PLoS ONE: Modulation af intracellulært calcium niveauer ved calciumlactat Påvirker Colon Cancer Cell motilitet gennem Calcium-Dependent Calpain

Abstrakt

Kræft celle motilitet er et centralt fænomen regulerer invasion og metastase. Fokal adhæsion kinase (FAK) spiller en vigtig rolle i cellulær adhæsion og metastase af forskellige kræftformer. Forholdet mellem kosttilskud af calcium og coloncancer er blevet omfattende undersøgt. Imidlertid er ikke klart forstået, effekten af ​​calcium (Ca

2+) tilskud på calpain-FAK-motilitet. Vi søgte at identificere den mekanisme af FAK spaltning gennem Ca

2+ bundet laktat (Cala), dens nedstrøms signalering og rolle i motilitet af humane colon cancerceller. Vi fandt, at behandling HCT116 og HT-29-celler med CaLa straks øgede intracellulære Ca

2 + (ICA

2+) niveauer i en længere tidsperiode. Ca

2+ tilstrømning induceret spaltning af FAK i en N-terminal FAK (FERM domæne) på en dosis-afhængig måde. Phosphoryleret FAK (p-FAK) blev også spaltet i dens p-N-terminale FAK. CaLa øget tyktarmskræft celler motilitet. Calpeptin, en calpaininhibitor, vendt virkningerne Cala på FAK og pFAK spaltning i begge kræft cellelinjer. Det spaltede FAK translokerer til kernen og modulerer p53 stabilitet gennem MDM2-associeret ubiquitinering. CaLa-induceret Ca

2+ tilstrømning øget motilitet kolon kræftceller blev medieret af calpain aktivitet gennem FAK og pFAK protein destabilisering. Afslutningsvis disse resultater tyder på, at omhyggelig overvejelse kan gives i at beslutte kosten Ca

2+ tilskud til patient i behandling for metastatisk cancer

Henvisning:. Sundaramoorthy P, Sim JJ, Jang YS, Mishra SK, Jeong KY, Mander P, et al. (2015) Modulation af intracellulært calcium niveauer ved calciumlactat Påvirker Colon Cancer Cell motilitet gennem Calcium-Dependent calpain. PLoS ONE 10 (1): e0116984. doi: 10,1371 /journal.pone.0116984

Academic Redaktør: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, England

Modtaget: 31 Jul 2014; Accepteret: 17. december 2014 Udgivet: 28 januar 2015

Copyright: © 2015 Sundaramoorthy et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Gachon Institute of Pharmaceutical Fund Sciences Research 2013 Gachon University, Republikken Korea. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne erklærer der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyktarmskræft er den tredje hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan, der tegner sig for over 600.000 dødsfald hvert år med stigende forekomst. Kræftfremkaldende induktion i tyktarmen sker gennem en sekvens af begivenheder, der fører til metastase involverer forskellige onkogene proteiner. Fokal adhæsion kinase (FAK) spiller en kritisk rolle i tyktarmskræft progression og er en vigtig onkogen protein involveret i celleproliferation, overlevelse og motilitet [1,2]. Calpain er en velbevaret cysteinprotease aktiveres ved forøget intracellulær Ca

2+ (ICA

2+). Det lokaliserer til fokal vedhæftning, og potentielt fremkalder spaltning af fokale adhæsionsproteiner. Forholdsvis, metastatiske tumorer indeholder højere niveauer af calpain end ikke-metastatiske tumorer. Calpain-medieret FAK nedbrydning er kritisk for motilitet i humane coloncancer-celler [3]. Det fremgår, at funktionen af ​​calpain i celleadhæsion og motilitet begrænser deres evne til at spalte komponenter af fokale komplekser, som igen kan øge vedhæftning omsætning og funktionelt signifikant tumorprogression [4,5].

