 10

4 celler /brønd på dækglas i en plade med seks. Efter inkubation natten over blev oridonin tilsat til dyrkningsmediet i 24 timer stimulation. Til at fjerne de ROS produceres af oridonin blev celler forbehandlet med 2,5 mM NAC i 1 time og derefter behandlet med oridonin i 24 timer. Derefter blev cellerne vasket tredobbelt med PBS, fikseret med 4% paraformaldehyd-opløsning i 10 minutter, vasket tredobbelt med destilleret vand og tørres i luft i morfologi billeddannelse i luft eller umiddelbart anvendes til kraftmålinger i PBS-opløsning. For levende celle stivhed målinger blev Kyse-150-celler behandlet med eller uden oridonin og NAC i 24 timer og derefter vasket med PBS-puffer til at skille de suspenderende celler i medium. Cellerne blev derefter anvendt til Youngs modul målinger i DMEM-medium ved AFM. Salg

AFM morfologi billeddannelse og membran ultrastruktur analyse

AFM blev anvendt til at undersøge den topografiske og ultrastrukturelle (Bruker, tysk) udskiftning af Kyse-150 celler induceret af oridonin behandling. Organiske forureninger af siliciumnitrid tips anvendt i alle målinger blev fjernet ved ultraviolet bestråling. Foråret konstanter AFM tip blev kalibreret ved hjælp af den termiske støj metoden implementeret i Nanoscope software på AFM. For det første blev kalibreringen af ​​afbøjning følsomhed udført på dækglas på en lille vertikal afbøjning (~ 0 V) ​​i luften. Så den termiske tune kurve blev monteret af simple harmoniske oscillator passende at beregne fjederkonstanten. Krumningen radius af AFM tips (BudgetSensors, Bulgarien) anvendes til morfologi billeddannelse var 10 nm, og fjederkonstanten tips var 0,51 ± 0,02 N /m med en afbøjning følsomhed på 52,94 ± 0,96 nm /V. De morfologiske og ultrastrukturelle billeder af Kyse-150 celler blev opnået i luft ved stuetemperatur i kontakt mode. Ultrastruktur Kyse-150-celler blev opnået i områderne omkring kernerne og den topografiske billedbehandling og dataanalyse blev udført ved anvendelse af instrumentet udstyret Nanoscope Analysis software. Og for at gøre skalaen bar, X-akse etiketter og Y akse etiketter AFM billeder mere læsbar, vi re-writed skalaen bar og etiketter til X- og Y-akse i disse figurer. Til ultrastruktur parameter analyse, 30 forskellige 2 × 2 um

2 ultrastruktur billeder på 15 forskellige Kyse-150 celler i hver gruppe blev beregnet. Før ultrastruktur parameter analyse blev AFM billeder fladtrykt med det første flatten ordre ved Nanoscope Analysis software. Derefter blev hele ultrastruktur billedet beregnet for højden distribution og ruhed af Nanoscope analyse software.

AFM stivhed analyse

Biomekaniske egenskaber af levende Kyse-150 celler blev målt i DMEM medium ved bare tips i kraft Volume tilstand gennem AFM (Bruker, tysk). Fjederkonstanten af ​​siliciumnitrid prober anvendes til levende celle målinger (Bruker, tysk) blev kalibreret ved den termiske støj-metoden i en ren kultur skål indeholdende PBS, som var 0,08 ± 0,01 N /m med en afbøjning følsomhed på 16,23 ± 0,71 nm /V. I Force Volume tilstand, blev spidsen skiftevis nærmede til celleoverfladen og derefter trukket tilbage fra 16 × 16 point over 1 × 1 um

2-område på prøve overflade, mens kraft kurver synkront blev registreret. For levende celle meaurements blev mere end 15 forskellige steder på 15 forskellige celler indspillet i det centrale område af celler i hver gruppe. Youngs modul blev beregnet ud fra kraften kurver ved basisk Sneddon model, som beskrevet opførslen af ​​en kendt geometri indrykning i kontakt med en elastisk halv-space langt mindre stiv end stansen som vist i ligning (1) [22] 🙁 1 )

Hvor υ, F, a, E og α er Poisson-forhold, lastning kraft, indrykning, Youngs modul, og den halve åbningsvinkel en konisk spids hhv. I Sneddon model er den belastning fra stansen knyttet til den forårsaget indrykning dybde, der viser forholdet mellem den påførte kraft F og fordybningen δ i tilfælde af koniske indrykning. En Poisson-forhold på 0,5 er passende for cellerne og således anvendt i den følgende analyse [23, 24].

