PLoS ONE: Diagnostisk Værdi af Serum miR-182, miR-183, miR-210, og MIR-126 hos patienter med tidlige fase Ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Blod-cirkulerende miRNA kunne være nyttig som en biomarkør til påvisning lungekræft tidligt. Vi undersøgte serumniveauerne af fire forskellige miRNA hos patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og vurderet deres diagnostiske værdi for NSCLC. Serumprøver fra 112 NSCLC-patienter og 104 kontroller (20 nuværende rygere uden lungekræft, 23 lungebetændelse patienter, 21 mavekræft patienter og 40 raske kontroller) blev underkastet Taqman probe-baseret kvantitativ revers transkription-polymerasekædereaktion (RT-PCR) . Dataene viste, at serumniveauerne af MIR-182, MIR-183, og MIR-210 signifikant opreguleret og at MIR-126 niveau signifikant nedreguleret i NSCLC-patienter, sammenlignet med de raske kontroller. Yderligere receiver operating characteristic (ROC) kurve analyse viste, at serum MIR-182, MIR-183, MIR-210, eller MIR-126 niveau kunne tjene som diagnostisk biomarkør for NSCLC tidlig påvisning, med en høj følsomhed og specificitet. Kombinationen af ​​disse fire miRNA med carcinoembryonisk antigen (CEA) yderligere øget den diagnostiske værdi, med et areal under kurven (AUC) af 0,965 (følsomhed, 81,3%, specificitet, 100,0% og nøjagtighed, 90,8%) ved hjælp af logistisk regressionsmodel analyse. Desuden de relative niveauer af serum miR-182, miR-183, miR-210, og miR-126 kunne skelne NSCLC eller tidlige fase NSCLC fra de nuværende tobak rygere uden lungekræft og lungebetændelse eller gastrisk kræftpatienter med en høj følsomhed og specificitet. Data fra den aktuelle undersøgelse valideret, at de fire serum miRNA kunne tjene som en tumor biomarkør for NSCLC tidlig diagnose

Henvisning:. Zhu W, Zhou K, Zha Y, Chen D, han J, Ma H, et al . (2016) diagnostiske værdi af Serum miR-182, mir-183, miR-210, og miR-126 niveauer hos patienter med tidlige fase ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 11 (4): e0153046. doi: 10,1371 /journal.pone.0153046

Redaktør: Song Guo Zheng, Penn State University, USA

Modtaget: 28 oktober, 2015; Accepteret: 21 marts 2016; Udgivet: 19 April, 2016

Copyright: © 2016 Zhu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne forskning blev delvist understøttet af tilskud fra Videnskab og Teknologi Bureau of Zhoushan (# 2011C12039, # 2011C12040) til YKZ og Wyz, Medical Bureau i Zhejiang-provinsen (# 2015ZDA032, # 2016143029) til HBL og Wyz, Sundhedsministeriet-Medicinsk Bureau of Zhejiang-provinsen (# WKJ2014-2-021) til YKZ, og Zhejiang Provincial Program til dyrkning af højt niveau Innovative Health Talenter til XGL. Disse finansieringsorganer havde ikke nogen rolle i undersøgelsen design, dataindsamling, dataanalyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lungekræft er en førende årsag til kræft-relaterede dødsfald i verden, og op til 85% af lungekræft er klassificeret som ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) [1]. Til dato er mere end 75% af NSCLC-patienter diagnosticeret på fremskredne eller metastatiske stadier af sygdommen, hvilket resulterer i en dårlig samlet overlevelse på mindre end 15% [1]. Ikke-resektabel NSCLC fører også til en høj grad af tumor tilbagefald efter kemo-strålebehandling og dermed bidrage til en dårlig [1] overlevelse. I modsætning hertil den femårige overlevelsesraten for patienter med patologisk stadium IA NSCLC øjeblikket når til 83,9% og af scenen IB NSCLC er ca. 66,3% [2]. Således tidlig påvisning er fortsat nøglen til at forbedre overlevelsen af ​​NSCLC-patienter. Til dato, diagnosticering af tidlige fase NSCLC er hovedsageligt afhængig computertomografi, magnetisk resonans, positronemissionstomografi, opspyt cytologi eller histologisk undersøgelse af bronkoskopiske væv [3]. Disse teknikker er dyre eller generelt ikke praktisk for NSCLC tidlig påvisning i en stor gruppe af befolkningen. Således er udviklingen af ​​en ikke-invasiv eller minimalt invasiv blod biomarkør, såsom blod-cirkulerende DNA [4], methylerede gener [5], tumorceller eller microRNA (miRNA), kunne tilvejebringe en ny fremgangsmåde for tidlig klinisk påvisning af NSCLC . Desuden kunne udviklingen af ​​mere stabile, følsomme og specifikke biologiske markører giver en nem at bruge og præcise værktøj at klinikerne diagnose kræft tidligere end det er muligt.