ICA

2+ ion er en vigtig signalmolekyle som modulerer talrige cellulære processer i kræft fysiologi, herunder cellemotilitet. ICA

2+ holdes på en lav koncentration (~ 100 nM) sammenlignet med det ekstracellulære frit Ca

2+ (1,2 mM) [6,7]. Lave niveauer af cytoplasmatisk Ca

2+ opretholdes gennem aktiv udstrømning fra celler via plasmamembranen Ca

2+ ATPase pumpe, mens sarcoendoplasmic retikulære Ca

2+ ATPase fjerner Ca

2+ ved proton udveksling . Andre Ca

2 + permeable kanaler såsom lagret betjente calciumkanaler, forbigående receptor potentielle (TRP) kanaler og calcium frigivelse aktiveret kanal (CRAC) protein 1 er også involveret i Ica

2+ homøostase. Remodeling eller deregulering af Ica

2+ homøostase i kræftceller forårsager ændringer i kræft progression [8]. Kosttilskud af Ca

2+ var kendt for at reducere risikoen for kolorektale adenomer og cancer [9]. Men virkningen af ​​Ca

2+ kosttilskud er ukendt på kræft metastaser.

Normale celler har en lav koncentration af ekstracellulær laktat på mellem 0,5 og 2 mM, men koncentrationen for kræftceller kan være så høj som 30-40 mM [10]. Cancercelleoverlevelse kræver et alkalisk intracellulære miljø og sure ekstracellulære miljø [11,12]. Monocarboxylat transportører (MCT) primært kontrollere flytning af intracellulære og ekstracellulære mælkesyre [13]. er blevet påvist forhøjede niveauer af MCT1 i bryst-, tyktarms-, mave- og livmoderhalskræft. MCT4 ekspression er stærkt forhøjet i renale carcinoma, cervical og prostatacancer [14]. MCT4 frigiver laktat som reaktion på hypoxi, mens laktat optagelse i iltet tumorceller sker via MCT1 [15,16]. Laktat fungerer som et substrat for oxidativ metabolisme i oxygenerede tumorceller.

Baseret på oplysninger om Ca

2+ kosttilskud i metastatisk cancer, vi undersøgte motilitet tyktarmskræft celler ved direkte eksponering for Ca

2+ bundet laktat (Cala). Vi fokuserede på calpain-FAK-celle vej til at forstå de underliggende molekylære mekanismer i human tyktarmskræft celle motilitet.

Materialer og metoder

Cell kulturer

Alle cellelinjer var indkøbt fra American Type Culture Collection (Manassa, Va). Human colon cancercellelinier HCT116, HT-29, og DLD1were dyrket i RPMI1640-medium. Normal colon cellelinie CCD-18Co blev dyrket i DMEM medium suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin i en fugtig atmosfære ved 37 ° C indeholdende 5% CO

2.

Reagenser og antistoffer

Cala, FAK-hæmmer (TAE226), calpain-hæmmer (Calpeptin), Flu-03:00 blev købt fra Sigma (St. Louis, Mo). Primære antistoffer anvendt til Western blot-analyse (FAK, pFAK, calpain-2, p53, MDM2, pMDM2, α-tubulin, Lamin B, GADPH) og de tilsvarende sekundære antistoffer blev købt hos Cell Signaling Technology (USA).

termodynamik af divalent metalion binding til mælkesyre

for at måle de bindende isotermer for interaktion af den bivalente metalion Ca

2+ til mælkesyre, blev udført isotermiske titrering kalorimetri (ITC) eksperimenter ved hjælp af en Microcal 200 thermo titrering mikrokalorimetret (Microcal, Inc., Northampton, MA). Dataindsamling, analyse og plotte blev udført ved hjælp af Windows-baseret software-pakke Origin (version 7.0; leveret af Microcal). Den titrering mikrokalorimetret indeholdt prøve og referenceceller afholdt i en adiabatisk kabinet. Henvisningen Cellen blev fyldt med destilleret vand. Typiske titreringer involverede injektion af 1,5 pi 5 mM Ca

