PLoS ONE: galectin-3 Overrides PTRF /Cavin-1 Reduktion af PC3 prostatakræft Cell Migration

Abstrakte

Ekspression af caveolin-1 (CAV1), et centralt element i celleoverfladen caveolae, er forhøjet i prostatakræft (PCA) og i forbindelse med PCa metastase og en dårlig prognose for PCA patienter. Polymerase I og Transcript Frigivelse Factor (PTRF) /cavin-1 er et cytoplasmatisk protein kræves til CAV1-afhængig dannelse af caveolae. Ekspression af PTRF reducerer motiliteten af ​​PC3-celler, en metastatisk prostatacancer-cellelinie, som endogent udtrykker rigelige CAV1 men ingen PTRF og ingen caveolae, hvilket antyder en rolle for ikke-caveolar CAV1 domæner eller CAV1 stilladser, i PCa cellemigrering. Tyrosinphosphorylerede CAV1 (pCav1) funktioner i forening med galectin-3 (Gal3) og galectin gitter til at stabilisere fokal adhæsion kinase (FAK) inden fokale adhæsioner (FA’er) og fremme kræft cellemotilitet. Men hvorvidt PTRF regulering af CAV1 funktion i PCa celle migration er knyttet til Gal3 udtryk og funktionalitet er endnu ikke fastlagt,. Her viser vi, at PTRF udtryk i PC3 celler reducerer FAK stabilisering i fokale sammenvoksninger og reducerer celle motilitet uden at påvirke pCav1 niveauer. Exogent Gal3 stabiliseret FAK i fokale adhæsioner af PTRF-udtrykkende celler og restaureret cellemotilitet af PTRF-udtrykkende PC3 celler til niveauer på PC3-celler på en dosisafhængig måde, med en optimal koncentration på 2 ug /ml. Eksogene Gal3 stabiliseret FAK i fokale sammenvoksninger af Gal3 knockdown PC3 celler, men ikke i CAV1 knockdown PC3 celler. CAV1 knockdown også forhindret Gal3 redning af FA-associeret FAK stabilisering i PTRF udtrykker PC3 celler. Vores data understøtter en rolle for PTRF /Cavin-1, gennem caveolae dannelse, som en dæmper på den ikke-caveolar funktionalitet CAV1 i Gal3-CAV1 signalering og regulering af fokale vedhæftning dynamik og kræftcelle migration.

Henvisning : Meng F, Joshi B, Nabi IR (2015) galectin-3 Overrides PTRF /Cavin-1 Reduktion af PC3 prostatakræft Cell Migration. PLoS ONE 10 (5): e0126056. doi: 10,1371 /journal.pone.0126056

Academic Redaktør: Christophe Lamaze, Institut Curie, FRANCE

Modtaget: November 28, 2014 Accepteret: 28 Mar 2015; Udgivet: 5 maj 2015

Copyright: © 2015 Meng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af prostatakræft Canada, canadiske Institutes for Health Research (MOP-126.029), Kina Scholarship Rådet-UBC ph.d. stipendium. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konkurrerende interesser: Medforfatter Ivan Nabi er en PLoS ONE Editorial Board medlem. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE Redaktionelle politikker og kriterier.

Introduktion

caveolin-1 (CAV1), et medlem af caveolin protein familien, er et centralt element i caveolae , kolbens-formede invaginationer på celleoverfladen involveret i mange cellulære processer, såsom vesikulær transport, intracellulær signalering og mekanisk transduktion [1]. CAV1 er involveret i reguleringen af ​​lipidklumper og flere cancer-associerede processer, herunder celledød og overlevelse, celle migration og invasion, og tumorvækst og metastase [1-4]. CAV1 udtryk er forhøjet i metastatisk prostatacancer (PSA) celler og CAV1 er blevet vurderet som en prognostisk markør for aggressiv PCa [5-7]. CAV1 har også vist sig i forbindelse med PCa metastase i mus og humane PCA cellelinier [5, 8]. PC3 er en metastatisk prostatacancer-cellelinie, der udtrykker rigelige niveauer af tyrosin phosphoryleret CAV1 (pCav1) men mangler celleoverflade caveolae grund af fraværet af polymerase 1 og transkript frigivelse faktor (PTRF) /cavin-1, kræves sammen med CAV1 for caveolae dannelse [7, 9-11]. Overekspression af PTRF i PC3 celler nedsætter celle motilitet via reduceret matrixmetalloprotease 9 (MMP9) produktion [12]. Yderligere undersøgelser har vist, at PTRF /Cavin-1-ekspression ændrer PC3 celle secretome ved at påvirke kolesterol dynamik og actincytoskelettet, og dæmper fremme af PCa progression af ikke-caveolar CAV1 microdomain [13, 14].