miRNA er en klasse af ikke-kodende små RNA på op til 24 nukleotider i længde, der er meget stabil i blodcirkulationen; Derfor kunne det være nyttigt for NSCLC detektion, hvilket giver en høj følsomhed og specificitet [6, 7]. Faktisk har flere tidligere undersøgelser vist, at niveauerne af cirkulerende miRNA er ændret hos patienter med NSCLC, sammenlignet med dem hos raske personer [8-12]. For eksempel, Mitchell

et al

. [8] i 2008 først rapporteret at serum MIR-141 opreguleres i prostatacancer, antyder, at det kunne skelne prostatacancerpatienter fra raske kontroller. Desuden Markou

et al

. [9] har beskrevet ændrede niveauer af tre cirkulerende miRNA (dvs. miR-21, miR-10a, og miR-30e-5p) i NSCLC patienter og demonstreret deres potentielle anvendelighed til påvisning af NSCLC. Andre undersøgelser analyseret yderligere følsomheden og specificiteten af ​​forskellige miRNA i diagnosticering af tidlige fase NSCLC [6, 10]. For eksempel Tang

et al

. [11] har vist, at kombinationen af ​​MIR-21, MIR-155, og MIR-145 var en egnet biomarkør at skelne NSCLC-patienter fra kontroller, som det gav en følsomhed på 76,5%, en specificitet på 81,3%, og et område under kurven (AUC) på 0,87. En yderligere undersøgelse evaluerede dynamikken i serum miR-21 og miR-24 i præ- og postoperative NSCLC patienter som biomarkører til at forudsige behandling effektivitet [12]. Samlet er anvendelsen af ​​et panel af miRNA øger følsomheden og specificiteten i differentialdiagnosen af ​​tidlige fase NSCLC, da miRNA ekspression er ændret på en række sygdomme, herunder cancer, infektionssygdomme, eller endog raske personer, der ryger tobak. Derfor, i dette studie, vi valideret disse fire miRNA som værende specifikt dysreguleret i sera fra NSCLC patienter [9, 13-15] og udforskede deres værdi i den tidlige og differential diagnose af sygdommen. Denne undersøgelse viser, at brugen af ​​et sæt af miRNA et nyttigt diagnostisk værktøj til tidlig diagnose af NSCLC.

Materialer og Metoder

Patienter

I alt 221 blod prøver, der opfylder udvælgelseskriterierne blev indsamlet fra Zhoushan Hospital, Zhejiang-provinsen, Kina, fra januar 2011 og september 2014. Disse prøver omfattede 112 NSCLC patienter, 20 nuværende rygere uden lungekræft, 23 patienter med lungebetændelse, 21 patienter med mavekræft, og 40 raske kontroller. Lung og gastrisk kræft blev diagnosticeret histologisk og yderligere bekræftet af to patologer, ifølge National Comprehensive Cancer Network kriterier [16, 17]. Patienter med lungebetændelse blev diagnosticeret baseret på de kliniske manifestationer, spyt bakteriekultur og radiologiske fund. Alle patienter havde nogen forhistorie for behandling, herunder kirurgi, kemoterapi, strålebehandling, eller antibiotikabehandling. Patienter og kontrolpersoner var fri for andre samtidige sygdomme, såsom kronisk obstruktiv lungesygdom, diabetes, hypertension, astma, hepatitis, tuberkulose, og neurologiske eller psykiatriske lidelser. Tabel 1 opsummerer de klinisk-patologiske karakteristika forsøgspersonerne. Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske Review Committee of Zhoushan Hospital i Kina. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle deltagerne. Alle deltagere var etniske han-kinesere.

Blodprøver blev indsamlet fra alle deltagere tidligt om morgenen. Sera blev straks separeret efter blodprøvetagningen og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. De laboranter blev blindet for patientens identitet. En kemiluminescens fremgangsmåde blev anvendt til at måle miRNA i seraene. Som en del af den rutinemæssige kliniske vurdering, data vedrørende carcinoembryonisk antigen (CEA) niveauer blev konstateret fra patienternes journaler fra Zhoushan Hospital.

