PLoS ONE: proteomiske Forespørgsel Androgen Action i Prostata Cancer Cells afslører roller Aminoacyl tRNA Synthetases

Abstrakt

Prostatakræft er den mest almindelige malignitet blandt mænd i USA, og der er ingen løsning i øjeblikket tilgængelig for fremskredent stadium hormonresistent cancer. Dette skyldes til dels den ufuldstændige forståelse af androgen-regulerede proteiner og deres kodede funktioner. Helcelle-proteomer af androgen-sultede og androgen-behandlede LNCaP-celler blev analyseret ved semikvantitativ MudPIT ESI- ion trap MS /MS og kvantitativ iTRAQ MALDI- TOF MS /MS-platforme, med identifikation af mere end 1300 yderst overbevisende proteiner. En berigelse-baserede pathway kortlægning af androgen-regulerede proteom datasæt afslørede en signifikant dysregulering af aminoacyl tRNA-syntetaser, hvilket indikerer en stigning i protein biosynthesis- kendetegnende under prostatakræft progression. Denne observation understøttes ved immunoblot og transcript data fra LNCaP-celler og prostatakræft væv. Således data fra flere proteomics platforme og udskrift af data kombineret med informatik analyse giver en dybere indsigt i de funktionelle konsekvenser af androgen handling i prostatakræft

Henvisning:. Vellaichamy A, Sreekumar A, Strahler JR, Rajendiran T, Yu J, Varambally S, et al. (2009) proteomiske Forespørgsel Androgen Action i Prostata Cancer Cells afslører roller aminoacyl tRNA syntetaser. PLoS ONE 4 (9): e7075. doi: 10,1371 /journal.pone.0007075

Redaktør: Lennart Randau, Yale University, USA

Modtaget: Juli 3, 2009; Accepteret: 29 juli 2009; Udgivet: 18 September, 2009

Copyright: © 2009 Vellaichamy et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret delvist af Michigan Technology Tri-korridor, Michigan Economic Development Corporation tilskud 687 til Michigan Proteomics Alliance for Cancer Research (GSO, AMC, AS, AV), National Institutes of Health giver U54DA021519 for National center for Integrativ Biomedical Informatik (GSO, AMC), R01CA126239 (AN), RO1CA133458 (AS, AMC) U01 CA111275 (AMC), 1K99CA129565-01A1 (JY), og P50 CA69568 (AMC, AS), Department of Defense PC080665 (JY), og den Fond for Discovery fra University of Michigan Comprehensive Cancer center (AS). AMC er understøttet af en Clinical Translational Science Award fra Burroughs Welcome Foundation og er en Investigator af Howard Hughes Medical Institute. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i prostata (PCA) er den mest almindeligt diagnosticeret kræft blandt mænd i USA, med en anslået 200.000 nye tilfælde og 29.000 dødsfald for 2008 [1]. Mange rapporter tyder på, at androgener som er nødvendige for normal udvikling af prostata støtter også væksten og udviklingen af ​​PSA. Androgener udøver deres cellulære virkninger via binding til androgen receptor (AR), et medlem af den nukleare hormonreceptor (NR) superfamilie. AR, til gengæld binder til androgen responselementer (Ares) i promotoren og enhancerregioner af målgener, som en transskriptionel regulator ved at transducere den beslægtede hormon signal i kernen [2], [3]. Prostatacancer terapi gennem androgen ablation oprindeligt opnår regression af tumorer; dog kan en mere aggressiv, hormonresistent form af tumoren (hr-PCA) udvikles, med et efterfølgende dødelighed. Selvom flere grupper har afhørt androgen-regulerede ændringer på transkriptomet og proteomanalyse niveauer ved hjælp af genekspression arrays og massespektrometri henholdsvis [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10 ], er der stadig mangel på stor forståelse på den funktionelle konsekvens af hormonet handlinger under udvikling prostatakræft. Delvis denne mangel er en afspejling af tyndt i proteomik data; på grund af begrænsninger i proteomik teknologier, det samlede antal proteiner identificeret og kvantificeret i en enkelt undersøgelse er beskeden. Herudover er der tekniske udfordringer fra sådanne underrepræsentation af proteiner og vurdere den statistiske signifikans af forskelle i proteinekspression.