Statistik Salg

Alle resultater er repræsentative for tre uafhængige forsøg, og de præsenterede data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse Statistisk analyse blev udført ved anvendelse t-test bortset fra, at Youngs modul udføres under anvendelse Kruskal-Waillis test, og p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater og Diskussion

Oridonin hæmme Kyse-150 celle levedygtighed ved ROS-medieret vej

Oridonin har vist sig at vise bredspektret anticancer aktiviteter mod forskellige cancer cellelinjer [9-13, 25]. De anti-spredning virkninger af oridonin mod humane øsofageal cancer Kyse-150-celler blev undersøgt ved MTT-assay, hvilket indikerede stærk proliferation hæmningseffekter af 24 h oridonin behandling på Kyse-150-celler som vist i fig 1A. Levedygtighed Kyse-150 celler faldt fra 100,0 ± 6,3% til 90,6 ± 7,8%, 73,2 ± 11,9%, 54,8 ± 16,3%, 32,0 ± 15,3% og 16,2 ± 5,6% efter 10 pM, 20 pM, 30 pM, 40 pM og 50 uM oridonin behandling, (fig 1A). De tidligere værker fokuserede på anticancer aktivitet af oridonin underforstået, at inhiberingen virkninger oridonin altid var ledsaget af en stigning i intracellulær ROS niveau i cancerceller [9-13]. Vi bestemt også ROS niveauet i Kyse-150 celler, som viste, at oridonin behandling i væsentlig grad kan inducere overproduktion af ROS på en dosisafhængig måde, og over-producerede ROS induceret af oridonin kunne elimineres ved forbehandling af celler med ROS scavenger NAC (fig 1B). Den relative intracellulære ROS niveau i Kyse-150 celler steg fra 100,0 ± 23,4% for kontrol celler til 125,5 ± 6,9%, 142,1 ± 18,2% og 186,6 ± 15,8% for 10 uM, 30 uM og 50 uM oridonin behandlede celler henholdsvis (Fig 1C). Med forbehandling på 2,5 mM NAC i 1 time, det intracellulære ROS niveauet i Kyse-150 celler på 50 uM oridonin behandling faldt til 114,9 ± 14,8% og forbehandling med NAC alene viste ingen væsentlig indvirkning på ROS niveauet i Kyse-150 celler med en gennemsnitlig ROS niveau på 105,6 ± 2,8% (fig 1C). Disse resultater antydede, at oridonin kunne inducere overproduktion af ROS i Kyse-150 celler, som kunne elimineres ved NAC forbehandling.

(A) Virkninger af oridonin på levedygtigheden af ​​Kyse-150 celler. (B) DCFH-DA-assay af virkningerne af NAC på oridonin induceret ROS-produktion i Kyse-150 celler. (C) Statistisk analyse af virkningerne af NAC på oridonin induceret ROS produktion i Kyse-150 celler. (D) Virkninger af ROS ådselæder-NAC på oridonin hæmmede levedygtighed Kyse-150 celler, * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001

For at bestemme rollerne. af ROS i anticanceraktivitet af oridonin vi også detektere effekten af ​​NAC på oridonin inhiberede Kyse-150 celleproliferation. Som vist i fig 1D, levedygtighed Kyse-150-celler var 14,6 ± 2,5% efter 50 uM oridonin behandling, der blev vendt til at være 97,8 ± 1,9% ved 1 time forbehandling med 2,5 mM NAC. Disse resultater antyder kraftigt de hæmning virkninger af oridonin på Kyse-150 celledeling i ROS-medieret vej.

Oridonin-induceret ROS-medieret Kyse-150 celle apoptose

Induktion af kræft celle apoptose har været genstand for mange undersøgelser i de seneste årtier, hvilket gør det til et af de mest almindelige og vigtige indikatorer, der skal detekteres til udvikling af lægemidler mod cancer. For yderligere at tydeliggøre anticancer aktivitet oridonin i humane oesophagal kræftceller, blev apoptose af Kyse-150 celler bestemt af Annexin V-FITC /PI assay. Som angivet i fig 2A, kunne oridonin inducere apoptose af Kyse-150 celler på en dosisafhængig måde, og forbehandling med NAC kunne inhibere oridonin induceret Kyse-150 celle apoptose. Den apoptose på Kyse-150 celler steg fra 7,3 ± 1,5% for kontrolceller til 10,5 ± 1,9%, 24,8 ± 1,5% og 52,4 ± 3,1% efter 10 pM, 30 pM og 50 pM oridonin behandling, (fig 2B). Og med forbehandlingen af ​​NAC, de apoptose satser af Kyse-150-celler var 13,0 ± 1,3% og 6,7 ± 1,6% med og uden 50 uM oridonin behandling, (fig 2B). Oridonin induceret apoptose af Kyse-150 celler var for det meste alle vendes ved NAC behandling, som viste, at oridonin induceret Kyse-150 celle apoptose blev tæt forbundet med over-producerede ROS induceret af oridonin.

