PLoS ONE: Gene Expression metaanalyse Identificerer VDAC1 som Predictor af dårligt resultat i Early Stage Ikke-småcellet lungekræft

Abstrakt

Baggrund

bioenergetic status som ikke-småcellet lungekræft korrelerer med tumor aggressivitet. Spændingen afhængig anion kanal type 1 (VDAC1) er en komponent i den mitokondriske permeabilitetsovergang pore, regulerer mitokondrie ATP /ADP udveksling tyder på, at dets overekspression kan være forbundet med energi-afhængige processer, herunder øget proliferation og invasionsevne. For at teste denne hypotese, gennemførte vi en in vivo gen-ekspression meta-analyse af kirurgisk resektion ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) med 602 individuelle udtryk profiler, til at undersøge virkningen af ​​VDAC1 på overlevelse.

Metode /vigtigste resultater

høj VDAC1 udtryk var forbundet med kortere samlet overlevelse med hazard ratio (HR) = 0,6639 (95% konfidensinterval (CI) ,4528-,9721), p = 0,035352 svarende til 52 versus 101 måneder. VDAC1 forudsagt kortere tid til tilbagefald og blev vist at være en uafhængig prognostisk faktor i forhold til histologi, køn, alder, nodal scenen og tumor fase i en Cox multivariat analyse. Overvåget analyse af alle de datasæt identificerede en 6-gen signatur bestående HNRNPC, HSPA4, HSPA9, UBE2D2, CSNK1A1 og G3BP1 med overlappende funktioner, der involverer regulering af protein omsætning, RAS-RAF-MEK vej og transskription. VDAC1 forudsagde overlevelse i brystkræft og myelom og et uovervåget analyse viste berigelse af VDAC1 signatur i bestemte delmængder.

Konklusioner

I resumé, identificerer genekspression analyse VDAC1 genekspression som en indikator for dårlig resultat i NSCLC og andre kræftformer, og er forbundet med dysregulering af et konserveret sæt af biologiske veje, som kan være kausalt forbundet med aggressiv tumor adfærd

Henvisning:. Grills C, Jithesh PV, Blayney J, Zhang SD, Fennell dA (2011) Gene Expression metaanalyse Identificerer VDAC1 som Predictor af dårligt resultat i Early Stage Ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 6 (1): e14635. doi: 10,1371 /journal.pone.0014635

Redaktør: Rory Edward Morty, University of Giessen Lung Center, Tyskland

Modtaget: Juli 5, 2010; Accepteret: November 23, 2010; Udgivet: 31 Jan 2011

Copyright: © 2011 Grills et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. CG er finansieret af Institut for Beskæftigelse og læring. DAF er finansieret af Cancer Research Storbritannien på en kliniker Scientist Fellowship. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er en fælles, stort set uhelbredelig kræft. I indstillingen tidlig sygdom, kirurgisk resektion er standarden for pleje og fordelen af ​​adjuverende kemoterapi begrænset til 5-15% forbedring i overlevelse i fase II, men ikke iscenesætte jeg sygdom [1]. Men tilbagefald er hyppige i fase I kræft med 37% af patienterne dør inden for fem år, derfor er der et behov for at identificere pålidelige biomarkører for dårligt resultat for at målrette enkeltpersoner for hvem adjuvans eller roman målrettet behandling kan forbedre overlevelsen. Ændring i tumor stofskifte er kendetegnende for kræft og høje niveauer af hexokinase-afhængig glukose fældefangst i NSCLC fremgår af standardiserede optagelse er værdier på positronemissionstomografi, er forbundet med kortere overlevelse [2]. Dette ses i både tidlig og fremskreden NSCLC [3], [4].