For at overvinde disse udfordringer, og for at opnå en dybere indsigt i androgen-regulerede proteom ændringer i prostatakræft, vi anvendte en tostrenget strategi. Først forbedrede vi ånde androgen-regulerede proteom profileret i denne undersøgelse ved at anvende to komplementære massespektrometri (MS) platforme: en, der involverer isotop mærkning af peptider med en iTRAQ reagens efterfulgt af 2D væskekromatografi (LC) MALDI- TOF MS /MS-analyse på et ABI 4800 MALDI tandem tid-søgning (TOF /TOF) instrument [11], og den anden en etiket-fri tilgang baseret på spektral optælling [12], [13], [14], [15] hjælp Multi-dimensional Protein Identification Technology (MudPIT) [16] med elektrospray (ESI) – ion trap MS /MS på en lineær ion trap (LTQ) instrument. For det andet, vi belyst proteomik-ændringer inden for rammerne af funktionelle veje under anvendelse Molecular Concepts Mapping (MCM, også kaldet Oncomine Concepts Mapping (OCM)) [17], til at opnå dybere indsigt i biologi androgen virkning i prostatacancer. Især sådanne kombinatoriske analyser afslørede en slående stigning i niveauet af aminoacyl tRNA-synthetaser (Aars), som kunne ligge til grund for stigningen i proteinbiosyntese forudsagt i prostatakræft med forskellige genekspressionsstudier.

Resultater Salg

vi anvendte en integrativ strategi (figur 1) for at forstå androgen virkning i prostatacancer. Kort fortalt, udførte vi massespektrometri-baseret proteomanalyse profilering af androgen-berøvet og androgen-stimulerede LNCaP-celler. Trypsin-fordøjede proteiner blev identificeret og kvantificeret ved hjælp af to massespektrometrisk platforme: iTRAQ MALDI-TOF MS /MS og MudPIT ESI ion trap MS /MS. Dataene fra hver af disse platforme blev normaliseret uafhængigt og kombineres til at generere en liste over androgen regulerede proteiner. Den androgen reguleret proteom blev forhørt for biologiske foreninger bruger Molekylær Begreber Mapping (MCM). Fra de mange molekylære begreber, herunder androgen-regulerede og prostatakræft begreber, der blev beriget af vores androgen opreguleret datasæt, blev begrebet beskriver forhøjet aminoacyl tRNA syntetaser (aaRSs) udvalgt til yderligere undersøgelse. En undergruppe af disse proteiner er valideret af immunoblotanalyse. Brug transkriptom profilering og kromatin immunpræcipitation, viste vi, at androgen driver ekspressionen af ​​aaRSs på udskrift niveau. Endelig viste vi eksistensen af ​​det forhøjede Aars niche under prostatakræft progression hjælp kliniske prøver.

Androgen-stimulerede LNCaP celler blev profileret ved hjælp af både kvantitativ iTRAQ MALDI- TOF /TOF og semikvantitativ MudPIT ESI- LTQ proteomics platforme. Data fra hver af disse platforme blev normaliseret uafhængigt og kombineres til at generere en liste over androgen-regulerede proteiner. Denne liste blev forhørt for biologiske foreninger bruger Molekylær Begreber Mapping (MCM). Konceptet beskriver aminoacyl tRNA syntetaser blev udvalgt til yderligere undersøgelse; udvalgte proteiner blev valideret ved anvendelse af immunoblot og immunfluorescensfarvning. Transkriptomisk profilering og chromatin immunoprecipitation viste, at androgen driver ekspression af aminoacyl-tRNA-syntaser på udskriften niveau. Dette blev yderligere bekræftet ved hjælp af kræftvæv genekspression data og immunoblotanalyse på prostata vævsprøver, der påviste eksistensen af ​​den forhøjede aminoacyl-tRNA-syntase niche under prostatakræft progression.