2+ ion (under anvendelse af en computerstyret injektor) ind i prøvecellen (fyldt med 0,5 mM af mælkesyre ved pH 7,0). Prøver blev injiceret ved 2-minutters intervaller for at sikre, at titreringskurverne var vendt tilbage til baseline før næste injektion. Sprøjten omrøringshastighed blev indstillet til 1000 rpm. Absorptionen eller frigivelse af varme under hver injektion blev målt ved hjælp af kalorimeter. Titrering isotermer for de bindende interaktioner omfattede forskellen varmestrømme for de forskellige injektioner. Disse værdier blev derefter integreret til bestemmelse enthalpiændringen knyttet til hver injektion. Heat ændringer forårsaget af injektionen af ​​hver metalion i destilleret vand var ubetydelig. Fortyndingen data blev trukket fra eksempeldataene og dårlige datapunkter blev fjernet. Dataene montering blev udført under anvendelse Origin software (version 7.0), og tilpasningsprocessen blev titreret indtil den bedste tilpasning bestemt ved chi-square minimering metode blev opnået. Montering af bindende isotermer på denne måde gives på bindingskonstant (Ka), ændring i entalpi (AH), og støkiometri af binding (n). Bindingen Gibbs fri energi (AG) blev beregnet fra enthalpiændringen (AH) og bindingskonstant (Ka) ved anvendelse af ligningen: AG = RTlnKa = ΔHTΔS, hvor R er gaskonstanten, og T er den absolutte temperatur i grader Kelvin [17]. I mellemtiden blev støkiometrien s (n) af de forskellige interaktioner bestemmes ud fra et sæt af sider modeller.

Måling af Ica

2+ koncentration

Cytosolisk gratis Ca

2+ ionkoncentrationer blev målt under anvendelse af et Konfokal laser-Scanning Microscope (Leica, Heidelberg, Tyskland). Cultured HCT116 og HT-29-celler blev ladet med 10 uM Fluo-3 /AM og 1 pi 25% Pluronic F-127 (opløst i DMSO) og inkuberet i 30 minutter ved 37 ° C. Efter indlæsning fluorescens sonder blev 2,5 mM Cala tilsættes, og billedet blev erhvervet. Fluo-3 /AM var begejstret ved 488 nm og udsendte fluorescens blev målt ved 515 nm. Intracellulær Ca

2+ værdierne er udtrykt som F /F0 nøgletal, hvor F0 er den indledende fluorescensintensitet (Billede J software analyse).

sårheling assay

For sårheling assay, ibidi kultur insert bestående af to reservoirer adskilt af en 500 um tyk væg blev anvendt. Celler blev podet i to-kammer (100 pi 4 × 10

5 celler /ml) ibidi kultur insert. Efter 24 timers inkubation blev kammeret forsigtigt fjernet opstår et hul på ~ 500 um. Celler blev derefter lov til at migrere ind i de blottede områder i 6 timer. Den levende celler blev udført ved hjælp af JULI Br, levende celle analysator (NanoEnTek Inc, Sydkorea).

Western blot-analyse

Cellular lysater blev fremstillet, og en tilsvarende mængde protein blev adskilt ved SDS PAGE og blottet på polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner som tidligere beskrevet [18,19,20]. Specifikke primære antistoffer, efterfulgt af HRP-konjugeret sekundært antistof blev anvendt til påvisning af specifikke proteiner under anvendelse af ECL-systemet (AbClon) for signal detektion.

immunofluorescensanalyse

HCT116 og HT-29 celler blev behandlet med CaLa i 12 timer. Celler blev fikseret i 100% kold ethanol i 20-30 min ved -20 ° C, permeabiliseret med 0,3% Triton X100 i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur og vasket serielt i PBS. Celler blev blokeret med 3% hesteserum i PBS i 1 time ved stuetemperatur og vasket med PBS. Celler blev derefter inkuberet med FAK-antistof (1: 800) med 3% hesteserum i PBS ved 4 ° C natten over. Celler blev vasket med PBS og efterfølgende inkuberet med Alexa-488 konjugeret sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. Celler blev derefter forseglet med montering medier indeholdende DAPI (Vectashield, Vector Laboratories). Billeder blev taget med konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM, Nikon A1 +, Japan).

statistiske analyser

Alle data blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (SD). Statistisk signifikans blev vurderet ved hjælp af t-test og

P

0,05 blev betragtet som signifikant.