(A) Annexin V /PI-assay af virkningerne af NAC på oridonin inducerede Kyse-150 celle apoptose. (B) Statistisk analyse af virkningerne af NAC på oridonin induceret Kyse-150 celle apoptose, *** p. 0,001

For at afgøre, om dysfunktion af mitokondrier også var involveret i oridonin induceret KYSE- 150 celle apoptose undersøgte vi mitokondrielle membranpotentiale (MMP) som reaktion på oridonin eksponering ved flowcytometri under anvendelse rhodamin 123 som en fluorescens-probe. Resultaterne antydede, at oridonin kunne inducere MMP afbrydelse af Kyse-150 celler på en dosisafhængig måde, og NAC kan også vende denne virkning (Fig 3A). Den statistiske analyse viste, at den relative fluorescens-signalet af rhodamin 123 faldt fra 100,0 ± 1,6% for kontrolceller til 98,1 ± 4,7%, 93,4 ± 1,5% og 77,0 ± 8,2% efter 10 pM, 30 pM og 50 pM oridonin behandling henholdsvis ( fig 3B). Forbehandlingen med NAC havde nogen væsentlig indvirkning på MMP af Kyse-150 celler, som viste en relativ værdi på 99,96 ± 1,82% (Fig 3B). Og den relative fluorescens-signalet af rhodamin 123 steg også til 97,7 ± 4,4% med forbehandling med NAC og behandling med 50 pM oridonin, hvilket indikerer, at oridonin kunne også inducere MPP afbrydelse af Kyse-150 celler ved ROS-medieret måde. Derudover viser analysen af ​​cellecyklusfordeling viste også, at oridonin også kunne inducere standsning af cellecyklus af Kyse-150 celler ved G2 /M-fase (Fig A i S1 File). Selvom satserne for celler på G2 /M fase var ikke ROS niveau afhængig, men forbehandling med NAC kunne også vende oridonin induceret cellecyklusstop (Fig A i S1 File).

(A) Rhodamin 123 assay af virkningerne af NAC på oridonin induceret afbrydelse af mitochondriemembranpotential i Kyse-150 celler. (B) Statistisk analyse af virkningerne af NAC på oridonin induceret afbrydelse af mitochondriemembranpotential i Kyse-150 celler, ** p. 0,01

Behandlingen af ​​oridonin signifikant øget ROS niveauet i Kyse -150 celler og over-producerede ROS yderligere inducerede forstyrrelser af MMP, arrestation af cellecyklus og apoptose af Kyse-150 celler. Med forbehandling af NAC, som havde ingen væsentlig indvirkning på fysiologiske status Kyse-150 celler, men kunne fjerne over-producerede ROS, oridonin induceret MMP forstyrrelser, cellecyklusstop og apoptose af Kyse-150 celler blev dramatisk vendt. Disse resultater kraftigt antydet, at anticancer aktiviteter oridonin i Kyse-150 celler hovedsageligt blev medieret af intracellulære ROS niveau af Kyse-150 celler induceret af oridonin.

ROS-afhængige morfologiske beskadigelse af Kyse-150 celler

i de senere år har AFM opstået som et effektivt værktøj til nanoskala morfologi billedbehandling og pico-newton følsomhed force måling af celler i forskellige fysiologiske status [26-29]. Den super opløsning og høj kraft følsomhed AFM viser også meget bred anvendelse til påvisning af cancer celle apoptose ved lægemiddelbehandling, giver nogle hidtil ukendte oplysninger om cellemorfologi, celle- biomekanik og membran receptorfunktioner [16, 18, 28]. Morfologien af ​​cellerne er tæt forbundet med cellulær fysiologiske status og funktioner. Cell apoptose er altid forbundet med en masse typiske morfologiske ændringer, såsom kondensering af kerne, blæredannelse af membranen og skrumpe celle krop.