Voltage Dependent Anion kanal 1 (VDAC1) er en ydre mitokondrielle membran protein involveret i reguleringen af ​​ATP /ADP udveksling og respiratorisk kontrol [5]. VDAC1 interagerer med proapoptotiske BCL-2 familie proteiner [6], [7]. Imidlertid har sin rolle i reguleringen af ​​mitokondrie ydre membran depolarisering været kontroversiel [8], [9], [10]. Men nye data har identificeret en potentiel rolle for dette protein i reguleringen af ​​cellernes overlevelse og derfor fandt vi det værdige til yderligere undersøgelse. Permeabiliteten overgang pore, som omfatter VDAC1, er direkte reguleret af BH3-only proapoptotiske BCL-2 familiemedlem BAD [10] og regulerer celleoverlevelse. I modsætning hertil har den type II isoform (VDAC2) blevet identificeret som en antiapoptotisk, negativ regulator af BAK [9], [11], [12]. Den adenin-nukleotid translokatoren (ANT), som er beliggende i den indre mitokondrielle anses også for at være en væsentlig bestanddel af permeabilitetsovergang pore [13] og langs med VDAC det menes at kontrollere mitochondriske remodeling processer enten direkte eller indirekte [14] . For nylig, det bakterielle protein FILA [15] har vist sig at regulere et kompleks af VDAC1 med hexokinase II [16], som inhiberer apoptose. En voksende mængde af data tyder på, at hexokinase-VDAC interaktion er anti-apoptotiske [17], og afbrydelse af denne interaktion kan være en strategi for at inducere celledød [18], [19]. VDAC-hexokinase kompleks er blevet rapporteret at være reguleret af glycogensyntasekinase 3-beta [19] og AKT [20].

Cancer celler med lav VDAC1 induceret af RNA-interferens udviser en defekt i cellevækst in vivo [21 ]. Omvendt kan høje niveauer af VDAC1 ekspressionsniveauer bibringe tumor celleselekteringsværdi fordel ved at lette energi-afhængige processer, såsom proliferation og invasivitet [22]. Selvom hexokinase II udtryk er blevet forbundet med dårligere prognose [23], der til dato har været nogen undersøgelser, som potentielle prognostiske effekt af VDAC1 i patienter med kræft. Det blev derfor den hypotese, at VDAC1 udtryk kan påvirke overlevelse efter NSCLC resektion. Her viser vi at bruge genekspression meta-analyse, at VDAC1 overekspression er en stærk, uafhængig, dårlig prognostisk faktor i tidligt stadie ikke-småcellet lungekræft baseret på kombineret analyse af flere genekspression datasæt. VDAC1 overekspression er konsekvent forbundet med overekspression af 6 yderligere gener involveret i overlevelse signalering, protein ubiquitinering og ATP-binding. Denne forening opretholdes på tværs af flere uafhængige datasæt og på tværs af forskellige kræftformer tyder på en potentiel rolle for disse biologiske processer i reguleringen tumor adfærd og derfor kliniske resultat i NSCLC.

Resultater

VDAC1 overekspression forudser kortere overlevelse i NSCLC

i alt blev 8 uafhængige NSCLC datasæt kurateret fra Gene Expression Omnibus (GEO), med i alt 602 mikroarrays. I alle datasæt høj ekspression af VDAC1 (øvre tertil) var associeret med signifikant kortere overlevelse sammenlignet med den for den nedre tertil for VDAC1 ekspression, p = 0,0353, HR = 0,6639 (0,4528 til 0,9721) (figur 1A). Den gennemsnitlige samlede overlevelse var 101,6 måneder hos patienter med de laveste VDAC1 tertil og 52 måneder hos patienter med højeste VDAC1 tertil

Figur 1A:. Viser Kaplan Meier plot skildrer patient overlevelse afhængig af høj og lav VDAC1 udtryk. Den tydelige forskel i overlevelse er synligt indlysende med median overlevelse høj VDAC1 udtrykker patienterne bliver kun halvdelen af ​​lave udtrykker patienterne. Kurverne er signifikant forskellige med p = 0,0353 ved logrank test. Figur 1B: overlevelse plot for fase I-patienter. Igen forskellen i høje og lave udtrykker prøver er klar med patienter lave VDAC1 har bedre overlevelse. Den logrank test viser kurverne er signifikant forskellige med p = 0,0455. Fase I-prøver følger samme mønster som alle de kombinerede data fra alle faser.