Cell migration, et kritisk element af metastatisk sygdom, er en dynamisk og flertrins proces reguleres gennem Spatiotemporal feedback mellem actomyosin sammentrækning, actin polymerisering, og kontinuerlig adskillelse og dannelse af sammenvoksninger [15-17]. Focal sammenvoksninger (FAS) er makromolekylære forsamlinger, der linker den ekstracellulære matrix og cytoskelettet og overfører mekanisk kraft og regulatoriske signaler [18, 19]. Fokal adhæsion kinase (FAK) er den vigtigste kinase involveret i FA signalering og regulerer fokale vedhæftning dynamik gennem sin kinasedomæne (FRNK) og tyrosin 397 (Y397) autophosphorylering. Reduceret FAK Y397 phosphorylering er forbundet med forøget FAK udveksling mellem FA’er og cytosol, langsommere FA afmontering og reduceret cellemigration [20, 21]. pCav1 øger membran lipid orden i FA’er og fremmer FAK stabilisering inden FA’er i multiple cancer cellelinjer, herunder PC3 PCa cellelinien, en cellelinie, som udtrykker ikke endogen PTRF og dermed ingen caveolae, antyder en rolle for ikke-caveolar CAV1 scaffolds [4 , 11, 22]. CAV1 er hovedsubstratet af Src-kinase og phosphoryleres på tyrosin 14 (Y14) [23-26]. I human, tyktarms- og prostatakræft-cellelinier, Src-afhængig phosphorylering af CAV1 fremmer FAK stabilisering i fokale sammenvoksninger, fokal vedhæftning omsætning, RhoA signalering og celle migration og invasion [11]. Galectin-3 (Gal3), en galactose-specifik lectin familie, der fortrinsvis binder celleoverfladen GlcNAc-transferase V (Mgat5) -modificeret N-glycaner, stimulerer FAK og PI3K aktivering, forbedrer integrin aktivering og rekruttering til fibrillære sammenvoksninger, og stigninger F- actin omsætning [27-30]. Vi har vist, at pCav1 og Gal3 handle sammen for at stabilisere FAK inden FA’er og fremme FA dynamik og cellevandring og koordineret ekspression af CAV1 og Gal3 skelne differentieret thyreoideacancer fra godartet [4, 31].

Men det har endnu ikke fastlagt, om og hvordan udtryk for PTRF og dermed caveolae, påvirkninger den samordnede CAV1-Gal3 regulering af FA dynamik og celle migration. Vi brugte derfor PC3 PCA celler, som mangler PTRF og caveolae men udtrykker CAV1 og pCav1, til specifikt at fastlægge den rolle, PTRF i CAV1-Gal3 regulering af FA dynamik og kræftcelle migration.

Resultater

Ekspression af PTRF /Cavin-1 formindsker PC3 celle migration og forstyrrer FAK stabilisering i fokale sammenvoksninger

PC3 prostatacancerceller stabilt udtrykker PTRF-GFP (PC3-GFP-PTRF) show faldt celle motilitet sammenlignet med PC3 celler stabil udtrykke GFP (PC3-GFP) eller ikke-transficerede PC3-celler (fig 1A), som tidligere rapporteret [12]. Den reducerede migration af PC3-PTRF-GFP celler var ikke forbundet med en ændret antal fokale sammenvoksninger mærket til FAK (Fig 1B). For at bestemme FAK stabilitet i FA’er blev PC3-celler transficeret med FAK-GFP alene, FAK-GFP plus mCherry eller FAK-GFP plus PTRF-mCherry og underkastet fluorescens bedring efter fotoblegning (FRAP) assay. Som vist i fig 1C, ekspressionen af ​​PTRF-mCherry forøgede den mobile del af FAK-GFP i FA’er forhold til PC3-celler transficeret med FAK-GFP alene eller FAK-GFP med mCherry. En øget mobil fraktion, forøget fluorescens genvinding af FAK-GFP i forhold til før-blegemiddel fluorescensintensitet, afspejler højere udveksling af FAK-GFP mellem fokal adhæsion og cytosol dermed mindre stabilisering af FAK-GFP inden FA. PTRF udtryk derfor formindsket FAK stabilisering i FA’er, tegn på øget udveksling med cytoplasmatisk FAK og reducerede FA demontering [20, 21].