For at løse de præcise morfologiske ændringer i Kyse-150 celler induceret af oridonin behandling og roller ROS i oridonin inducerede morfologiske ændringer i Kyse-150 celler, blev høj opløsning AFM opereret for studiet af Kyse-150 celler. Som vist i fig 4A, styrer Kyse-150 celler viste typiske ovale former og cellerne i tæt kontakt med andre celler. Efter behandlet med 10 pM oridonin i 24 timer, var der ingen bemærkelsesværdige ændringer i morfologien af ​​Kyse-150-celler (Fig 4B). Efter 24 timer behandling med 30 pM oridonin viste Kyse-150 celler nogle typiske morfologiske karakteristika af apoptose, herunder formindskede celle organer og kondenseret cytoplasma (Fig 4C). Og for 50 uM oridonin behandlet Kyse-150 celler, kunne observeres mere typiske morfologiske karakteristika apoptose, såsom shrink af celle organer, kondensering af cytoplasma, kondensering og fragmentering af kernen, fremkomsten af ​​apoptotiske krop (Angivet af grønne pile) og de beskadigede pseudopodium strukturer for celle-forbindelser (fig 4D). For at demonstrere den rolle, forøget intracellulær ROS niveau i oridonin inducerede morfologiske ændringer af Kyse-150 celler, blev morfologien af ​​Kyse-150 celler med forbehandlingen af ​​2,5 mM NAC i 1 time og 50 uM oridonin i 24 timer også undersøgt af AFM. De AFM billeder (Fig 4E) indebar, at Kyse-150 celler havde ingen væsentlige morfologiske ændringer efter 50 uM oridonin behandling på grund af forbehandling af 2,5 mM NAC. Og forbehandlingen af ​​NAC også havde ingen bemærkelsesværdige virkninger på morfologien af ​​Kyse-150-celler (Fig 4F). Desuden har vi også fundet, at kontrol Kyse-150-celler viste altid klare nucleus områder (Angivet ved blå pile i figur 4), som også forsvandt efter oridonin behandling og vendes ved forbehandling med NAC. Disse høj opløsning AFM billeder foreslog, at oridonin kunne fremkalde morfologiske skader af Kyse-150 celler, og disse morfologiske skader kan også vendes af NAC forbehandling, hvilket indikerer, at AFM kan anvendes som en kvalitativ nanotool at bestemme ROS-medieret celle morfologiske ændringer i cancercelle apoptose. Imidlertid er denne morfologiske imaging metode baseret på AFM begrænset til kvalitativ analyse af ROS-medieret cancercelle apoptose, og er ikke egnet til kvantitativ analyse.

AFM morfologi billeddannelse af (A) kontrol, (B) 10 uM oridonin behandles, (C) 30 uM oridonin behandles, (D) 50 uM oridonin behandles, (E) 2,5 mM NAC + 50 uM oridonin behandlede og (F) 2,5 mM NAC behandlet Kyse-150 celler. (A1-F1) Topografi billeder og (A2-F2) deres tilsvarende 3D-billeder af Kyse-150 celler; (A3-F3) Forstørrede topografi billeder i (A1-F1) og (A4-F4) deres tilsvarende 3D-billeder af Kyse-150 celler, skala bar:. 20 pm

ROS-afhængig membran ultrastrukturelle ændringer af Kyse-150 celler

Cellemembran ultrastruktur blev også meget anvendt til at vurdere apoptose af cancerceller ved AFM fordi ændringerne af membran- komponenter, såsom lipidklump, membranproteiner og phospholipid, blev også associeret med celle apoptose [16, 18, 28, 30, 31]. Med den høje opløsning billeddannelse af AFM, kunne nogle parametre, der beskriver den egenskab cellemembranen, hentes fra AFM ultrastruktur billeder at præcisere ændringerne i cellemembran under apoptose. Virkningerne af oridonin på membranen ultrastruktur Kyse-150 celler blev også bestemt ved AFM-analyse for at undersøge de mere detaljerede morfologiske ændringer af oridonin inducerede Kyse-150 celle apoptose. Ved forstørret afbildning af cellemembran omkring kernen områder kan membranen ultrastrukturelle parametre ekstraheres til kvantitativ analyse af oridonin induceret Kyse-150 celle apoptose. Som vist i figur 5, var vanskelige at præcisere ved direkte observation af membran ultrastruktur billeder af Kyse-150 celler ændringer i membranstruktur. Som vist i fig 5A4-5F4, højden distribution på cellemembranen og ruhed cellemembranen (Herunder Rq og Ra) steg efter oridonin behandling, som derefter blev vendt med forbehandling af NAC.