Serum Forberedelse, RNA Isolation, og kvantitativ Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction ( RT-PCR)

for at opnå serumprøver, 10 ml perifert blod blev trukket ind separate gelrør og underkastes derefter inden for 30 min centrifugering ved 1.500

g

i 10 minutter ved 4 ° C . Supernatanterne blev overført til 1,5-ml rør og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. For at detektere miRNA ekspression, blev 600 pL af serumprøven fra hver deltager underkastet RNA-isolering under anvendelse af en Mirvana PARIS RNA-isolering kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), ifølge fabrikantens protokol. RNA-koncentrationen blev bestemt ved anvendelse af et NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (NanoDrop Technologies) og en 15% denatureret polyacrylamidgel. De RNA-prøver blev underkastet en revers transkriptionsreaktion ved anvendelse af en TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) ifølge producentens instruktioner. Efterfølgende blev qPCR udført på serumprøver i tre eksemplarer ved anvendelse TaqMan 2 × Universal PCR Master Mix uden AmpErase UNG (Applied Biosystems) på en ABI 7500 Real-Time PCR-system (Applied Biosystems). qPCR amplifikationsbetingelser blev sat til en initial cyklus på 95 ° C i 10 minutter efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Tærsklen cyklus (Ct) værdier blev beregnet ved hjælp af SDS 2.0.1 software (Applied Biosystems). Uden skabelon kontroller blev anvendt i enten RT eller PCR skridt til at sikre målspecifik amplifikation. De kontrol miRNA var U6 lille nukleare RNA (snRNA), ifølge en tidligere undersøgelse [18]. De gennemsnitlige ekspressionsniveauer af serum miRNA blev beregnet under anvendelse af 2

-ΔCt metode i forhold til gennemsnittet af U6 snRNA [19]. For at bestemme gange ændring af target miRNA forhold til miRNA udtrykt i normale kontroller, udtrykket 2

-ΔΔCt blev anvendt [20]. Middelværdien Ct værdi af de fire miRNA blev beregnet, eksklusive outliers (dvs. replikerer med Ct afviger mere end en cyklus fra medianen). Desuden, hvis middelværdien Ct værdi for U6 var ikke mellem 20 og 32 cykler, assayet blev gentaget mindst en gang om nogle af prøverne. Prøver med lav U6 snRNA niveauer blev ikke medtaget til dataanalyse i denne undersøgelse.

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført med GraphPad Prism 5.0 software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) og MedCalc 9.0 software (MedCalc software Inc., Mariakerke, Belgien). Dataene blev undersøgt i henhold til graden af ​​homogenitet. Den uparrede

t

test eller Mann-Whitney-test blev anvendt til at analysere forskellene mellem fag og kontroller eller sammenhængen mellem miRNA ekspressionsniveauerne og patientorganisationer klinisk-patologiske træk. Receiver Operating karakteristik (ROC) kurver blev genereret for at vurdere den diagnostiske nøjagtighed hver parameter. Den bedste sensitivitet /specificitet parret blev valgt baseret på den maksimale Youden Index. AUC-værdierne blev også beregnet og sammenlignet under anvendelse af en ikke-parametrisk metode [21]. Multipel logistisk regressionsanalyse blev udført for at vurdere den diagnostiske nøjagtighed af kombinationen af ​​serum miRNA i NSCLC-patienter. Alle statistiske tests var to-sidet og en

P Drømmeholdet værdi ≤ 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Differential Expression af Serum miRNA i forskellige sygdomme og raske kontrolpersoner

Baseret på tidligere undersøgelser [9, 13-15, 22], valgte vi og vurderet fire dysregulerede serum miRNA i 216 prøver (dvs. 112 NSCLC patienter, 23 lungebetændelse patienter, 21 gastrisk kræftpatienter, 20 nuværende rygere uden lungecancer og 40 raske kontroller). Vores data viser, at niveauerne af miR-182, miR-183, og miR-210 signifikant opreguleret i sera fra NSCLC patienter, sammenlignet med dem af alders- og køns- matchede raske kontrolpersoner (

P

0,0001, 0,0181, og 0,0299, henholdsvis), mens serum miR-126 niveauer blev reduceret betydeligt i de NSCLC patienter (

P

0,0001;. figur 1)

Grafer viser dot -plots af medianer og inter-kvartil serier af log

2-transformerede værdier for hver miRNA i sera fra 112 NSCLC patienter (

sort og) og 40 raske kontroller (

grå

). U6 snRNA blev anvendt som reference.