VDAC1 udtryk er en uafhængig prognostisk faktor

For yderligere at undersøge virkningen af ​​VDAC1 på overlevelse, vi gennemført ud korrelation og Cox regressionsanalyse samt multivariate tests med PASW Statistics V.18 (SPSS: En IBM selskab). Høj VDAC1 udtryk viste sig at være en uafhængig prognostisk variabel for kortere overlevelse p 0,001 niveau. Stage (p = 0,013) og Pt, (primær tumor), (p = 0,022) viste sig også at være uafhængige variable korreleret med overlevelse, mens multivariat analyse viste, at kombinationen af ​​scenen og histologi signifikant påvirker patientens overlevelse (p = 0,027). Resultaterne fra Cox regressionsanalyse kan ses i tabel 1, hvor VDAC1 har mest betydelig indflydelse på overlevelse efterfulgt af pT og scene.

VDAC1 overekspression forudser kortere tid til tilbagefald efter NSCLC resektion

indflydelse VDAC1 udtryk til tiden til tilbagefald efter kirurgisk resektion var af interesse som denne kliniske variabel ikke er forstyrret af behandling efter tilbagefald. Det er derfor en mere nøjagtig måling af prognostisk betydning. Så vi analyserede kun gentagelsesindstillingerne data og univariat analyse viste VDAC1 væsentligt forudsige tid til tilbagefald (p 0,001). Oplysninger om histologisk undertype, køn og alder var til rådighed for alle prøver, og de viste sig at være ikke signifikant med p-værdier på 0,35, 0,82 og 0,73 hhv. Et resumé af denne analyse kan findes i tabel 2. Tilsvarende multivariat analyse rangeret disse variabler i samme rækkefølge, med VDAC1 er den eneste uafhængige faktor (p 0,001).

VDAC1 overekspression i fase I prøver fører til dårlig overlevelse

oplysninger om scenen ikke var tilgængelig med alle de datasæt, men vi analyseret, hvad vi havde adgang til. Vi havde 89 trin I prøver og Kaplan-Meier plot for disse patienter er vist i figur 1B; p = 0,0455, med en tilhørende hazard ratio på 0,52 (0,1492 til 0,7653). Vi fandt korrelation mellem VDAC1 udtryk og overlevelse til at være meget stærk med p 0,001. Cox regressionsanalyse i fase 1 NSCLC, hvor adjuverende kemoterapi ikke har vist sig at forbedre patientens resultat [24], [25], [26], viste ingen variabler til at være statistisk signifikant, men i lighed med analysen af ​​alle data, VDAC1 var den mest indflydelsesrige prædiktor for overlevelse (p = 0,241), og blev placeret over histologi (p = 0,344), alder (p = 0,465), pt (p = 0,970), PN, (nodal fase), (p = 0,975) og køn (p = 0,999). Den regression koefficient for VDAC1 var 29,18 indikerer en meget dårlig prognose for patienter med høje niveauer af VDAC1.The prøvenumre var lav for trin II og III med 68 prøver bliver fase II og kun 16 prøver bliver Stage III, dette gjorde det vanskeligt at opnå statistisk signifikante resultater. Sammenhængen mellem VDAC1 udtryk og overlevelse i stadie II prøver og trin III prøver var ubetydelig med p = 0,853 og p = 0,701 henholdsvis. Vi havde et utilstrækkeligt antal hændelser i begge trin til at producere en præcis Kaplan Meier plot med mindre end 10 tilfælde af død per kategori. Manglen på prøver højere fase førte os til at fokusere på output fra trin I prøver og fra de kombinerede data.

VDAC1 overekspression korrelerer med en bevaret 6-gen signatur

For at opnå en indsigt i biologi ligger til grund for dårlig prognose for VDAC1 overekspression NSCLC in vivo, blev en analyse udført for at identificere, hvilke gener og genprodukter netværk er konsekvent forbundet med høj VDAC1 udtryk. En undergruppe af 6 gener blev identificeret i VDAC1 overudtrykker NSCLC datasæt forbundet med signifikant differentiel ekspression i 50% eller flere af de datasæt. Disse gener var CSNK1A1, G3BP1, HNRNPC, HSPA4, HSPA9 og UBE2D2; se figur 2, hvor forskellen i den gennemsnitlige ekspression af disse gener, når VDAC1 er lav og høj vises. Som defineret af Gene ontologi Consortium [27] HNRNPC, HSPA4, HSPA9 og UBE2D2 er involveret i protein ubiquitinering veje, og CSNK1A1 regulerer EIF2 funktion. HSPA9 er også involveret i anti-apoptoseveje mens G3BP1 er knyttet til Ras protein signaltransduktion og ATP afhængig DNA og RNA helicase-aktivitet. CSNK1A1, HSPA4 og HSPA9 er knyttet til ATP binding mens HNRNPC er involveret i RNA og nucleotidbindende. En oversigt over GO vilkår for disse gener kan findes i tabel 3. HNRNPC blev HSPA9, G3BP1 og UBE2D2 bestemmes som værende prognostiske sig ved en univariat analyse blev udført på deres udtryk niveauer og overlevelsestid, de tilhørende p-værdier var 0,027 , 0,002, 0,02 og 0,003 henholdsvis.