Resultater

Mælkesyre binder sig til calciumioner med høj affinitet

Vi analyserede de termodynamiske egenskaber Cala og bindende interaktioner mellem Ca

2+ og mælkesyre ved isotermiske titrering kalorimetri (ITC). Repræsentative ITC data vedrørende bindingen af ​​mælkesyre til Ca

2+ ved pH 7,0 er vist i fig. 1. Yderligere oplysninger, herunder de beregnede foreningens konstanter og enthalpi og entropi af foreninger er anført i tabel 1. Resultaterne viser, at mælkesyre bindes til Ca

2+ med K

d 6,2 × 10

-5 M, en termodynamisk egnet betingelse for at danne CaLa salt. Vores termodynamiske beregninger viste, at en laktat molekyle binder sig til 0,361 Ca

2 + ioner, selvom to-laktat molekyle binder til en Ca

2 + ioner i teorien. ITC data viser muligheden at ekstracellulær mælkesyre i form af lactat kan danne CaLa salt, som kan eksistere som en opløselig form under vandige opløselighedsgrænse koncentration (7,9 g /100 ml). Disse data tyder også på, at CaLa kan anvendes til at administrere intracellulært calcium, som kan dissociere under variabel miljø.

Tre repræsentative isotermer er vist illustrerer binding som en funktion af pH ved 37 ° C. Øvre og nedre paneler viser resultaterne af kalorimetriske titrering af 1,5 pi 5 mM Ca

2+ og 0,5 mM mælkesyre-blanding i 5 mM Tris-HCI ved pH 7,0. For hver titrering, er rådata vist i det øverste panel og integrerede varme data er vist i det nederste panel.

Cala administration steg Ica

2 + niveauer

Vi vurderede effekten Cala administration på kolon kræftceller og analyseret niveauerne af dissocierede Ica

2+. HCT116 og HT-29-celler blev behandlet med 2,5 mM CaLa der viste en bemærkelsesværdig forskel på 0 og 600 sekunder i begge cellelinier. Den eksperimentelle validering blev gjort ved hjælp af ionomycin, en ionophor bruges til at hæve ICA

2 + niveauer. Lonomycin (10 uM) drastisk Ica

2 + i de første par sekunder, efterfulgt af en gradvis reduceret i begge cellelinier (fig. 2). Selvom ionomycin rejst Ica

2+ niveauer, disse resultater antyder, at ionomycin ikke er stabilt i colon cancer cellelinjer. Men i HCT116-celler, CaLa gradvist Ica

2+ til sit maksimale niveau på 480 sekunder og derefter nåede et plateau (fig. 2A). HT-29-celler nået til maksimal Ica

2+ koncentration mellem 50 og 100 sekunder, og derefter nåede et plateau (fig. 2B). Disse resultater antydede, at CaLa øget Ica

2 + niveauer og opretholdt disse niveauer i en længere tidsperiode.

Cultured HCT116 (A) og HT-29 (B) celler blev behandlet med Fluo-03:00 fluorescens prober som beskrevet i materiale og metoder. Celler blev efterfølgende inkuberet med 2,5 mM CaLa og 10 pM ionomycin i DMSO (kontrol). Billede blev erhvervet på et tidspunkt punkt på 0 sekunder som indledende og 600 sekunder som maksimal hjælp Konfokal Laser-Scanning Microscope (Leica, Heidelberg, Tyskland). Ca

2+ fluorescens billede blev omdannet til fluorescensintensitet og plottet som den angivne F /F0 (Billede J software analyse). F0 er den indledende fluorescensintensitet.