(A) Transwell migration assay viser, at PC3-GFP-PTRF celler migrerer langsommere end vilde -type PC3 og PC3-GFP-celler. (B) Repræsentative konfokale billeder af PC3, PC3-GFP og PC3-GFP-PTRF celler og kvantificering af FA’er per celle i hver af de cellelinier viser, at antallet af FA’er per celle ikke er væsentligt påvirket af PTRF udtryk i cellen. (C) Fluorescence Recovery Efter Fotoblegning (FRAP) assay viser, at FAK-GFP intensitet recovery niveau forøges med PTRF-mCherry co-transfektion sammenlignet med FAK-GFP alene eller FAK-GFP og mCherry co-transfektion. Den FAK-GFP intensitet recovery kurve graf af et repræsentativt eksperiment og et søjlediagram over den FAK-GFP mobile fraktion (beregnet baseret på fluorescens opsving plateau) samlet fra alle eksperimenter er vist. (N≥3; ***: p 0,001; **: p 0,01; *: p 0,05.)

PTRF udtryk påvirker ikke PCAV1 niveauer, men yderligere Gal3 behandling restrores FAK stabilisering i FA og celle motilitet PTRF-udtrykkende PC3 celler

Tyrosin-phosphoryleret CAV1 (pCav1) regulerer migreringen af ​​flere cancer cellelinjer, herunder PC3 [4, 11]. Stabil PTRF ekspression i PC3-celler imidlertid ikke ændrede CAV1 ekspressionsniveauer eller phosphorylering (Fig 2). Som Gal3 har vist sig at fungere sammen med pCav1 at regulere FAK stabilitet i FA’er [4, 31], testede vi, om exogen Gal3 kan genoprette FAK stabilisering i FA’er i PC3-PTRF-GFP-celler. Tilsætning af His-mærket Gal3 (Gal3-His) ved koncentrationer fra 1-4 ug /m påvirkede ikke FAK stabilisering inden FA’er i PC3 celler. Men i PTRF-udtrykkende PC3-celler, tilsætning af 1,5 eller 2 ug /mlGal3-His betydeligt restaureret stabilisering af FAK i FA’er, med 2 ug /ml Gal3-His stabiliserende FAK i FA’er mest signifikant (p 0,001); tilsætning af højere (3 eller 4 ug /ml) eller lavere (1 ug /ml) koncentrationer af Gal3-His undladt at genoprette FA forbundet FAK stabilisering (Fig 3A). Dosis-afhængigheden af ​​Gal-His stabilisering af FAK i FA’er er i overensstemmelse med konceptet for galectin gitter, hvori en kritisk forhold mellem Gal3 at glycan substrater muliggør optimal glycoprotein tværbinding, der fører til receptor dynamik og signaler [32, 33] . En Transwell cellemigrationsassay viste, at den optimale 2 ug /ml Gal3-His forbedret migreringen af ​​alle tre cellelinier (PC3, PC3-GFP og PC3-GFP-PTRF) til største omfang og til samme niveau (Fig 3B) . 1, 1,5 og 3 ug /ml Gal3-His havde ingen effekt på cellemigration af kontrol PC3 og PC3-GFP-celler, men forhøjede PC3-GFP-PTRF cellemigrering til niveauet for ubehandlede PC3 og PC3-GFP-celler (Fig 3B). 4 pg /ml Gal3 ikke signifikant påvirke celle migration af nogen af ​​cellelinierne (figur 3B). Tilsætning af eksogent Gal3 protein genskaber derfor mangelfuld FAK stabiliseringen i FA’er og den reducerede migration af PTRF-udtrykkende PC3-celler på en dosisafhængig måde.