Identifikation og relativ kvantificering af LNCaP proteiner ved iTRAQ MALDI-TOF MS /MS

Brug iTRAQ MALDI-TOF MS /MS-platform, vi identificeret 904 proteiner med høj tillid scores som bestemt med SEQUEST [18], PeptideProphet [19] og ProteinProphet [20] beregningsværktøjer. Af disse 879 blev kvantificeret dataene efter normalisering (figur 2A), med det overordnede proteinidentifikation FDR på mindre end 1% (se materialer og metoder for detaljer).

A) Venn diagram, der viser antallet af samlede og sub-sæt af androgen-regulerede proteiner identificeret fra iTRAQ MALDI TOF- MS /MS-analyse. En minimumsgrænse på 1,25 SD fra den globale gennemsnitstemperatur i både androgen-behandlede prøver og ikke mindre end 1,5 SD i en af ​​androgen behandlede prøver blev indstillet. B) Venn diagram, der viser antallet af samlede og androgen-regulerede LNCaP proteiner identificeret i MudPIT (ESI ion trap MS /MS) analyse. Proteiner, der er vist i parentes blev ikke anset for differentieret analyse på grund af deres lavere spektrale tæller. C) Venn diagram, der viser det samlede antal proteiner identificeret fra to massespektrometrisk platforme og deres overlapning. D) Venn diagram, der viser det totale antal af androgen opreguleret proteiner identificeret fra to massespektrometrisk platforme og deres overlapning. E. Venn diagram, der viser det samlede antal androgen nedreguleret proteiner identificeret fra to massespektrometrisk platforme og deres overlap.

Proceduremæssigt blev androgen proteomanalyse vurderet af iTRAQ hjælp af to uafhængige biologiske gentagelser. En dobbelt duplex iTRAQ forsøg blev udført, hvori androgen-behandlede prøver i hvert replikat blev mærket med de 115 og 117 isobare tags mens deres tilsvarende kontrolprøver blev mærket under anvendelse af 114 og 116 isobare tags. For at udlede en tærskel for at definere proteinekspressionsplasmider ændringer, normaliseret vi den relative protein-forholdet for hver af de androgen-behandlede prøver og en af ​​knapperne (mærket med isobarisk tag 116) til proteinekspression i kontrolprøven mærket med 114 isobarisk tag. Fordelingen af ​​alle protein-forhold for androgen-behandlede prøve (tag 115) i forhold til kontrol (tag 116) er vist i supplerende Figur S1A. Mere end 80% af proteinerne havde forhold inden for intervallet 0,8-1,2. Medianen-centreret normalisering i en gennemsnitlig tæt på enhed for alle prøver, og standardafvigelsen af ​​kontrollen replikat (tag 116, SD = 0,16) blev anvendt som en skala at sætte tærsklen ratio for differentielt udtrykte proteiner. Derfor ændringer med en minimumsgrænse på 1,25 SD (forhold på 1,2 for opreguleret og 0,83 for ned-reguleret) blev betragtet som signifikant (se materialer og metoder for detaljer). Listerne over alle 70 androgen opreguleret og 39 ned-regulerede proteiner identificeret fra denne analyse er givet i supplerende tabel S1 og supplerende tabel S2 henholdsvis.

Semi-kvantitativ sammenligning af proteiner ved hjælp MudPIT analyse

Brug MudPIT ESI- ion trap MS /MS proteomisk profilering tilgang 857 proteiner blev identificeret med et minimum protein sandsynlighed score på 0,9 (anslået FDR på mindre end 1%); 67% (574) af dem blev identificeret fælles mellem kontrol og androgen-behandlede prøver, mens 126 proteiner og 157 proteiner blev kun identificeret i kontrol og androgen-behandlede prøver, henholdsvis (figur 2B). Ud over at bestemme tilstedeværelsen eller fraværet af proteiner, udførte vi en statistisk analyse for at sammenligne de relative spektrale tællinger for proteiner i hver behandling. Det samlede antal spektre fra enten kontrol eller androgen-behandlede data var uafhængigt normaliseret, og de normaliserede kumulative spektrale optællinger af alle peptiderne for hvert protein blev anvendt som et mål for protein overflod. Baseret på den statistiske analyse af data blev proteiner betegnet som differentielt udtrykt, hvis de kun blev identificeret i enten kontrollen (nedreguleres) eller androgen behandlede prøve (opreguleret) med fire eller flere peptider. For proteiner identificeret i begge prøver, blev normaliserede spektrale tæller forhold på to standardafvigelser over eller under middelværdien af ​​alle proteiner i denne gruppe (som svarer til en fire-gange ændring) anvendt som cut-off (se materialer og metoder, se supplerende Figur S1B til distribution af de normaliserede spektrale tæller nøgletal for proteiner identificeret i kontrol og androgen-behandlede prøver). Baseret på disse kriterier, blev 65 og 57 proteiner, der er udpeget som androgen opreguleret og nedreguleret henholdsvis (supplerende tabel S3, upplementary Tabel S4).