P

værdier af miR-182, miR-183, miR-210, og miR-126 var

0,0001, 0,0181, 0,0299, og 0,0001, henholdsvis anvendelse af Mann-Whitney-test. *

P

0.05 mellem patienter og kontrolpersoner.

Cirkulerende Serum miRNA Skelner NSCLC Patienter fra Lungebetændelse Patienter, mavekræft Patienter og Tobak Rygere

Vi fandt, at de relative niveauer af serum miR-183 og mIR-210-ekspression blev forøget i NSCLC-patienter, sammenlignet med de for rygere (

P

0,0001 og 0,0024, henholdsvis). De serumniveauer af miR-182, miR-183, og miR-210 blev også steget i de NSCLC patienter, sammenlignet med dem af lungebetændelse patienter (

P

= 0,0197, 0,0400, og 0,0278, henholdsvis); hvorimod serumniveau af MIR-182 blev reduceret i NSCLC-patienter, sammenlignet med den i de mavecancerpatienter. Desuden blev serum niveau af miR-183 steget i de vs. patienter NSCLC mavekræft (

P

0,0001 og 0,0351, henholdsvis).

I 87 tidlige fase (0 og i) NSCLC-patienter, serumniveauerne af mIR-182, mIR-183, og mIR-210 blev væsentligt forøget, sammenlignet med de for rygere (

P

= 0,0015, 0,0001, og 0,0006, henholdsvis ); serum niveauer af miR-183 og miR-210 blev også forøget, mens miR-126-niveau blev reduceret, sammenlignet med de lungebetændelse patienter (

P

= 0,0293, 0,0142, og 0,0113, henholdsvis). Serumniveauerne af MIR-183 og MIR-210 blev også forøget, og serumniveau af MIR-182 blev reduceret, sammenlignet med dem af de mavecancerpatienter (

P

= 0,0239, 0,0048, og 0,0001 henholdsvis, fig 2). Men der var ingen indlysende forskel i serum niveauer af disse fire miRNA (miR-182, mir-183, mir-210, og MIR-126) mellem den tidlige fase og sene NSCLC patienter (

P

= 0,0724, 0,2874, 0,2991, og 0,4754, henholdsvis).

serumniveauer af miR-182, miR-183, miR-210, og miR-126 blev vurderet i 112 NSCLC patienter, 20 nuværende rygere , 23 lungebetændelse patienter, og 21 gastrisk kræftpatienter bruger QRT-PCR. U6 snRNA blev anvendt som reference. *

P

0.05 mellem grupper ved hjælp af Mann-Whitney test.

tidlig påvisning af de fire Serum miRNA for NSCLC patienter vs. Sund Controls

Dernæst udførte vi ROC kurve analyse for at vurdere diagnostiske værdi af disse fire serum- cirkulerende miRNA og CEA. Først identificerede vi en cut-off værdi, der adskiller 112 NSCLC patienter fra 40 raske køns- og aldersmatchede kontroller. ROC kurve data viste, at alle fire af disse miRNA kunne skelne NSCLC patienter fra kontrollerne. Konkret serum niveau af miR-182 havde en følsomhed på 63,4% og en specificitet på 80,0% at differentiere NSCLC patienter fra de raske kontroller, med et AUC på 0,734 ved den optimale skæringspunkt (

P

0,0001, 95% konfidensinterval [CI]: 0,657-0,803). miR-183 havde en følsomhed på 41,1% og en specificitet på 82,5%, med et AUC på 0,626 (

P

= 0,0091, 95% CI: 0,544-0,703). miR-210 havde en sensitivitet på 33,9% og en specificitet på 100,0%, med et AUC på 0,616 (

P

= 0,0121, 95% CI: 0,534 til 0,694). miR-126 havde en følsomhed på 60,7% og en specificitet på 92,5%, med et AUC på 0,793 (

P

0,0001, 95% CI: 0,719-0,854). CEA havde en følsomhed på 55,4% og en specificitet på 77,5%, med et AUC på 0,711 (

P

0,0001, 95% CI: 0,632-0,782, Fig 3). Klinisk CEA niveau serum rutinemæssigt anvendes til påvisning af kræft. Således har vi sammenlignet AUC for CEA med den for de fire miRNA og fandt, at den diagnostiske værdi af CEA ikke var signifikant forskellige fra dem af MIR-182, MIR-183, MIR-210 og MIR-126 (

P

= 0,7290, 0,2056, 0,1818, og 0,1271, henholdsvis). Men de forudsagte værdier af logistisk regressionsanalyse viste, at den kombinerede ROC analyse af disse fire miRNA plus CEA afslørede en øget AUC værdi på 0,965, med en følsomhed på 81,3%, en specificitet på 100,0%, og en nøjagtighed på 90,8% (

P

0,0001, 95% CI: 0,923-0,988, fig 3 og tabel 2). Den multivariat logistisk regressionsanalyse af ROC-kurven af ​​disse fire miRNA plus CEA er vist i S1 tabel.