Dette diagram viser variationen i genekspression af vores differentielt udtrykte gener i prøverne, hvor VDAC1 udtryk er lav, og når den er høj. Alle de gener, der tilsammen består vores underskrift er opreguleres og så stige, når VDAC1 stiger.

Unsupervised analyse identificerer VDAC1 som prognostisk og forbundet med en 6-gen signatur

Vi analyserede også de data, uden filtrering til VDAC1 udtryk til at bekræfte VDAC1 ville blive væsentligt forskelligt udtryk, når ekspressionsniveauer for levende og døde patienter sammenlignes. Ved hjælp af denne uovervåget metode og ranking genekspression i henhold til den samlede overlevelsestid blev VDAC1 fundet at være nedreguleret i patienter med længere overlevelse. Tilsvarende de 6 gener, der reguleres ved siden VDAC1 opførte sig på samme måde, hver af dem blev nedreguleret i prøver fra patienter, der overlevede i en længere periode.

6-gen Signature association med VDAC1 overekspression er uafhængig af kræftform

for at bekræfte gyldigheden og potentielle biologiske relevans af 6-genet signatur covariant med VDAC1 vi testede sin diskriminerende effekt på en uafhængig brystkræft datasæt. En t-test blev udført sammenligning høje og lave VDAC1 udtrykkende prøver. Vi fandt alle 6 gener blev opreguleret når VDAC1 blev stærkt udtrykt. Tilsvarende udtryk var lav, da VDAC1 udtryk var lav og så vor underskrift af gener covariant med VDAC1 i NSCLC data udviste de samme udtryk mønstre i brystkræft data. Vi har også gennemført den samme test med en uafhængig myelom kræft datasæt, udfører en t-test på de data, der blev delt ud på VDAC1 højt og lavt udtryk. Vi igen fundet alle de 6 gener i vores meta-signatur returneres som værende statistisk signifikant ved en p 0,001 niveau. Yderligere validering blev fundet gennem en analyse af de NCI60 cellelinjer fundet i GSE2003. Vi igen sammenlignet prøverne baseret på VDAC1 udtryk og fundet den 6-genet signatur blev bevaret i 8 af disse cellelinjer, nemlig UACC62 og SK_MEL2 (melanom), SF295 og SF539 (CNS), A498 og SNC12C (renal), H23 og HOP62 (NSCLC). Analyse af NCI60 data for lav VDAC1 med lav ekspression af 6-genet signatur identificeret 5 cellelinier, CCRF-CEM, RPMI-8226 og K562B (leukæmi), IGROV1 (ovarie) og H522 (NSCLC).

Validering af 6-genet signatur ved hjælp Principal Components Analysis (PCA)

PCA er med til at forklare variansen i data og er en almindelig teknik til dimensionalitet nedsættelse af høje dimensionelle data. Vi udførte PCA på NSCLC datasæt GSE3141 og fandt, at selv om der var nogle outliers ved hjælp af den første principale komponent, som tegnede sig for så meget af variabilitet som muligt, alle 6 af generne i vores meta-signatur var i top 1% baseret på PC1 komponent belastninger. HNRNPC og G3BP1 udført særdeles godt blive placeret fjerde og femte på listen hhv.

Protein-Protein Interaction (PPI) Netværk

Inden for VDAC1 PPI-netværk, ved hjælp af Yu et al s [28] kategorisering blev kodede proteiner klassificeret som enten hubs (noder med høje grad værdier udgør sårbare områder af netværket) og /eller flaskehalse (dem med høj betweenness centrale score svarende til centrale skærende noder). VDAC1 og fire af generne, CSNK1A1, HSPA4, HNRNPC og UBE2D2 blev betragtet som både hub-flaskehalse.