Western blot viser ekspressionsniveauer af GFP, GFP-PTRF, CAV1 og pCav1 i PC3 vildtypeceller (PC3), PC3-celler stabilt transficeret med GFP (PC3-GFP) og PC3-celler stabilt transficeret med GFP-PTRF (PC3-GFP-PTRF). Western blot band intensitet CAV1 og pCav1 kvantificeres og normaliseret til den for β-actin og viser ingen signifikant forskel på CAV1 udtryk eller fosforylering mellem PC3, PC3-GFP og PC3-GFP-PTRF celler. (N≥3; ***: p. 0,001)

(A) FRAP assay af FAK-GFP viser FA-associerede FAK stabilitet i PC3 celler transficeret med FAK-GFP alene eller FAK GFP plus PTRF-mCherry og underkastet Gal3-His behandling i de angivne koncentrationer (1, 1,5, 2, 3 eller 4 ug /ml). Reduceret FAK stabilisering i FA’er PTRF-udtrykkende PC3 celler genoprettes ved Gal3-His på en dosis-afhængig måde. Et søjlediagram over den FAK-GFP mobile fraktion samlet fra alle eksperimenter og en repræsentant FAK-GFP kurve recovery graf fra et eksperiment (viser NT og 2 ug /ml Gal3-His behandling kun) er vist. (B) Kvantificering af PC3, PC3-GFP og PC3-GFP-PTRF cellemigrering ved anvendelse af transwell assay med ingen behandling eller behandling med Gal3-His (1, 1,5, 2, 3 eller 4 ug /ml) viser, at 2 ug /ml Gal3-His behandling forøger cellevandring af alle cellelinier i et lignende omfang. Andre koncentrationer af Gal3 stigning migration af PC3-GFP-PTRF celler i mindre grad, men påvirker ikke migration af PC3 eller PC3-GFP celler. (NT: ikke-behandlet, n≥3 *: p 0,05; **: p 0,01; ***: p 0,001; ns: ikke signifikant.)

Gal3 redning af FA-associeret FAK stabilisering er CAV1-afhængig

for at bestemme om endogen Gal3 stabiliserer FAK i FA’er PC3 celler, vi udtømt Gal3 med siRNA opnå en konsekvent reduktion i Gal3 niveauer 90% efter 48 timer (figur 4A). Efter 24 timer transficerede vi cellerne med FAK-GFP alene eller FAK-GFP sammen med PTRF-mCherry, og behandlede dem eller ej med 2 ug /ml Gal3-His før FRAP analyse af FAK-GFP stabilitet i FA’er. Som vist i fig 4B, knockdown af Gal3 (Gal3 KD) reducerede FAK stabilisering i FA’er, i et lignende omfang som observeret for PTRF-udtrykkende PC3-celler, mens siCTL havde ingen virkning på FAK stabilisering sammenlignet med utransficerede celler. Vigtigere, behandling med Gal3-His reddet FAK stabilisering i FA’er i både PTRF-udtrykke og Gal3 Knockdown celler (Fig 4B).

(A) Western blot viser effektiviteten af ​​Gal3 siRNA knockdown. (B) FRAP assay viser FA-associeret FAK-GFP stabilitet i PC3-celler transficeret med ingen siRNA, scramble kontrol siRNA (siCTL) eller siRNA mod human Gal3 (siGal3) og underkastet 2 pg /ml Gal3-His behandling. De FAK-GFP curve intensitet recovery grafer over én repræsentativt forsøg og et søjlediagram over den FAK-GFP mobile fraktion samlet fra alle eksperimenter er vist. (N = 3; ***: p. 0,001)

Vi derefter slået ned CAV1 i PC3 celler ved siRNA (siCav1) (Fig 5A) før transfektion med enten FAK-GFP alene eller FAK GFP plus PTRF-mCherry og behandling med eksogent Gal3-His (2 ug /ml). siCav1 steg den mobile del af FAK-GFP i FA’er i PC3 men ikke i PTRF-udtrykkende PC3-celler, hvilket viser, at CAV1 selektivt regulerer FA dynamik i PC3-celler, der mangler PTRF (Fig 5B). Gal3-Hans var ude af stand til at fremme FAK stabilisering i FA’er PC3 eller PC3-PTRF celler, hvor CAV1 blev slået ned (Fig 5B). CAV1 er derfor nødvendigt for FAK stabilisering i FA’er af PC3 celler Gal3-afhængig. Samordnet regulering af FA dynamik ved CAV1 og Gal3 derfor påvirket af ekspressionen af ​​PTRF og CAV1 rekruttering til caveolae. Dette antyder, at rekruttering af CAV1 til caveolae kan ændre forholdet mellem ikke-caveolar CAV1 og Gal3 der er afgørende for deres koordinerede regulering af FA dynamik og kræftcelle migration.