Cala moduleret FAK stabilitet

Nylige undersøgelser tyder på, at overekspression af onkogen FAK er forbundet med carcinogenese af forskellige humane cancerceller [21,22]. ICA

2+ aktiverer calpain, der nedbryder FAK og øger motilitet af cancerceller [3,4,5,9]. Efter at have observeret, at CaLa øger Ica

2 + niveauer i colon cancer cellelinjer, undersøgte vi effekten af ​​CaLa på FAK stabilitet i disse celler. Vi undersøgte ekspressionen af ​​FAK og pFAK i normal colon (CCD-18Co) og tyktarmskræft cellelinjer (Fig. 3A). Resultaterne viste, at CCD-18Co celler har nominelle ekspression af FAK og dermed lavere niveauer af pFAK sammenlignet med tyktarmskræft cellelinier, der udtrykker høje niveauer af FAK og pFAK. Hver coloncancercellelinie viste forskellige ekspressionsniveauer af FAK og pFAK. CCD-18Co celler viste et normalt niveau af pFAK. HT-29 og DLD-1-celler viste højere niveauer af pFAK sammenlignet med HCT116. Derfor har vi fokuseret på HCT116 og HT-29 cellelinjer til yderligere undersøgelser i forbindelse med FAK protein stabilitet. Derudover udførte vi en dosisafhængig analyse for virkningerne af CaLa på HCT116 og HT-29-celler (fig. 3B). Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af CaLa i 12 timer og FAK spaltning blev vurderet. Den fulde længde af FAK og pFAK er en 125 kDa. CaLa spaltet FAK til et 90 kDa protein N-FAK (FERM domæne) med stigende koncentrationer med den højeste aktivitet ved 2,5 mM. Tilsvarende blev pFAK spaltet i dens p-N-FAK på en dosis-afhængig måde med optimal aktivitet ved 2,5 mM CaLa (fig. 3B). Disse resultater indikerer, at CaLa destabiliserer FAK og pFAK og forårsager spaltning af begge proteiner i colon cancerceller.

(A) FAK-udtryk blev analyseret på normal colon epithelial cellelinje CCD-18Co og forskellige coloncancer-cellelinjer ( HCT116, HT-29 og DLD1). HCT116 og HT-29 (B) blev behandlet med forskellige koncentrationer af CaLa i 12 timer. Western blotting udført fra cellelysater viste, at CaLa inducerede FAK og pFAK spaltning i en dosis-afhængig måde.

FAK destabilisering gennem CAPLAIN aktivitet ved Cala

Nylige undersøgelser viser, at FAK og dets phosphorylerede form er vigtige for fokal vedhæftning omsætning. FAK spaltes af calpain, en Ca

2+ afhængig protease, der spiller en kritisk rolle i fokale vedhæftning dynamik i motile celler [4]. Calpain er involveret i flere centrale aspekter af kræft celleadhæsion, migrering, og metastase [23]. Da CaLa øget Ca

2+ tilstrømning og spaltede FAK, så vi bestemt virkningerne af CaLa på calpain i HCT116 og HT-29 celler (Fig. 4). Resultaterne viser, at CaLa forårsagede tidsafhængig spaltning af FAK og pFAK proteiner, men der var ingen effekt på de niveauer på calpain-2 i begge cellelinier. For at bekræfte resultaterne, brugte vi calpeptin, en Rho-kinase-aktivator og en inhibitor af calpain, der er en del af en familie af calciumafhængige cysteinproteaser. Calpeptin (20 uM) vendt virkningerne Cala på FAK og pFAK spaltning i begge cellelinier med nogen effekt på calpain-2 protein niveauer (Fig. 4). Disse data tyder på, at CaLa øget Ca

2 + tilstrømning og calpain aktivitet, men ikke dens protein niveauer. Det er kendt, at spaltet FAK medierer nedbrydning af p53 gennem nuklear translokation af N-FAK. Celler behandlet med CaLa viste nedsat niveau af p53, hvilket blev vendt ved calpeptin. Calpeptin inhiberede calpain-2, så det ikke spalte FAK, svækkende p53 nedbrydning. Disse resultater fastslået, at CaLa-induceret FAK spaltning forbedret p53 nedbrydning og calpain-2-aktivitet, men uden virkning på calpain proteinniveauer.

HCT116 og HT-29-celler blev behandlet med 2,5 mM CaLa i kombination med calpaininhibitor ( calpetin 20 uM) i den angivne tidsafhængig måde. Western blot data viser, at calpain-hæmmer, calpeptin, reduceret FAK og pFAK spaltning samt p53 nedbrydning.