Clustering identificeret potentielle grupper af gener, der opererer i de samme veje, processer eller molekylære komplekser. Fem af de gener, G3BP1, UBE2D2, VDAC1, CSNK1A1 og HSPA4 tilhørte fire high-scoring klynger, den højest rangerede af disse indeholder både UBE2D2 og G3BP1. Funktionel analyse afslørede denne klynge, der skal mest signifikant associeret med SH2-domænet, ATP-bindingssteder, protein og proteintyrosinkinaseaktivitet, autophosphorylering, DNA-binding og transkriptionsfaktoraktivitet. Den næststørste VDAC1-relaterede cluster inkluderet HSPA4 som blev beriget med nukleare lumen og nukleoplasma komponenter og RNA-bindende og mRNA splejsning processer. VDAC1 selv var forbundet med en top-scoring klynge funktionelt beriget i reguleringen af ​​programmeret celledød, apoptose, anti-apoptose, nukleoplasma, intracellulære organel lumen, transskriptionsfaktorbindende og repressor aktiviteter. Klyngen som CSNK1A1 var medlem var forbundet med betydelig funktionalitet i belagt pit, endomembrane system endocytose, endosom, bindende og transportaktiviteter.

korteste vej analyse viste en sub-netværk af 14 gener, der omfatter VDAC1 signatur gener og centrale initiativerne partnere, herunder TP53, RASA1, Grb2, CBL, CSK, RAF1 og KPNA2, se figur 3. Kun to af generne HNRNPC og CSNK1A1 var direkte interaktionskandidater; HNRNPC s bindende evne moduleres af CSNK1A1-medieret fosforylering.

Disse er vist med de fleste-hyppigst forekommende initiativerne gener. Korteste vej analyse afslørede en sub-netværk af 14 gener, der omfatter VDAC1 og de 6 differentielt udtrykte gener associeret med VDAC1 ekspression. De vigtigste initiativerne partnere inkluderet TP53, RASA1, Grb2, CBL, CSK, RAF1 og KPNA2. Kun HNRNPC og CSNK1A1 interagerede direkte.

Funktionel analyse viste berigede processer primært forbundet med de VDAC1 målgener herunder ATP-bindende og nucleotidbindende. Både VDAC1-målet og interne korteste-sti gener deltog i fællesskab i en række væsentligt beriget processer og veje. Disse omfattede signalering processer (intracellulær signaleringskaskade, RAS protein signaltransduktion, lille GTPase medieret signaltransduktion), transport (nucleocytoplasmic transport, nuklear transport, intracellulært protein transport) og anti-apoptose.

Generne giver interne links inden den korteste-stinet signifikant beriget med signalveje, fx Neurotrophin, IGF-1, insulin, TPO, PDGF, EGF, Integrin, T-cellereceptor, MAPK og ERKB. Yderligere veje konstateret, var: signalering af hepatocytvækstfaktor-receptoren, transmembrane receptor protein-tyrosin-kinase-signalvejen, enzymforbundet receptorprotein-signalvejen, sprouty regulering af tyrosinkinase-signaler og IL-2 receptor beta-kæde i T-celle aktivering

de vigtigste kombinerede aktiviteter VDAC1 gener (CSNK1A1, G3BP1, HSPA4, HSPA9 og UBE2D2) blev fokuseret på ATP og nucleotidbindende. Specifik individuel beriget funktionalitet også fundet sted, f.eks proteinkinaseaktivitet og vært-virus interaktion (associeret med gener CSNK1A1 og VDAC1 henholdsvis).

Interessant, selvom mindre fremtrædende i PPI-netværk, de to ikke-hub-ikke-flaskehalse gener, HSPA9 og G3BP1, blev beriget med forskellige sæt af funktioner. I tilfælde af G3BP1 blev signaltransduktion fremhævet (både lille GTPase og RAS-protein), sammenholdt med de forbindende gener, RAF1 og Grb2. HSPA9 især var forbundet med to grupper af funktioner: protein målretning og transport (intracellulært protein, nukleare og nucleocytoplasmic), sammenholdt med TP53 og KPNA2; og negativ regulering af celledød, apoptose og programmeret celledød (sammen med TP53 og RASA1).