(A) Western blot viser effektiviteten af ​​CAV1 siRNA knockdown. (B) FRAP assay af FAK-GFP viser FA-associeret FAK stabilitet PC3-celler transficeret med ingen siRNA, scramble kontrol siRNA (siCTL) eller siRNA mod human CAV1 (siCav1) og underkastet 2 pg /ml Gal3-His behandling . De FAK-GFP curve intensitet recovery grafer over én repræsentativt forsøg og et søjlediagram over den FAK-GFP mobile fraktion samlet fra alle eksperimenter er vist. (N = 3; ***: p 0,001)

Diskussion

cavin familie omfatter PTRF /Cavin-1, SDPR /cavin-2, PRKCDBP /cavin-. 3 og Murc /Cavin-4, som deler en bevaret N-terminale domæne består af heptagentagelser af hydrofobe aminosyrer, eventuelt danner coiled coils, og en følgende region af flere basiske aminosyrer [34]. Ekspression af cavins er associeret med ekspressionen og stabilisering af CAV1 og dannelsen og funktionen af ​​caveolae [34]. De cavins, PTRF /Cavin-1 er afgørende for caveolae dannelse og tab af PTRF resulterer i tab af caveolae og nedregulering af CAV1 proteinniveauer [9, 35]. CAV1 er blevet tilskrevet ikke-caveolar funktioner [36-38] og støkiometrien mellem caveolins og cavins nødvendigvis må påvirke ekspressionen af ​​ikke blot caveolae men også ikke-caveolar CAV1 domæner eller CAV1 stilladser. PC3 celler er en fremragende cellulær model til at studere ikke-caveolar funktioner CAV1 som de mangler PTRF og caveolae men viser forhøjede niveauer af CAV1 [7]. Faktisk ekspression af PTRF i PC3-celler neutraliserer ikke-caveolar CAV1 mikrodomæner og ændrer cellemotilitet, sekretionssignaler veje og angiogenese og lymfangiogenese evner i PC3-celler [12-14, 39, 40]. Konsekvent, viser vi her, at PTRF udtryk i PC3 celler grænser CAV1-Gal3 regulering af FAK stabilisering i FA’er og celle motilitet.

Gal3 og pCav1 funktion i koncert til fremme af FA dynamik og celle motilitet. pCav1 fremmer celle polarisering og migration og regulerer membran lipid ordre på FA’er [4, 22, 26]. Gal3 binding til celleoverflade Mgat5-modificeret N-glycaner danner en galectin gitter, der stimulerer FAK og PI3K-aktivering, og fremmer integrin aktivering og F-actin omsætning [27-30]. Gal3 inducerer integrin α5β1 aktivering og FAK (p397FAK) fosforylering, der er forbundet med FAK stabilisering i FA’er, øget FA signalering og demontering, og dermed celle migration [20, 21, 28]. Endvidere i celler, der mangler den galectin gitter grund af fravær af Mgat5, pCav1 er ikke tilstrækkelige til at fremme FA-associeret FAK stabilisering; ekspression af Mgat5 og galectin gitter forøger cellespredning og inducerer FA’er men kræver pCav1 at stabilisere FAK inden FA’er [4]. Konsekvent, koordineres udtryk for CAV1 og Gal3 observeret i differentierede kræft i skjoldbruskkirtlen-afledte cellelinjer og siRNA Knockdown analyser i de samme cellelinier viser, at både CAV1 og Gal3 er forpligtet til at fremme FAK stabilisering i FA’er og celle migration i forhold til godartet skjoldbruskkirtlen mellem forandret afledte celler [31]. Nyere data viser, at Gal3 er påkrævet for epidermal vækstfaktor (EGF) signalering, der inducerer CAV1 phosphorylering og fremmer cirkulær dorsale flæse (CDR) dannelse, cellevandring og fibronectin fibrillogenese; disse undersøgelser førte til forslaget om en Gal3-integrin-pCav1 signalering modul, der medierer EGF signalering til Rho A [41]. Dette antyder, at uden-i integrin signalering medierer samordnet Gal3-pCav1 regulering af FA dynamik, hvor ekstracellulære Gal3 interagerer med og aktiverer integriner som derefter rekrutterer pCav1 fører til nedstrøms RhoA signalering og celle migration.