P

værdier af serum miR-182, miR-183, miR-210, miR-126, og CEA samt den prædiktive værdi af logistisk regression var

0,0001, 0,0091, 0,0121, 0,0001, 0,0001, og 0,0001, henholdsvis.

Desuden blev ROC kurve analyse anvendes til at vurdere den diagnostiske værdi af disse fire miRNA mellem 87 tidlige fase NSCLC (fase 0 og jeg) patienter og 40 køns- og alder-matchede raske kontrolpersoner. Dataene viste, at serumniveauer af miR-182 havde en AUC på 0,781, med en følsomhed på 67,8% og en specificitet på 85,0% (

P

0,0001, 95% CI: 0,699 til 0,849); miR-183 havde en AUC på 0,638, med en følsomhed på 41,4% og en specificitet på 82,5% (

P

= 0,0065, 95% CI: 0,548-0,721); miR-210 havde en AUC på 0.650, med en følsomhed på 35,6% og en specificitet på 100,0% (

P

= 0,0019, 95% CI: 0,561-0,721); miR-126 havde en AUC på 0,845, med en følsomhed på 62,1% og en specificitet på 97,5% (

P

0,0001, 95% CI: 0,770-0,903); mens CEA havde en AUC på 0,648, med en følsomhed på 63,2% og en specificitet på 62,5% (

P

= 0,0045, 95% CI: 0,558-0,731, Fig 4). AUC miR-126 blev bredere sammenlignet med CEA (

P

= 0,0012). Ikke desto mindre er AUC af miR-182, miR-183, og miR-210 var ikke forskellig fra AUC for CEA (

P

= 0,0589, 0,8855, og 0,9796, henholdsvis). Derudover de forudsagte værdier af logistisk regressionsanalyse viste, at den kombinerede ROC analyse af disse fire miRNA plus CEA viste øget AUC værdi på 0,975, med en følsomhed på 88,5%, en specificitet på 92,5%, og en nøjagtighed på 91,3% (

P

0,0001, 95% CI: 0,930-0,994, fig 4 og tabel 2). Multivariat logistisk regressionsanalyse af ROC-kurven af ​​disse fire miRNA og CEA er vist i S1 tabel.

P

værdier af serum niveau af miR-182, miR-183, miR- 210, miR-126, og CEA samt den prædiktive værdi af logistisk regression var 0,0001, 0,0065, 0,0019, 0,0001, 0,0045, og 0,0001, henholdsvis.

Diagnostisk værdi af disse fire Serum miRNA plus CEA i NSCLC patienter vs Andre Disease Grupper

ROC kurver blev konstrueret til at evaluere den diagnostiske værdi af den relative ekspression (2

-ΔΔCt) af disse fire miRNA plus CEA i diagnosen af ​​NSCLC. Dataene viste, at niveauerne af MIR-182, MIR-183, og MIR-210 var signifikant forskellig mellem NSCLC-patienter og tobak rygere, med AUC for 0,764, 0,781, og 0,714; følsomhed 71,4%, 71,4% og 50,9%; og særlige forhold 90,0%, 80,0%, og 90,0%, henholdsvis (

P

0,0001,

0,0001, og 0,0001; 95% CI: 0,683-0,834, 0,701-0,848 og 0,629-0,789, fig 5), mens niveauerne af miR126 og CEA ikke havde nogen åbenlyse forskel i AUC at skelne NSCLC og tobak rygere (

P

= 0,1322, 0,5053, fig 5). Desuden er kombinationen af ​​disse fire miRNA og CEA havde en AUC på 0,861, med en følsomhed på 83,0% og en specificitet på 80,0% (

P

0,0001, 95% CI: 0,790-0,915; Fig 5 og S2 tabel).