Diskussion

VDAC1 overekspression forudser kortere tid til tilbagefald og samlet overlevelse for NSCLC som det fremgår fra samlet gen ekspressionsanalyse. Det er en uafhængig prognostisk faktor som det fremgår fra Cox regressionsanalyse og forudsiger overlevelse i fase 1 sygdom, hvor undergruppe analyse af randomiserede, kontrollerede kliniske forsøg med adjuverende kemoterapi har undladt at vise klinisk fordel [24], [25], [26]. En kombineret genekspression dataanalyse tilgang er blevet anvendt til at undersøge virkningen af ​​VDAC1 udtryk på overlevelse, som var statistisk signifikant i alle individuelle datasæt undersøgte.

Flere nyere undersøgelser analyserer microarray data for prognostiske markører i NSCLC har produceret inkonsekvent resultater [29]. Den udpræget mangel på overlapning forbundet mellem disse underskrifter afspejler ustabilitet og tilskrives små stikprøvestørrelser med mindre end 200 prøver, der anvendes per undersøgelse. Analyse af flere datasæt, for eksempel kombineret analyse af microarray genekspression datasæt omhandler lignende biologiske spørgsmål gennemført på et fortolkningsmæssige niveau ved metaanalyse, kan aktivere mere præcise resultater. Mange undersøgelser foreslår metoder til meta-analyse af microarray data med henblik på at identificere markant differentielt udtrykte gener på tværs af studier ved hjælp af statistiske metoder, hvorved direkte sammenligning af genekspression værdier [30]. Evalueringen af ​​flere datasæt som ansat i denne undersøgelse har vist sig at give mere pålidelige og gyldige resultater, fordi de er baseret på store prøvenumre og den enkelte skævhed forårsaget af hver undersøgelse er svækket [30].

Det vides ikke, hvorfor VDAC1 korrelerer med dårlige overlevelse resultater. For at forstå de mest relevante genetiske funktioner i VDAC1 overekspression NSCLC, gennemførte vi en genekspression metaanalyse [31], [32] for at identificere en delmængde af gener (underskrift), der blev væsentligt beriget. Vi ansat stringente statistiske kriterier, kombineret med en stor stikprøvestørrelse at støtte identifikationen af ​​disse VDAC1-covariant gener. VDAC1 og 6 gen signatur blev derefter valideres over bryst, myelom og NIC-60 datasæt [33], hvilket tyder på berigelse af gener, der var uafhængig af den type kræft.

Interessant, af de 6 gener identificeret som værende bevaret og signifikant forskelligt reguleret i den høje VDAC1 udtrykke gruppe, de fleste var funktionelt knyttet til reguleringen af ​​protein omsætning. Disse gener inkluderet varme shock 70 kDa protein 4 (HSPA4), ubiquitin-konjugerende enzym E2D 2 (UBE2D2), og varme shock 70 kDa protein 9 (Mortalin /HSPA9), der koder for en glukose reguleret 75 kilodalton protein tidligere rapporteret som korrelere med dårlig overlevelse i kolorektal kræft [34]. HSPA9 binder også og inaktiverer vildtype p53 [35], og regulerer RAS RAF MEK vej [36]. Tilsvarende p53 og RAS er mål for GTPase aktiverende protein (SH3-domæne) binding protein 1 (G3BP1) [37], og vist at forudsige kortere overlevelse i øsofageal cancer [38]. Kasein kinase 1, alfa 1 (CSNK1A1) regulerer protein omsætning via initiering af oversættelse via EIF2 og deltager i Wnt signalering; en homolog CSKNK2A1 er tidligere blevet identificeret som en uafhængig forudsiger af overlevelse i pladecelle lungecancer [39]. Ligesom G3BP1, er heterogen nukleare ribonukleoprotein C (C1 /C2) eller HNRNPC involveret i RNA bindende og transskription [40].