Vores data viser, at PTRF udtryk i PC3 celler ændrer ikke CAV1 eller pCav1 niveauer, hvilket tyder på, at PTRF regulerer pCav1 funktion i FA dynamik gennem CAV1 rekruttering til caveolae, reducere tilgængeligheden af ​​funktionel pCav1 i ikke-caveolar stillads domæner. Dannelse af caveolae kan regulere ekspressionen og funktion af ikke-caveolar CAV1 stilladser ved at rekruttere pCav1 til caveolae. CAV1 Y14 phosphorylering er undværlig for caveolae dannelse men pCav1 er blevet lokaliseret til caveolae [42, 43]. Faktisk har det vist sig at præferentiel ekspression af CAV1 i ikke-caveolar CAV1 domæner på grund af en manglende PTRF er forbundet med fremskreden PCa og at ekspression af PTRF /caveolae neutraliserer ikke-caveolar CAV1 domæner at bremse PCa progression [14] . Det faktum, at overskydende Gal3 kan genskabe pCav1-afhængige FA signalering indikerer, at samordnet samspil mellem Gal3 og pCav1 er afgørende for deres evne til at regulere FA signalering og dynamik. Af en række koncentrationer fra 1-4 pg /ml, 2 pg /ml var optimal at redde PTRF-udtrykkende celler, fremhæver koncentrationen afhængighed Gal3 gitter funktion. Tilsvarende Gal3 stimulering af integrin-afhængig fibronectin fibrillogenese er koncentrationsafhængig [28]. Integriner modificeres ved Mgat5 og Gal3 aktiverer α5β1 integrin og rekrutterer den til fibrillære adhæsioner [28, 44]. pCav1 er blevet vist at interagere med integriner og modulerer lipid orden i FA’er [22, 45-47]. Vores data tyder på, at den relative koncentration af Gal3 til ikke-caveolar pCav1 er en kritisk regulator af Gal3-pCav1 signal- og at PTRF er en hidtil ukendt regulator af denne signalering modul. PTRF har vist sig at ændre exosomal sekretion af PC3-celler [13], og om PTRF forstyrrer Gal3-pCav1 modul ved at begrænse Gal3 sekretion, eller ved sekvestrering pCav1 i caveolae og væk fra ikke-caveolar CAV1 scaffolds, eller endda ved direkte at interagere med ikke -caveolar CAV1 stilladser, mangler at blive bestemt (figur 6).

Ekstracellulær Gal3 og ikke-caveolar pCav1 hver stabiliserer FAK inden FA’er afhængige af hinanden. Ekspression af PTRF forstyrrer denne funktion gennem tre mulige måder: 1) ved at rekruttere pCav1 væk fra ikke-caveolar CAV1 stilladser og ind caveolae; 2) ved direkte interaktion med ikke-caveolar pCav1; 3) ved at påvirke Gal3 sekretion og dermed ekstracellulære Gal3 koncentration. Gennem hvilke vej PTRF påvirker Gal3-pCav1 funktionen på FA dynamik stadig at blive undersøgt.

Både CAV1 og Gal3 spiller en vigtig rolle i PCa progression. Gal3 er blevet anerkendt som en vigtig regulator af PCa metastaser [48-50], og adskillige forsøg er blevet udført for at målrette Gal3 i PCa, enten ved hjælp af Gal3-bindende cancer-associeret Thomsen-Friedenreich glycoantigen (TF-Ag) -mimic lactose- L-leucin eller en høj-affinitet Gal3-bingding glycopeptid oprenset fra torsk [51, 52]. CAV1 er blevet vurderet som en prognostisk markør for aggressiv PCa siden 1990’erne [5, 6].