P

værdier af serum miR-182, miR-183, miR-210, miR-126, og CEA samt den prædiktive værdi af logistisk regression var

0,0001, 0,0001, 0,0001, 0,1322, 0,5053, og 0,0001, henholdsvis.

I den tidlige fase NSCLC, viste data, at niveauerne af miR-182, miR-183, og miR-210 var signifikant forskellig mellem NSCLC patienter og tobak rygere, med AUC af 0,728, 0,787, og 0,748; følsomhed 67,8%, 74,7%, og 55,2%; og særlige forhold 90,0%, 80,0%, og 90,0%, henholdsvis (

P

0,0001,

0,0001, og

0,0001; 95% CI : 0,634-0,810, 0,698-0,861, og 0,655-0,827, S1 fig), mens niveauerne af miR-126 og CEA ikke havde nogen åbenlyse forskel i AUC at skelne NSCLC og tobak rygere (

P

= 0,1205, 0,4240, S1 fig). Desuden er kombinationen af ​​disse fire miRNA plus CEA havde en AUC på 0,842, med en følsomhed på 86,2% og en specificitet på 70,0% (

P

0,0001, 95% CI: 0,759 til 0,905; S1 Fig og S2 tabel).

Desuden afslørede ROC kurver, at niveauerne af serum mIR-182, mIR-183, mIR-210 og mIR-126 var i stand til at skelne NSCLC af lungebetændelse, med AUC af 0,655 , 0,636, 0,646, og 0,679; følsomhed 61,6%, 70,5%, 93,8% og 52,7%; og særlige forhold 73,9%, 56,5%, 39,1%, og 87,0%, henholdsvis (

P

= 0,0061, 0,0259, 0,0350, 0,0002, 95% CI: 0,568-0,735, 0,549-0,717, 0,559-0,726, 0,593-0,756, fig 6). Men CEA niveau havde ingen tydelig forskel i AUC at skelne NSCLC og lungebetændelse (

P

= 0,1914, Fig 6). Desuden den diagnostiske værdi af kombinationen af ​​de fire miRNA plus CEA havde en AUC på 0,861, med en følsomhed på 48,2% og en specificitet på 82,6%, at skelne NSCLC af lungebetændelse (

P

= 0,0031, 95 % CI: 0,586-0,750, fig 6 og S3 Table)

P

værdier af serum miR-182, miR-183, miR-210, miR-126, og CEA som. samt den prædiktive værdi af logistisk regression var henholdsvis 0,0061, 0,0259, 0,0350, 0,0002, 0,1914, og 0,0031,.

i den tidlige fase NSCLC, viste data, at niveauerne af miR-182, miR-183, miR-210, miR126a, og CEA produceret AUC for 0,618, 0,648, 0,667, 0,672, og 0,676, med følsomhed 56,3%, 78,2%, 94,3%, 56,3% og 56,3% og særlige forhold 73,9%, 52,2%, 39,1%, 87,0%, og 73,9%, henholdsvis at skelne NSCLC fra lungebetændelse (

P

= 0,0487, 0,0182, 0,0145, 0,0006, og 0,0059; 95% CI: 0,521 til 0,709, 0.552- 0,737, 0,571 til 0,754, 0,576-0,759, og 0,580-0,762, S2 fig). Kombinationen af ​​disse fire miRNA plus CEA produceret en AUC på 0,731, med en følsomhed på 62,1% og en specificitet på 73,9% (

P

0,0001, 95% CI: ,638-,811, S2 Fig og S3 tabel).

Vi analyserede også AUC mellem NSCLC og mavekræft, dvs miR-182, miR-183, og miR-210 viste AUC for 0,848, 0,645, og 0,661, med følsomhed 69,6%, 70,5%, og 56,3%, og særlige forhold 90,5%, 66,7%, og 76,2%, henholdsvis at skelne NSCLC fra mavekræft (

P

0,0001, 0,0241, og 0,0063; 95% CI: 0.775- 0,904, 0,558 til 0,726, og 0,574-0,741 henholdsvis fig 7). Kombinationen af ​​disse fire miRNA plus CEA viste en AUC på 0,972, en følsomhed på 97,3% og en specificitet på 85,7% til at skelne NSCLC fra mavekræft (

P

0,0001; 95% CI: 0.928- 0,993, fig 7 og S4 Table)

P

værdier af serum miR-182, miR-183, miR-210, miR-126, og CEA samt den prædiktive værdi. af logistisk regression var 0,0001, 0,0241, 0,0063, 0,3961, 0,0744, og . 0,0001 henholdsvis