Kombineret liste over differentielt udtrykte proteiner identificeret fra de to MS-platforme

med den forståelse, at listen af ​​peptider profileret ved massespektrometri påvirkes af ionisering kilden og masseanalysatoren [21] (i dette tilfælde MALDI- TOF vs. ESI-ion trap), kombineret vi proteinet lister afledt af de to MS platforme til at udlede en sammensat liste. Dette blev lettet af, at de to platforme identificeret tilsvarende antal høje tillid proteiner (857 og 879 proteiner fra MudPIT og iTRAQ henholdsvis med sammenlignelig FDR på mindre end 1%). Som et første skridt i processen, blev ikke-redundante proteiner aflivet fra hvert forsøg ved at konvertere deres IPI deponeringsnumre til gen-id’er. Tre proteiner (lektin, mannose-bindende 2, LMAN2, ClpX, caseinolytisk peptidase X homolog, og 40S ribosomale protein S9, RPS9) blev der viste disharmoniske tendenser i deres udtryk mellem de to platforme fjernet. Disse procedurer gav i alt 844 og 875 proteiner, henholdsvis for MudPIT og iTRAQ datasæt (figur 2B, 2A). Sammen iagttoges 1306 proteiner i den kombinerede datasæt (figur 1 og figur 2C). Af disse blev 126 unikke proteiner forhøjet på androgen behandling. Især 9 af disse androgen-up regulerede proteiner overlappede mellem de to proteom platforme (figur 2D): KLK3, ACSL3, FASN, FKBP5, Aars (alanyl-tRNA syntetase), FDFT1 (farnesyl-difosfat farnesyltransferase 1), UAP1 (UDP N-acteylglucosamine pyrophosphorylase 1), ENDOD1 (endonuclease domæne indeholdende 1), og NDRG1. Den kombinerede nedreguleret listen 95 proteiner og én (HNRPL, heterogen nukleare ribonucleoprotein L isoform a) var almindeligt mellem iTRAQ og MudPIT platforme (Figur 2E).

Vores liste med op-regulerede proteiner inkluderet fem proteiner der er blevet vist tidligere at være forhøjet ved androgen handling: ACSL3 (iTRAQ forholdet 2,76), FKBP51 (iTRAQ forholdet 1,91; MudPIT spektral tæller 17:00), FASN (iTRAQ forholdet 1,85; MudPIT spektral tæller 417:45), NDRG1 (iTRAQ forholdet 1,76; MudPIT spektral tæller 5:00), og KLK3 (også kendt som PSA, prostataspecifikt antigen [22], iTRAQ-forhold 1,44; MudPIT forholdet 11:00). En direkte kvantitativ sammenligning af proteiner identificeret på både MS-platforme viste en høj positiv korrelation (R2 = 0,92) i tre proteiner (ACSL3, FASN, og Aars, se supplerende figur S1). Disse resultater uafhængigt valideret vores normaliseringsproceduren og de tærskelværdier, der blev brugt til at bygge den kombinerede liste over androgen-regulerede proteiner. Endvidere blev immunoblotanalyse bekræftes ved androgen-regulering af en delmængde af opreguleret proteiner (figur 3A). Især ud over at validere vores massespektrometri resultater, den immunoblotanalyse viste betydelig kompression i folden ændring af proteinekspression afgrænset af iTRAQ eksperiment (figur 3A). En tilsvarende ortogonal kontrol udføres for androgenet opreguleret protein fedtsyresyntase ved immunofluorescence- mikroskopi er vist i figur 3B.