De PPI netværk identificeret, at de vigtigste kombinerede aktiviteter VDAC1 gener (CSNK1A1, G3BP1, HSPA4 , HSPA9 og UBE2D2) blev fokuseret på ATP og nucleotidbindende. Specifik individuel beriget funktionalitet også fundet sted, f.eks proteinkinaseaktivitet og vært-virus interaktion (associeret med gener CSNK1A1 og VDAC1 henholdsvis). Interessant, selvom mindre fremtrædende i PPI-netværk, de to ikke-hub-ikke-flaskehalse gener, HSPA9 og G3BP1 blev beriget med forskellige sæt af funktioner. I tilfælde af G3BP1 blev signaltransduktion fremhævet (både lille GTPase og RAS-protein), sammenholdt med de forbindende gener, RAF1 og Grb2. HSPA9 især var forbundet med to grupper af funktioner: protein målretning og transport (intracellulært protein, nukleare og nucleocytoplasmic), sammenholdt med TP53 og KPNA2; og negativ regulering apoptose (sammen med TP53 og RASA1).

Konklusioner

Sammenfattende baseret på dårlig prognose forbundet med overekspression af VDAC1 og den tilhørende 6-gen signatur, metoder til at målrette dette molekylær underklasse af NSCLC kan være effektiv til at forbedre overlevelsen resultater efter operationen. Vi har identificeret cellelinjer, som har opregulering af 6-genet signatur findes i VDAC1 overudtrykker NSCLC. Igangværende arbejde har til formål at målrette denne signatur for at bestemme virkningerne på cellelevedygtighed under anvendelse konnektivitet kort. Vi foreslår, at regulere ekspressionen af ​​VDAC1 og /eller gener med den 6-genet signatur, kunne tilvejebringe en ny terapeutisk strategi til at målrette risiko patienter fattige med NSCLC.

Materialer og metoder

Gen-ekspression datasæt

at gennemføre genekspression metaanalyse, et bibliotek med 8 NSCLC genekspression datasæt blev kurateret fra NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) [41]: GSE8894, GSE3141 (array seværdighed: HG-U133 Plus2.0 ), GSE6253, GSE4573 (array seværdighed: HG-U133A), GSE6253 (array seværdighed: HG-U133B), GSE6253 (array seværdighed: HG-U95Av2), GSE4716 (array seværdighed: GeneFilter Menneskelig Microarray Slip II) og GSE5123 (array typen : PC Humant Operon v 2 21k). De havde 602 prøver i alt og indeholdt genekspression oplysninger om primært resektion tumorprøver der ikke havde modtaget nogen tidligere behandling. De blev præ-behandlet ved hjælp af R [42] og BioConductor [43]. Normalisering blev udført under anvendelse af RMA-algoritmen [44] som gennemført i BioConductor. Data var base- to log-transformerede givet fald. Sammen med genekspression målinger, der var også optagelser af patientoplysninger, herunder alder, køn, histologi og samlet overlevelse tid, og i nogle tilfælde fase, gentagelse overlevelsestid, tumor stadie (PT) og nodal etape (PN) blev også registreret . Generne, der blev fundet at være signifikant forskelligt udtrykt i NSCLC datasæt blev derefter valideret i uafhængige brystkræft datasæt opnået fra GEO: GSE6434 indeholder HG-U95Av2 array-data fra 24 patienter, som havde fået kemoterapi og GSE2034 med HG-U133A array-data fra 286 prøver. Vi testede også meta-signatur i en myelom datasæt (GSE2658) med HG-U133 Plus2.0 array-data fra 559 patienter, som havde fået kemoterapi. Yderligere validering blev fundet gennem en analyse af NCI60 cellelinje panel (GSE2003) var vi kontrolleret genekspression matches hvad vi fandt i vores delmængde af væsentlige gener. Derudover vi kontrolleret vores resultater ved at udføre principal komponenter analyse af data i GSE3141.