Spaltet FAK translokeres i nucleus

Undersøgelser viste, at translokation af nuklear FAK fremmes overlevelse celle gennem øget p53 nedbrydning under forhold med cellulære stress [24,25]. CaLa induceret spaltning af FAK til et 90-kDa protein, som blev translokeres til kernen. Fig. 5 repræsenterer western blot analyse fra hele, cytoplasmatiske og nukleare fraktioner af celler behandlet med CaLa, og deres immunocytokemi. Hele cellelysat og cytoplasmatisk fraktion af begge cellelinier behandlet med CaLa viste FAK og spaltes FAK. Nukleare fraktioner af ubehandlede celler havde lave niveauer af FAK, men behandling med CaLa øget FAK og spaltes FAK niveauer i nukleare fraktioner (fig. 5A). De nukleare translokationer af N-FAK i HCT116 og HT-29 (fig. 5 B og C) blev visualiseret efter inkubation med anti-FAK primært antistof efterfulgt af farvning med Alexa-488 konjugeret sekundært antistof. Det konfokale mikroskopi af kontrolceller viste DAPI farvede kerner uden Alexa-488-farvet FAK. Men konfokal billeddannelse Cala-behandlede celler viste translokation af Alexa-488 farvet N-FAK i DAPI farvede kerner. Disse resultater viser klart, at 2,5 mM CaLa spaltet fuld længde FAK der translokeres ind i kernen.

translokation af N-FAK blev analyseret ved western blot (A) og immuncytokemi (B-C). HCT116 og HT-29-celler var frø i en 8-brønds kammer og behandlet med 2,5 mM CaLa i 12 timer. Translokation blev analyseret ved konfokal mikroskopi. WE, hel celle udvinding; CE, cytoplasmatisk udvinding NE, nuklear udvinding translokeres N-FAK er angivet med en pil. Målestok:. 2,5 uM

Cala øget motilitet kolon kræftceller

Da FAK er kendt for at spille en afgørende rolle i vedhæftning, migration, proliferation og differentiering i cancerceller [ ,,,0],1,2], vi undersøgte effekten Cala på disse cellulære egenskaber i kolon kræftceller. Vi udførte sårheling assay i HCT116-celler behandlet med CaLa alene eller i kombination med calpeptin (fig. 6). Resultater viser, at CaLa (2,5 mM) steg motilitet HCT116 celler. Calpeptin alene syntes ikke at ændre motilitet. Interessant nok blev det vist, at anvendelsen af ​​calpeptin (20 uM) i kombination med CaLa reduceret virkningen af ​​CaLa hæmmede cellevandring (fig. 6 A-B). Yderligere observerede vi, at TAE226 (FAK inhibitor) formindskede signifikant cellemotilitet. Disse resultater antyder, at Ca

2+ tilstrømning medierer FAK nedbrydning gennem calpain-aktivitet. TAE226 viste antitumorvirkninger i colon cancerceller. Det reducerede størrelsen af ​​formidles tumorer og forlænget overlevelse i tumor-bærende mus [26]. For at bekræfte vores observationer, udførte vi en komparativ analyse af FAK og pFAK niveauer i HCT116 og HT-29 under anvendelse TAE226 (fig. 6C). TAE226 (2,5 uM) hæmmede pFAK udtryk i en tidsafhængig måde hæmmede ikke alt FAK. CaLa-induceret FAK og pFAK spaltning øget motilitet i forhold til TAE226, som undertrykte pFAK aktivitet og nedsat kræft cellemotilitet.