A) Ekspression gange ændring af androgen-regulerede proteiner i massespektrometrisk kvantificering sammenlignet med immunoblot vurdering . Vist er de immunoblot bands og deres intensiteter for androgen up-regulerede proteiner og deres beregnede nøgletal intensitet samt iTRAQ nøgletal og MudPIT spektrale tæller for de tilsvarende proteiner. Beta-tubulin anvendes som en prøve loading kontrol. B) Immunofluorescens-farvning af AR (rød) og FASN (Grøn) efterfølgende køretøj (ethanol) og 1 nM R1881 behandlinger for 48 h på LNCaP-celler. Behandlingen blev givet efter 48 h af androgen deprivation.

Analyse af androgen opreguleret biologiske processer og veje ved MCM analyse

For at få indblik i den funktionelle konsekvens af androgen-handling, En storstilet association analyse blev udført sammenligne vores androgen opreguleret protein datasæt af 126 proteiner med hver af de 13364 begreber i MCM [23]. Involveret i udvælgelsen af ​​væsentlige molekylære koncepter procedure er beskrevet i ‘Materialer og metoder’ sektionen. Berigelsen netværk resulterede i MCM analyse med den kombinerede sæt af androgen opreguleret proteiner er præsenteret i figur 4. Det er vigtigt, viste analysen berigelse af kendte prostatacancer-specifikke og androgen-regulerede koncepter, hvilket således tilvejebringer en validering af proteomik data genereret i dette arbejde (figur 4, rødlige kanter). Indlejret i disse tidligere kendte prostata-specifikke koncepter var en, der beskrev en række co-beriget gener nedreguleret i prostatacancerpatienter efter post-neoadjuverende (antiandrogen) terapi [17]. Yderligere begreber af betydning omfattede dem, for aminoacyl-tRNA biosyntese og ER til Golgi transport (begge GO biologisk proces), aminoacyl-transfer-RNA syntetase Klasse II (InterPro), og RSRFC4 (MEF2A) og NKX3A (begge Transfac). Vi blev fascineret af disse begreber, der er nævnt aminoacyl tRNA syntetaser (Kegg vej: https://www.genome.jp/kegg/[24], [23]), da de potentielt afspejler en stigning i aminosyre udnyttelse og dermed en øges i nedstrøms proteinbiosyntese upon androgen behandling (figur 4, blåfarvede kanter). Denne observation er i overensstemmelse med vores tidligere genekspression-baserede forudsigelse af øget protein biosyntese som et af kendetegnene ved prostatakræft udvikling [17]. Forhøjede Aars aktivitet var også blandt de væsentlige begreber beriget med matchede transkriptom data for androgen behandlet LNCaP-celler (data ikke vist). Således disse observationer førte os til at vælge aminoacyl tRNA syntetase koncept for yderligere analyser.

Netværk visning af molekylære begreber eller sæt af biologisk beslægtede gener beriget med androgen up-reguleret protein sæt opnået gennem Molekylær Begreber Mapping (MCM) analyse. Hvert knudepunkt repræsenterer et biologisk koncept; node størrelse er proportional med antallet af gener i hvert koncept. Hver kant repræsenterer en statistisk signifikant berigelse. P-værdi af hver koncept og MCM antal konceptet er angivet i parentes. Den mest beriget koncept er angivet med en tyk kant. Red farvede kanter indikerer berigelse af kendte prostatakræft-specifikke og androgen-regulerede koncepter. Sammenkoblede aminoacyl tRNA syntetase begreber er angivet i blå kanter i bunden af ​​nettet.