univariate og multivariate overlevelsesanalyse

Fordelingen af ​​VDAC1-ekspression opdelt i tertiles for hvert datasæt, der svarer til lav, middel og høj. Kaplan-Meier kurver blev plottet hjælp Prism (GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com) baseret på overlevelsesdata, sammenligne det højeste versus laveste tertil for VDAC1, i første omgang disse parceller blev produceret for alle data og da kun for fase I. hazard ratio sammenligner lave og høje VDAC1 udtrykke prøver blev beregnet. Vi udførte korrelationsanalyse mellem VDAC1 udtryk og overlevelsestid hjælp Spearmans Rank korrelationskoefficient. Vi har også udført univariate og multivariate analyse ved hjælp PASW (SPSS: En IBM selskab) blev tilbagefald-fri og samlet overlevelse bruges som kliniske endpoints at vurdere prognostisk betydning af VDAC1; den logrank forholdet blev anset for at være væsentlig, hvis p 0,05. Cox multivariat analyse blev anvendt til at bestemme, om VDAC1 er en uafhængig prognostisk variabel i forhold til 7 kliniske variabler. Alder, køn, stadium, histologi, tumorstørrelse (PT), nodal trin (PN) og overlevelse

Overvåget microarray metaanalyse

Vi vedtog metoden benævnt metaanalyse af microarrays til at bestemme, hvad gener blev reguleret ved siden VDAC1 [45]. Hver datasæt blev underopdelt efter VDAC1 udtryk i tertiles; vi sammenlignet de øverste og nederste VDAC1 tertiles prøver under anvendelse TMeV [46]. Hvert gen blev vurderet for differentiel ekspression ved hjælp af en to klasse t-test for hvert datasæt med klasse 1 er lav VDAC1 udtryk og klasse 2, høj VDAC1 udtryk. Bonferroni korrektion blev også brugt, og denne analyse blev udført på alle de 8 datasæt. Bonferroni korrektion hjælper med at minimere sandsynligheden for at generere falske positiver. Antallet af prober er langt med nogle datasets indeholder mere end 54.000, så at reducere vores betydelige gener til et overskueligt liste pr datasæt vi anvendte en stringent cut off kriterier, hvor et gen var mærket som signifikant differentielt udtrykt, hvis t-test returnerede ap værdi på mindre end 0,001. De samme hypoteser blev testet i hver NSCLC datasæt uafhængigt fx gener differentielt udtrykt baseret på VDAC1 ekspression. For at aktivere flere hypoteseafprøvning, vi brugte en metode, der sammenligner statistiske foranstaltninger og Q-værdier (anslået falsk opdagelse satser) beregnes uafhængigt af hvert datasæt [32], [47], hvor

Hvor p er sandsynligheden, n er det samlede antal gener og i er den sorterede rang af p-værdi. Den strenge p-værdi cut-off vi anvendt blev fremført, da Q-værdierne blev beregnet. Efter ranking de væsentligt differentielt udtrykte gener baseret på deres Q-værdi en retning og betydning tærsklen til Q 0,10 blev sat til at definere differentierede udtryk underskrifter fra de allerede beregnede forskellen udtryk analyse. Efter at have opnået en ordnet liste over differentielt udtrykte gener for hver dataset gener blev derefter filtreret baseret på antallet af datasæt, hvor de blev differentielt udtrykte .. Generne, der blev defineret som værende signifikant forskelligt udtryk blev derefter valideret i uafhængige brystkræft datasæt (GSE6434 og GSE2034) fås fra GEO med 24 og 286 prøver hhv. Vi testede også meta-signatur i en myelom datasæt (GSE2658) med 559 prøver. T-test blev udført på denne supplerende data; vi sammenlignet høj og lav VDAC1 udtrykkende prøver for at bestemme, om generne fra vores underskrift blev identificeret endnu en gang. Den samme fremgangsmåde blev anvendt på NCI60 cellelinjer til at identificere cellelinjer, hvor ekspressionsniveauer matcher vores signatur.

Protein-protein interaktion netværksanalyse

Brug VDAC1 og de seks associerede SDE gener som frø sammen med deres samspil findes i det humane protein reference Database (HPRD) [48], blev en forælder PPI netværk (herunder rekursive interaktioner) skabt ved hjælp af en in-house Java-baseret program. Ved hjælp af disse frø proteiner som den første dybde (niveau 0), blev efterfølgende dybder opnået under anvendelse snebold prøveudtagning. Den resulterende forælder PPI netværk (9,266 gen noder, 38.800) blev derefter set, manipuleres og analyseres i Cytoscape [49]. Brug af netværket Analyzer plug-in [50] gen noder blev derefter identificeret som enten hubs eller flaskehalse ved hjælp af klassifikationen af ​​Yu et al [28];