Nyere data tyder på, at PTRF neutraliserer CAV1 handling implicerer en kritisk rolle for ikke-caveolar domæner i PCa [14]. Vores demonstration som Gal3 kan vende den reducerede FAK stabilisering i FA’er og celle motilitet induceret af PTRF identificerer Gal3 og pCav1 som kritiske regulatorer af funktionen af ​​ikke-caveolar domæner i PCa celle migration. Koordinere aktivitet CAV1 og Gal3 kan derfor spille en vigtig rolle i PCa metastase og udgøre en potentiel terapeutisk mål for PSA.

Materialer og Metoder

Antistoffer, plasmider, siRNA en rekombinant human Gal3-His

bovint serumalbumin (BSA), og muse-anti-p-actin-antistoffer blev indkøbt fra Sigma-Aldrich. Kanin-anti-FAK blev erhvervet fra Santa Cruz Biotechnology, Inc., kanin-anti-pY14Cav1 fra Cell Signaling, Inc., og muse-anti-PTRF og kanin-anti-Cav antistoffer fra BD Transduction Laboratories. HRP-konjugeret mus og kanin sekundære antistoffer blev købt hos Jackson ImmunoResearch Laboratories. Phalloidin og sekundære antistoffer konjugeret til Alexa 488, 568, eller 647 blev købt hos Life Technologies, Thermo Fisher Scientific. PTRF-mCherry og mCherry plasmider var generøse gaver fra Dr. Michelle Hill (The University of Queensland Diamantina Institute, University of Queensland, Translational Research Institute, Brisbane, QLD, Australien). FAK-GFP plasmid blev som tidligere [11] beskrevne. Valideret på-TARGET plus SMARTpool små interfererende RNA (siRNA) til human CAV1, styre siRNA (siCONTROL ikke-targeting siRNA nr. 1) og brugerdefinerede siRNA dobbelthuse til Gal3 [53] blev købt fra Dharmacon.

Rekombinant human Gal3 mærket med 6xHis på C-terminal blev genereret ved hjælp af plasmidet, pHis-Parallel2, tidligere [54] beskrevet. Dette plasmid og protokoller var en slags gave fra Ludger Johannes (Institut Curie, Paris, Frankrig). For at skabe Gal3-His, anvendte vi BL21-DE3-bakterier (New England Biolabs). Kort beskrevet overnatskultur blev re-inokuleret (1: 5) i frisk LB suppleret med ampicillin og dyrket ved 37 grader celcius på 225 rpm rysteapparat Til optisk densitet ved 600 nåede 1 og derefter induceret ved hjælp 0,4 mM IPTG i 3 timer ved 30 grader celcius på en 225 rpm shaker. Rekombinant Gal3-His blev oprenset på Talon affinitet matrix (Ciontech) ved hjælp af den medfølgende protokol, overført til 1 x PBS forud for hurtig nedfrysning i flydende N2.

Cell kultur og transfektion

humane cellelinie PC3 var fra American Type Culture Collection (ATCC) og opretholdt i komplet RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). De PC3 cellelinjer stabilt udtrykker GFP eller PTRF-GFP (PC3-GFP og PC3-GFP-PTRF) var generøse gaver fra Dr. Michelle Hill (The University of Queensland Diamantina Institute, Brisbane, Australien) [13]. Alle cellelinjer blev passeret mindst to gange efter helbredelse fra frosne lagre inden initiering eksperimenter og holdt i kultur i højst 8 til 10 passager for at minimere fænotypisk afdrift.

Plasmid-transfektion blev udført 24 timer efter udpladning af cellerne eller siRNA transfektion under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific) ved at følge fabrikantens protokol. Eksperimenter blev udført 24 timer efter plasmidtransfektion. For at knockdown CAV1, celler blev dyrket i komplet medium i 24 timer før transfektion specifikke muse CAV1 siRNA eller kontrol siRNA smartpools (muse siCav1: L-0.058.415-00, siCONTROLS: D-001.210-01; Dharmacon) under anvendelse af Lipofectamine 2000 transfektion reagens (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific) ifølge producentens protokol. For Gal3 knockdown, brugte vi tidligere beskrevet brugerdefinerede siRNA oligonucleotidsekvenser og protokol [53]. Kort fortalt blev cellerne transficeret med den specifikke pulje af fire syntetiseret muse Gal3 siRNA oligonukleotider duplexer eller kontrol intelligent pool siRNA (siCONTROLS) under anvendelse af Lipofectamine 2000. Celler blev dyrket i 48 timer forud for eksperimenteren.