Androgen regulering af aminoacyl tRNA syntetaser

Der var 7 proteiner i Aars kategori, der oversteg det sæt tærskel i den kombinerede liste over proteiner defineret ved hjælp af både MS-platforme: Aars til alanin (Aars), phenylalanin (FARSLA), glycin (GARS), histidin (Hars), asparagin (NARS), threonin (TARS) og tryptophan (WARS). Af disse kun AARS og Hars blev udpeget af MudPIT platform (tabel S3), mens AARS og resten blev udpeget af iTRAQ undersøgelsen (tabel S1). Selv det samlede antal for Aars identificeret i iTRAQ og MudPIT eksperimenter var 14 og 13, henholdsvis flere af disse proteiner blev identificeret med mindre end fire peptider i MudPIT eksperiment gør det mindre pålidelige for deres spektrale optælling baseret kvantificering. Dette tyder også på den lave rige natur af denne kritiske klasse af proteiner. Derfor har vi fokuseret på yderligere at analysere iTRAQ identificeret aaRSs og undersøgt, om der er kompression i udtryk forholdet trods deres forhøjede udtryk. Af de 14 aaRSs identificeret i iTRAQ undersøgelsen, seks havde iTRAQ nøgletal 1.2 og derover, og tre af dem havde nøgletal 1.1 og ovenfor i både androgen-behandlet (115 og 117), der udtages. Over-ekspression af flertal disse (ni af 14) aaRSs er afbildet i en varme kort (figur 5A). En undergruppe af disse iTRAQ identificerede aaRSs (GARS, KARS, og WARS) valideret ved anvendelse androgen-behandlede LNCaP celler ved immunoblotanalyse (figur 5C). Endvidere undersøgte vi deres transkriptniveauer brug af afpassede genekspression data for androgen-behandlede LNCaP-celler (se materialer og fremgangsmåder). Ni af de fjorten proteiner identificeret ved vores proteinprofilering blev forhøjet ved transkriptet plan på tværs af uafhængige genekspression eksperimenter (figur 5B). Dette afslørede potentiel regulering af disse proteiner ved transkriptionel aktivering med androgen. Disse data understøtter også observation af kompression i fold ændring af protein-ekspression i iTRAQ nøgletal.

A) Heat kort, der viser forhøjede udtryk for aminoacyl-tRNA syntetaser identificeret fra iTRAQ eksperiment. Kun proteiner i fed er udpeget som androgen opreguleret i iTRAQ data baseret på tærsklen cut-off anvendes. B) Heat kort, der viser den samstemmende overekspression af udskrifter målt med oligonukleotid microarray (Affymetrix U133 Plus 2.0) for aminoacyl-tRNA syntetaser vist i A. C) Immunoblotanalyse af aminoacyl t-RNA syntetaser GARS, Kars og krige som reaktion på androgen behandling i LNCaP-celler. Beta-tubulin anvendes som lastning kontrol. D) Immunoblotanalyse af KARS og GARS i lokaliseret prostatacancer (PSA), og metastatisk prostatacancer (Met) sammenlignet med normale (benigne) prostatavæv. Beta-actin anvendes som lastning kontrol. E) Promotor-belægning af AR på aminoacyl tRNA gener. Kromatin immunofældning (chip) -PCR analyse viser androgen-afhængige berigelse af AR-binding til målet initiativtagere til

GARS

og

KARS

. Berigelse blev beregnet på grundlag af mængden af ​​mål-amplifikation mod indført DNA, med primere for

GAPDH

promotor anvendt som kontrol. Primersekvenserne spænder over genpromotorer er angivet i tabel S5. F) Meta-analyse af aminoacyl t-RNA syntetase gener (af proteiner, der er vist i A) på tværs tre prostatakræft genekspression profilering undersøgelser. Oncomine varme kort visende overekspression af en delmængde af aminoacyl-tRNA-syntetase gener i lokaliseret prostatacancer sammenlignet med deres godartede kontroller. Gene symboler af proteiner, der passerer gennem afskæringsværdien og blev tildelt som androgen opreguleret i iTRAQ data er angivet med fed skrift. P-værdi repræsenterer betydningen af ​​ekspression i to af de tre studier. Rød, hvid og blå (ikke til stede i figuren) angiver relativ overstået, uændret, og under udtryk, henholdsvis.

Androgener mægle deres positive effekt på transskription ved binding til androgen receptor, hvilket igen binder til androgen responselementer på promotorerne for målgener [25]. Således har vi fortsatte med at undersøge androgen binding til initiativtagerne til aminoacyl tRNA syntetaser hjælp kromatin immunofældning (chip, se materialer og metoder). Figur 5E viser repræsentativt eksempel på øget belægningsprocent på AR på promotoren for

GARS

og

KARS

bekræfter androgen regulering af dens udtryk på udskrift niveau.