I den tidlige fase NSCLC, ROC kurver viste miR-182, miR-183, miR-210, og CEA med AUC for 0,826, 0,660, 0,699, og 0,706; følsomhed 66,7%, 73,6%, 66,7%, og 83,9%; og særlige forhold 90,5%, 66,7%, 71,4%, og 57,1%, henholdsvis at skelne NSCLC fra mavekræft (

P

0,0001, = 0,0150, 0,0009, og 0,0016; 95% CI: 0.741- 0,892, 0,562 til 0,748, 0,603 til 0,783, og 0,611-0,790 henholdsvis; S3 fig). Kombinationen af ​​disse fire miRNA og CEA viste en AUC på 0,976, en følsomhed på 94,3% og en specificitet på 90,5% til at skelne NSCLC fra mavekræft (

P

0,0001; 95% CI: 0.927- 0,996;. S3 figur og S4 Table)

serum miRNA og NSCLC klinisk patologi

med hensyn til klinisk patologi NSCLC, fandt vi ingen signifikant sammenhæng mellem serumniveauer af de fire miRNA og rygning status, lymfeknude metastaser, histologisk undertype af tumoren, tumorstørrelse, eller patologisk stadie (

P

0,05; data ikke vist).

diskussion

Serum miRNA er nyttige som nye tumor biomarkører for forskellige former for kræft hos mennesker, men der er en betydelig variation i data mellem forskellige undersøgelser af den samme sygdom [23]. Variationen er i vid udstrækning tilskrives forskellige studiepopulationer mangel af standard endogene kontrol for miRNA undersøgt [24], alder, begrænsede stikprøvestørrelser [25], og funktionel diversitet af miRNA [26]. Derfor validering af serum miRNA-niveauer er afgørende for fremtidig anvendelse i sygdomsdiagnose. Desuden har tidligere undersøgelser fokuseret på den diagnostiske værdi af cirkulerende miRNA mellem NSCLC-patienter og raske kontroller [14, 19, 25]. Imidlertid har nogle undersøgelser rapporteret om den diagnostiske værdi af cirkulerende miRNA mellem NSCLC patienter og rygere, lungebetændelse patienter eller andre personer med andre maligniteter. Således i den aktuelle undersøgelse, vi har registreret serumniveauerne af MIR-182, MIR-183, MIR-210 og MIR-126 i NSCLC-patienter i lyset af vore tidligere undersøgelser og offentliggjort litteratur [9, 13, 14, 22] . Vores resultater viste, at disse fire miRNA er potentielle tumor biomarkører for diagnosticering af NSCLC. Konkret fandt vi, at niveauerne af MIR-182, MIR-183, og MIR-210 blev forøget signifikant i sera fra patienter med NSCLC, hvorimod MIR-126-niveauer blev signifikant reduceret i sera fra patienter med NSCLC, sammenlignet med den raske kontroller. ROC-kurven-analyser afslørede, at MIR-182, MIR-183, MIR-210, eller MIR-126 alene var nyttige som en tumor biomarkør til tidlig påvisning af NSCLC, med en høj følsomhed og specificitet. Kombinationen af ​​disse fire miRNA med CEA yderligere øget den diagnostiske værdi, med et AUC på 0,965 (følsomhed på 81,3%, specificitet 100,0%, og nøjagtigheden af ​​90,8%). Endvidere viste data, også, at de relative ekspressionsniveauer af serum MIR-182, MIR-183, MIR-210 og MIR-126 aktiveret differentiering af NSCLC eller tidlig fase NSCLC-patienter fra nuværende rygere samt fra patienter med lungebetændelse eller gastrisk cancer, med en høj følsomhed og specificitet. Afslutningsvis vores nuværende data viser, at de fire serum miRNA kunne tjene som tumor biomarkører for tidlig påvisning af NSCLC.