Western blotting

Cellepellets fra 80% konfluente kulturer blev vasket med koldt PBS og resuspenderet i lysepuffer (20 mM Tris-HCI, pH 7,6, 0,5% NP-40, 250 mM NaCl, 3 mM EDTA, 3 mM EGTA indeholder frisk tilsat 2 mM DTT, 0,5 mM PMSF, 1 mM natriumvanadat, 2,5 mM natriumfluorid, og 1 uM leupeptin) i 30 min ved 4 ° C, pelleteret ved 13.000 rpm ved 4 ° C, og supernatanten opsamles og opbevares ved -80 ° C. Lige store mængder proteiner blev separeret på 12% SDS-PAGE, elektroblottet på nitrocellulose (GE Healthcare Life Science), probet med angivne antistoffer og HRP-konjugerede sekundære antistoffer, og afsløret af ECL (Merck Millipore).

Immunofluorescens mærkning Salg

Celler blev fikseret med 3% paraformaldehyd (PFA) i 15 minutter ved stuetemperatur, skyllet med PBS, permeabiliseret med 0,1% Triton X-100 i PBS /CM, blokeret med PBS /CM indeholdende 0,2% bovint serumalbumin (BSA) og derefter inkuberet med primære og fluorescerende sekundære antistoffer i PBS /CM indeholdende 0,2% BSA. Efter mærkning blev dækglassene monteret i CelVol (Celanese, Ltd.), og billeder erhvervet med de 100 × planapochromat mål (NA 1,35) af en FV1000 Olympus konfokalmikroskop.

FRAP målinger

FRAP blev udført på et konfokalt mikroskop (FV1000, Olympus) udstyret med en 60x planapochromat mål (NA 1,35, olie) og SIM scanner. Celler blev udpladet ved lav densitet på FN (10 ug /ml) i 24 timer i en 8-brønds μ-slide kammer (ibidi), transficeret med FAK-GFP eller FAK-GFP plus mCherry eller FAK-GFP plus PTRF-mCherry, og eksperimenter udført 24 timer senere ved 37 ° C. siRNA blev transficeret 48 timer før FRAP eksperimenter. Celler blev behandlet med Gal3-His ved at ændre mediet til serumfrit medium indeholdende angivne koncentration af Gal3-His i 10 minutter, før der skiftes tilbage til bicarbonat-frit RPMI-medium. For hver FRAP analyse blev en prebleach ramme erhvervet efterfulgt af en enkelt blegemiddel hændelse ved hjælp af samtidige og uafhængige stimulering af 405 linje af SIM scanneren. Fluorescens opsving blev fulgt ved 4-s tidsintervaller, indtil intensiteten nåede et plateau. Fluorescens under restitution blev normaliseret til prebleach intensitet. Intensitet nøgletal i den bleget området blev sammenlignet før blegning og efter opsving til at beregne mobile fraktioner ved hjælp af Prism 4 (GraphPad). Grafer er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg, hvor mellem 10 og 25 fokale sammenvoksninger blev bleget.

Migration assay

For migration assay, celler blev trypsiniseret og talt, og 200.000 celler /brønd blev overført til uovertrukne 8 um cellekultur indsatser (BD Falcon) i medium indeholdende 2% serum og samlingen anbringes i 24-brønds plader indeholdende komplet medium. Efter 16 timer blev ikke-migrerede celler fjernes fra toppen af ​​filteret med en vatpind, og migrerede celler på bunden af ​​filteret blev fikseret med 3% PFA, farvet med 5% krystalviolet og mærkede celler tælles. Celletællinger blev normaliseret til PC3 gruppen. Alternativt 200.000 celler /brønd blev overført til indstik i serumfrit medium med eller uden 2 ug /ml Gal3-His og samlingen anbringes i 24-brønds plader indeholdende komplet medium i 14 timer før fiksering og farvning. Celletællinger blev normaliseret til PC3 ikke-behandlede gruppe.