Vi næste udvidet vores cellelinje observation til prostatakræft vævsprøver. Først brugte vi ONCOMINE database (www.oncomine.org) til at udføre en meta-analyse for aminoacyl tRNA syntetase udskrifter på tværs af flere studier prostatakræft [26]. En undergruppe af aaRSs viste sig at være opreguleret i lokaliseret prostatacancer prøver i mere end én undersøgelse (figur 5F). Denne observation blev bekræftet ved anvendelse immunoblotanalyse af prostata-afledte prøver, der omfattede godartet tilstødende, lokaliseret prostatacancer, og metastatisk sygdom. Vigtigere, fire af de fem lokaliseret PCa og fire af de fem metastatiske PCa viste forhøjede ekspression af KARS og GARS sammenlignet med tre af de fire testede godartede prøver (figur 5D). Disse låne tiltro til en mulig rolle af androgen-regulerede aminoacyl tRNA syntetaser aktion under prostatakræft progression.

Diskussion

For at afgrænse de biologiske processer og veje, der er dysreguleret af androgen i prostatakræft, vi vedtaget en strategi for global MS-baserede proteomisk profilering koblet til berigelse-baserede pathway kortlægning i androgen-responsiv prostatacancer LNCaP. Vi profileret proteomet af LNCaP-celler med og uden androgen behandling under anvendelse af to proteom platforme: kvantitativ iTRAQ MALDI-TOF MS og semikvantitativ MudPIT Ion Trap MS. Hver af de platforme selvstændigt identificeret over 850 høje tillid proteiner, hvilket giver i alt 1306. Gevinsten i kumulative protein tæller er i overensstemmelse med tidligere rapporter, der beskriver den fordel spørgekriterierne globale proteomer hjælp komplementære massespektrometri platforme [21], [27] . Vi var i stand til at identificere 126 proteiner, der blev opreguleret ved androgen behandling. Inkluderet var kendte mål for androgen handling: KLK3, FKBP5, FASN, AGR2 (forreste gradient homolog 2), Sord (sorbitol dehydrogenase), NDRG1, ACSL3 og FOLH1 (folat hydrolase 1). Derudover indlejret i kompendier af differentielt regulerede proteiner, var hidtil ukendte mål for androgen virkning, der inkluderede PCID1 (PCI domæne indeholdende 1), RAB10 (ras-relaterede GTP-bindende protein RAB10), og PEA15 (phosphoprotein beriget i astrocytter 15).

En yderligere fordel ved at bruge ion fælde-baserede profilering strategi i tandem med TOF-TOF baseret kvantitativ profilering var, at data fra det tidligere hjulpet opveje tab af opløsning som følge af iTRAQ forholdet kompression set i sidstnævnte. Dette tillades brug af lavere tærskelværdi fra iTRAQ-baserede kvantificering for forstyrrelse analyse. Forholdet kompression er blevet bredt rapporteret af andre, f.eks [28], og er godt illustreret ved direkte sammenligning af iTRAQ nøgletal for androgen-regulerede proteiner med den tilsvarende udtryk som vurderet ved immunoblotanalyse (figur 3). Som et eksempel blev proteinet FASN identificeret med 17 peptider; blandt dem den mest differentielt udtrykte peptid havde en iTRAQ forhold på 2,79. Især gennemsnit alle iTRAQ nøgletal for 17 peptider resulterede i en yderligere komprimeret protein iTRAQ-forhold på 1,85, mens densitometri-baseret analyse af dets ekspression ved immunoblot afslørede gange ændring af otte og immunofluorescens-analyse viste også en meget forhøjet ekspression. Denne konklusion understøttes af den spektrale tælling af MudPIT data, hvor FASN blev repræsenteret af 417 spektre i androgen-behandlede prøve sammenlignet med kun 45 spektre i kontrolprøven. Sådanne forhold kompression, selv set i andre undersøgelser, var mere fremtrædende i vores iTRAQ MALDI- TOF /TOF data i forhold til andre kvantitative MS platforme såsom ICAT [9]. Denne forskel kan forklares ved en bredere masse tolerance vindue til valg af peptid ioner for MS /MS fragmentering i ABI 4800 TOF /TOF masse analysator bruges her [29]. Vi mener, at denne kompression i forhold til dels kan forklare den dårlige overlapning mellem sættene af androgen-regulerede proteiner udpeget fra hver af de to MS platforme. Derudover faktorer som forskelle i peptid behandling (mærket versus umærket), peptid fraktionering (online og offline), MS datafangst (ion trap versus TOF /TOF masse analysator), data normalisering (forhold mellem spektrale tæller versus forhold mellem iTRAQ peak etiket intensiteter), og egenskaberne af peptider udvalgt til MS /MS-sekventering kunne spille afgørende roller i manglen på global post. Disse faktorer, ud over de biologiske variationer såsom de mange splejsede former for en enkelt tiltrædelse kunne også have bidraget til de tre proteiner, der viste disharmoniske tendenser mellem de to platforme observerede.