Sårheling assay blev udført i HCT116-celler. Celler blev behandlet med CaLa og sårheling hotel blev analyseret fra 0 til 6 timer efter såret (A), og middelværdier for sårareal blev analyseret under anvendelse på flere linjer graf (B). HCT116 og HT-29-celler blev behandlet med 2,5 mM CaLa i tidsafhængig måde induceret FAK og pFAK spaltning (C). pFAK inhibitor (TAE226 2,5 uM) reducerede pFAK niveauer som påvist ved western blot.

kløvet-FAK medieret p53 nedbrydning gennem MDM2-afhængig ubiquitinering

Tidligere undersøgelser indikerede, at strukturen i FERM -FAK kan translokere ind nucleus og modulerer p53-protein stabilitet gennem MDM2 [25]. Derfor undersøgte vi den mekanisme af p53 nedregulering af CaLa. CaLa alene inducerede spaltning af FAK og pFAK. Behandling af MG132 med CaLa paradoksalt nok genvundet FAK og pFAK spaltning (fig. 7). Behandling af celler med CaLa inhiberede p53 niveauer, mens MG132 genvundet niveauerne af p53. Behandling af MG132 i kombination med CaLa genvundet effekten Cala på p53 proteosomal nedbrydning. Desuden har vi observeret, at MDM2 og PMDM2 protein niveauer ikke blev ændret ved behandlinger med CaLa, MG132 eller begge dele. Således er disse resultater antyder, at MG132 genvundet p53 fra CaLa gennem MDM2-associeret ubiquitinering.

HCT116 og HT-29-celler blev behandlet med 2,5 mM CaLa i kombination med en proteasomalaktivitet inhibitor (MG132 10 uM) i 10 timer. Western blot blev udført fra cellelysater og proteiner blev påvist som beskrevet i metoder.

Diskussion

Denne undersøgelse viser, at calciumlactat-induceret Ca

2+ tilstrømning øger motilitet af tyktarmskræft celler gennem destabilisering af FAK og pFAK proteiner. Denne undersøgelse viser virkningen af ​​Ica

2+ på calpain-FAK-cellemotilitet pathway. CaLa-medieret spaltning af FAK og pFAK blev voldgiftsbeslutning gennem calpain aktivitet, hvilket har øget motilitet af tyktarmen kræftceller. Den spaltede FAK translokeres til kernen og øget p53 nedbrydning samt calpain-aktivitet. Effekten af ​​ekstracellulær lactat blev rapporteret i flere undersøgelser om motilitet af cancerceller. En væsentlig forskel mellem denne undersøgelse og tidligere undersøgelser af laktat er den kemiske enhed.

monocarboxylat transportører (MCT) normalt medierer laktat tilstrømning og udstrømning, og at forhøjede niveauer af MCT1 er blevet påvist i mange kræftformer, herunder kræft i tyktarmen [16]. Laktat udgivelse i hypoxiske celler medieres gennem MCT4, mens laktat optagelse i iltet tumorceller medieres via MCT1 [15,16]. Det fremgår, at CaLa selv transporteres i cytoplasmaet således øge Ica

2+ og lactat koncentrationer coincidently observeres. Imidlertid er den specifikke transportmekanismen ikke identificeret. De foreliggende resultater viser, at lav koncentration Cala formidlede den FAK-afhængige motilitet i tyktarmen kræftceller. Tidligere undersøgelser indikerede, at natriumlactat blev anvendt i koncentrationer så høje som 20 mM [10]. Denne høje område blev observeret i maligne og metastatiske tumorer i store størrelser. Høje koncentrationer af lactat i tumorer blev korreleret med en høj forekomst af fjernmetastaser og andre maligne adfærd af cancerceller [27]. Derfor brugte vi lave koncentrationer af lactat for at undgå cancermetastase. Ved at behandle celler med lave koncentrationer af CaLa, Ca

2+ tilstrømning steget og opretholdes i en længere periode, hvilket øgede calpain aktivitet. Den intracellulære thiol protease calpain katalyserer begrænset proteolyse af forskellige fokal adhæsions strukturelle proteiner og signalanlæg enzymer i adhærente celler. Calpainer er involveret i flere vigtige aspekter af migration, herunder vedhæftning og spredning. Farmakologisk inhibering af calpainer reduceret integrin-medieret cellemigration [23]. Nylige undersøgelser giver yderligere støtte til calpain som en vigtig modulator af cellemotilitet gennem sin evne til at regulere fokale vedhæftning dynamik. Calpain-medieret FAK nedbrydning er kritisk for motilitet i humane coloncancer-celler [3]. Høje niveauer af FAK ekspression er blevet forbundet med øget invasivitet i maligne tumorer. Men mekanismerne af FAK-aktivering, spaltning, og dereguleringen af ​​motilitet, er ikke klare. Signaleringsbegivenheder nedstrøms for FAK aktivering og spaltning kan bidrage til motiliteten af ​​humane coloncarcinomceller.