AFM morfologi og membran ultrastruktur billeddannelse af (A) kontrol, (B) 10 pM oridonin behandles, (C) 30 uM oridonin behandles, (D) 50 uM oridonin behandles, (E) 2,5 mM NAC + 50 uM oridonin behandlede og (F) 2,5 mM NAC behandlet Kyse-150 celler. (A1-F1) Topogrphy billeder af Kyse-150-celler, skala bar: 20 pm; (A2-F2) Forstørret membran ultrastruktur billeder i (A1-F1) og (A3-F3) deres tilsvarende 3D-billeder af Kyse-150 celler, skala bar: 500 nm; (A4-F4) Højde distribution og ruhed celleoverfladen ultrastruktur analyseret fra (A2-F2).

Ved at beregne 30 forskellige steder i 15 forskellige celler i hver gruppe, den gennemsnitlige højde, Rq (root -mean-kvadreret ruhed) og Ra (gennemsnitlig ruhed) blev præsenteret i Fig 6. Den gennemsnitlige højde af Kyse-150 cellemembranen steg fra 28,9 ± 9,9 nm for kontrolceller til 37,1 ± 14,5 nm, 52,7 ± 25,7 nm og 73,7 ± 31,0 nm til 10 uM, oridonin 30 uM og 50 uM behandlede Kyse-150-celler, (fig 6A). Den dramatiske stigning i membranens partcle størrelse i Kyse-150-celler efter 50 pM oridonin behandling kunne også elimineres med forbehandlingen af ​​NAC, som viste en gennemsnitlig højde på 29,3 ± 9,0 nm (Fig 6A). Og den gennemsnitlige højde af NAC behandlede Kyse-150 celler var 29,0 ± 10,5 nm, viser ingen væsentlig indvirkning på membranen højde distribution af Kyse-150-celler (Fig 6A). RQ værdier Kyse-150 celler også steget, fra 8,9 ± 2,8 nm for kontrol celler til 10.99 ± 0,69 11,0 ± 3,7 nm, 13,87 ± 1,02 13,9 ± 5,4 nm og 22,6 ± 9,5 nm til 10 uM, 30 uM og 50 uM oridonin behandlede Kyse-150-celler, (fig 6b). Og hvis cellerne blev forbehandlet med NAC, RQ værdier var 9,6 ± 2,7 nm og 9,1 ± 2,7 nm med og uden 50 uM oridonin behandling, (fig 6B). Tilsvarende Ra-værdi var 7,1 ± 2,3 nm for kontrolceller, og steg til 8,6 ± 2,8 nm, 10,7 ± 4,1 nm og 18,0 ± 7,7 nm efter 10 pM, 30 pM og 50 pM oridonin behandling, (fig 6C). Den betydelige stigning i Ra i Kyse-150-celler efter 50 pM oridonin behandling kunne også vendes med forbehandling af NAC at vise en Ra-værdi på 7,5 ± 2,1 nm (Fig 6C). Og NAC forbehandlede Kyse-150 celler uden oridonin behandling viste en Ra-værdi på 7,2 ± 2,1 nm (Fig 6C). Disse resultater indikerede, at i lighed med den intracellulære ROS niveau, både membranen højde distribution og membran ruhed Kyse-150 celler steg efter oridonin behandling på en dosisafhængig måde, og den øgede membran højde distribution og membran ruhed kan også vendes af NAC forbehandling.

(A) Højde fordeling, (B) root-mean-squared ruhed (Rq) og (C) gennemsnitlig ruhed (Ra) analyseret fra 2 × 2 um ramme ultrastruktur billeder af Kyse-150 celler, n = 30, * p 0,05, *** p. 0,001

Det er velkendt, at cellemembran ultrastruktur er påvirket af flere miljømæssige og subcellulære statslige faktorer såsom motilitet, adhæsion, og intracellulær kontakt, og dermed kunne udvikles til meget gode indikatorer for sundhed eller unormal status celler [32]. Højden distribution og ruhed cellemembranen bestemt ved AFM er parametre, der beskriver strukturen af ​​cellemembranen. Den øgede membran højde fordeling kunne tilskrives en sammenlægning af membran biomolekyler. Som rapporteret, ville hullet strukturer føre en mere ru overflade af celler [18]. Og generelt, flere molekyler beliggende på plasmamembraner, større ruhed på celleoverfladen ville blive detekteret af AFM [33]. Celleapoptose er forbundet med eksponering af indre membran phospholipid på celleoverfladen, hvilket således frembringer integrerede ændringer i elektrostatiske potentiale og hydrering i den ydre blad af cellemembranen [34]. Og i ROS-medieret apoptose, er høje intracellulære ROS-niveauer sig også at påvirke strukturen eller ekspressionen af ​​nogle vigtige membran komponenter, såsom transmembrane kanaler, receptorer og lipidklump [35-37].