Faktisk er det blevet fastslået, at forskellige proteom platforme viser væsentlige forskelle i de fysisk-kemiske egenskaber af de identificerede peptider [30]. Således strategien med anvendelse af to forskellige massespektrometre, som afviger både i deres ionisering kilde og princippet om peptid detektion, tilladt os at opbygge et tilsætningsstof liste over proteiner og få dybere indsigt i androgen-regulerede proteomanalyse. Med højere berigelse niveau analyser, viste vores undersøgelse, at delmængder af proteiner, der udpeges af hver af de to platforme, kort til lignende koncepter, herunder dem, der er androgen-afledte og prostatacancer-afledt. Med en stringent tærskel indstilling for den spektrale optælling baseret semi-kvantificering havde MudPIT eksperiment nomineret kun to aaRSs kandidater som androgen reguleret. Men på grund af udnævnelsen af ​​højere antal aaRSs fra iTRAQ eksperiment, molekylær koncept netværk med kombineret datasæt viste et sæt af indbyrdes forbundne Aars koncepter med betydelige scoringer (figur 4). Endnu mere spændende var dog, at hver af de to uafhængige lister over proteiner, når analyseret separat bruger MCM analyse, beriget for begreber, der var kendt for at være forbundet med prostatakræft progression, men blev ikke identificeret i analysen af ​​den kombinerede datasæt (figur 4, Supplerende Figur S2). Et eksempel på dette var berigelse af ETS (ETV1 og ERG) overekspression koncepter af androgen-regulerede proteiner udpeget af MudPIT analyse. Dette var interessant i forbindelse med tidligere rapporter, der beskriver eksistensen af ​​tilbagevendende genfusioner involverer ETS transkriptionsfaktorer at være pathonomonic til prostatakræft udvikling [31], [32]. Disse genfusioner er blevet vist at bringe ETS transkriptionsfaktorer under androgen kontrol, og ETV1 (kromosom 7p21) er kendt for at være overudtrykt ved androgen gennem sin omlejring til 14q13.3-14q21.1 region af kromosom 14 i LNCaP-cellelinje undersøgt her [31]. Da antallet af ETS regulerede proteiner identificeret i MudPIT var tilstrækkelig til at kortlægge de ETS overekspression koncept, manglende tilsvarende andel af denne klasse af proteiner i iTRAQ platform muligvis resulteret i forsvinden af ​​samme begreb i den kombinerede analyse. Således brug af flere massespektrometriske platforme er med til at belyse flere roller af androgen handling.

Ud over tidligere kendte androgen-regulerede biologiske processer, der er forbundet med prostatakræft progression, såsom NDRG1 [33], der var med til at validere vores proteomisk undersøgelse, vores liste over androgen-regulerede proteiner blev beriget for aminoacyl tRNA-synthetaser. Adskillige aaRSs, der vides at spille en central rolle i proteinbiosyntese blev inkluderet i dette koncept. Dette fund var interessant i forbindelse med tidligere genekspression-baserede forudsigelser fra vores laboratorium: en stigning i proteinsyntese under prostatakræft progression drevet af handlinger ETS transkriptionsfaktorer [17]. Disse observationer føre os til validering af dette fund på flere niveauer;