CaLa kan modulere vandrende potentiale oxygenerede tumorceller, der eksisterer omkring tumorkar. I tumorvæv blev vaskularitet begrænset til at levere ilt og næringsstoffer, såsom glucose og glutamin. Hypoksiske tumorer synes at være dårligt differentieret men hypoxi spiller en direkte rolle i opretholdelsen af ​​cancer stamceller [29]. Hypoksiske tumorer tendens til at producere en lactat-gradient, som bruges af oxygenerede tumorceller gennem MCT1 medieret transport, så de hypoxiske tumorceller kan udnytte glucose. Dette fænomen er kendt som det intercellulære lactat shuttle. Følgelig kunne det antages, at i det ekstracellulære miljø, der omgiver hypoxiske celler gradvist ophobes lactat i sin frie form. Imidlertid blev iltet celler leveret af calcium gennem blodforsyningen, blev laktat importeres via MCT1, sænke den ekstracellulære laktat koncentration og dens mikromiljø indeholder mindre laktat og for det meste bundet til calcium [31]. Vores resultater antyder, at oxygenerede celler er mindre motile sammenlignet med hypoxiske celler, og at metastase involverer hypoxiske celler snarere end oxygenerede celler. Eksistensen og mængden af ​​CaLa i en ekstracellulær tumor mikromiljø kan være en afgørende faktor for metastase gennem modulation af FAK. Derudover kan CaLa eventuelt styre cellemotilitet og energimetabolisme. Tumor suppressor protein p53 forebygger kræft progression gennem talrige mekanismer, herunder apoptose og cellecyklusstandsning. Der eksisterer et velkarakteriseret forbindelse mellem metabolisme og genetisk regulering af p53, hvor p53 regulerer cellens energibalance mellem glykolyse og oxidativ phosphorylering [30,31]. Tilsvarende viser vores resultater, at CaLa kan forårsage proteosomal nedbrydning af p53 (fig. 4) gennem nuklear translokation af FERM-FAK og MDM2-medieret ubiquitinering (fig. 7).

Den nuværende undersøgelse undersøgte virkningen af ​​supplerende Ca

2+ på de molekylære mekanismer i metastatisk tyktarmskræft. Betydningen Cala i modulering af tyktarmskræft celle fysiologi er ikke begrænset til basale studier, men har også en indvirkning på kliniske ernæringsmæssige resultat. Ca

2+ spiller forskellige roller i kræft progression, herunder øget apoptose eller hæmme proliferation i tyktarmen. Endvidere Ca

2+ binding til galdesalte, forhøjet i højt fedtindhold, har været forbundet med colon carcinogenese [28]. CaLa-induceret FAK spaltning og forbedret celle motilitet HCT116 celler skaber en antagelse om, at metastatiske kolon kræftpatienter har brug for mere forsigtige, når de overvejer Ca

2+ kosttilskud. Fordi ekstracellulært calcium kan ioniseret med laktat, det fører til Ca

2+ tilstrømning forårsager øget FAK spaltning og kræft celle motilitet.

Konklusioner

Den foreliggende undersøgelse belyser, at CaLa øget motilitet tyktarmskræft celler ved calpain aktivitet gennem destabilizations af FAK og pFAK proteiner. Koncentrationen og kemisk enhed Cala kan være medvirkende faktor for tyktarmskræft celle motilitet. Derfor tyder vore resultater, at motilitets virkninger på tyktarmskræft kan være relateret til brugen af ​​Ca

2+ kosttilskud. Selv en lav koncentration af Ca

2+ kan forårsage øget celle motilitet.