Så vidt vi ved, vores undersøgelse er den første til at anmelde brugen af ​​kombineret serum miR -182, miR-183, miR-210, og miR-126 niveauer for at differentiere tidlige fase NSCLC fra raske kontrolpersoner, nuværende rygere, og lungebetændelse eller gastrisk kræftpatienter. Faktisk individuelt, har en tidligere undersøgelse vist, at serumniveauerne af MIR-182 og MIR-183 var forhøjet i patienter med NSCLC, sammenlignet med raske kontroller [13]. Både miR-182 og miR-183 tilhører miR-183 familie og fungere som kræftpsykologisk miRNA i human tumorigenese via fremme af tumorcellevækst og migration ved at målrette transkriptionsfaktoren tidlig vækst respons protein 1 [27, 28]. En tidligere metaanalyse har afsløret, at ekspressionen af ​​miR-183 familiemedlemmer opreguleres i mange typer af kræft hos mennesker, hvor NSCLC er klassificeret på tredjepladsen [29]. Vore resultater stemmer overens med tidligere undersøgelser, der påviser, at ekspressionen af ​​MIR-182 og MIR-183 er ikke blot steg i lunge tumorvæv, men også i sera fra NSCLC-patienter [13]. Zheng

et al

. [30] har vist, at plasma miR-182 er steget betydeligt i NSCLC patienter, men det mislykkedes at skelne fase I NSCLC fra kræft-fri kontrol. Desuden Abd-El-Fattah

et al

. [31] har vist, at MIR-182 er forhøjet hos patienter med NSCLC eller lungebetændelse. Men i modsætning til vores resultater indikerer, at serum miR-126 og miR-183 niveauer blev ændret mellem fase 0 og jeg NSCLC, Lin

et al

. [32] har vist signifikante forskelle i serum miR-126 og miR-183 niveauer mellem stadie IV NSCLC patienter og kontrol; mens der i fase I /II NSCLC patienter er miR-126 og miR-183 niveauer var stabil og ensartet. Årsagen til denne uoverensstemmelse er ukendt, men det kan være relateret til de begrænsede stikprøvestørrelser og studiepopulationer. Desuden blev niveauet af MIR-126 nedreguleret i NSCLC sammenlignet med noncancerous lungevæv på grund af det faktum, at MIR-126 deltager i tumorangiogenese ved at målrette ekspressionen af ​​vaskulær endotel vækstfaktor-A [33, 34]. Opreguleres miR-126 hæmmer også tumorcelleadhæsion, migration og invasion, hvilket delvis kan mediere Crk udtryk [35]. I vores undersøgelse, viste vi, at miR-126 blev nedreguleret i sera fra NSCLC patienter, der er i overensstemmelse med en tidligere undersøgelse [15]. Desuden har MIR-210 blevet kaldt “micromanager af hypoxi sti” og er involveret i tumorvækst, apoptose, og angiogenese [36]. Desuden har MIR-210 blevet rapporteret at være øget i lungetumor væv og spyt fra NSCLC-patienter [37, 38]. I den aktuelle undersøgelse påviste vi, opregulering af serum MIR-210 i NSCLC-patienter, der kan virke som en kræftpsykologisk miRNA i NSCLC udvikling.

Selvom analysen af ​​disse fire miRNA er blevet rapporteret tidligere, deres diagnostiske værdi til skelne NSCLC fra andre sygdomme eller tilstande, såsom nuværende tobaksrygning, lungebetændelse eller andre former for kræft, er ikke blevet evalueret til dato. Vores nuværende undersøgelse viste, at niveauerne af miR-182, miR-183, og miR-210 i NSCLC eller tidlige fase NSCLC var signifikant forskellige fra dem i tobak rygere samt patienter med lungebetændelse eller mavekræft, og de viste en høj følsomhed og specificitet. Serumniveau MIR-126 var i stand til at skelne NSCLC fra lungebetændelse, hvorimod serum CEA niveauer havde ingen sådanne evne til at skelne NSCLC fra andre sygdomme. Således disse fire miRNA måtte have, potentialet til at blive yderligere evalueret som biomarkører for tidlig diagnosticering af NSCLC. Desuden er en kombination af disse fire miRNA med CEA markant øgede AUC værdi, med en høj følsomhed og specificitet, hvilket antyder deres potentielle rolle i tidlig diagnosticering af NSCLC. Endvidere har tidligere undersøgelser vist, at disse fire miRNA differentielt udtrykkes i sera fra andre sygdomme individuelt, men der har ikke været nogen enkelt undersøgelse, der rapporterer anvendelsen af ​​deres kombination som biomarkør for en sygdom. Et par eksempler på disse miRNA i litteraturen er følgende: Li

et al

. [39] har vist, at serumniveauer af miR-182, miR-183, og miR-210 var højere hos gravide kvinder med præeklampsi i deres tredje trimester af graviditeten, sammenlignet med kontrolgruppen. Desuden Chen

et al

. (2

-ΔΔCt).

doi:10.1371/journal.pone.0153046.s007

(DOCX)

Acknowledgments

This