PLoS ONE: Metformin Årsager G1-fase Arrest via nedregulering af MIR-221 og Forbedrer TRAIL følsomhed gennem DR5 Up-forordning i kræft i bugspytkirtlen Cells

Abstrakt

Selv om mange kemoterapeutiske strategier mod kræft er blevet udviklet, bugspytkirtelkræft er en af ​​de mest aggressive og vanskelige typer af maligniteter. Derfor nye strategier og anticancer-midler er nødvendige for at behandle denne sygdom. Metformin er en meget anvendt lægemiddel til type 2-diabetes, og er også kendt som en lovende kandidat anti-cancer middel fra de seneste undersøgelser

in vitro

in vivo

. Imidlertid har de mekanismer af metformin anti-cancer effekt ikke blevet belyst. Vi viste, at metformin undertrykt ekspression af MIR-221, en af ​​de mest kendte onkogene microRNA’er, i humane pancreas cancer PANC-1-celler. Desuden viste vi, at nedregulering af MIR-221 ved metformin forårsaget G1-fasen via opregulering af p27, en af ​​de direkte mål for MIR-221. Tumornekrosefaktor-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL) er også et lovende middel til kræftbehandling. Mens de seneste undersøgelser viste, at behandling med kun TRAIL ikke var effektiv mod bugspytkirtelkræftceller, viste de nuværende data, metformin sensibiliserede p53-muterede bugspytkirtelkræftceller til Trail. Metformin inducerede udtrykkene for dødsreceptor 5 (DR5), en receptor for TRAIL, og Bim med en pro-apoptotiske funktion i nedstrøms for TRAIL-DR5-vejen. Vi foreslår, at opregulering af disse proteiner kan bidrage til sensibilisering af TRAIL-induceret apoptose. Kombinationsbehandlingen af ​​metformin og TRAIL kunne derfor være effektive i behandlingen af ​​pancreascancer

Henvisning:. Tanaka R, Tomosugi M, Horinaka M, Sowa Y, Sakai T (2015) Metformin Årsager G1-fasen via nedregulering af MIR-221 og Forbedrer TRAIL følsomhed gennem DR5 Up-forordning i bugspytkirtelkræftceller. PLoS ONE 10 (5): e0125779. doi: 10,1371 /journal.pone.0125779

Akademisk Redaktør: En R M Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, UNITED STATES

Modtaget: 8. december 2014 Accepteret: 25 marts 2015; Udgivet: 8. maj 2015

Copyright: © 2015 Tanaka et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af JSP’er KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/index.html) Tilskud Number 24689031. de finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er en ildfast kræft og den fjerde hyppigste årsag til kræft dødsfald i USA [1]. Den eneste helbredende behandling for denne ondartet tumor er kirurgi og den femårige relative overlevelse af patienter med pancreascancer var 2-6% i USA fra 1975 til 2009. Gemcitabin blev etableret som første-line kemoterapi i 1990’erne [2] . FOLFIRINOX (oxaliplatin, irinotecan, leucovorin, og fluoruracil) eller kombinationsterapi med gemcitabin og erlotinib, en selektiv inhibitor af EGFR-tyrosinkinaseinhibitoren, delvist forbedret samlet overlevelse, men ikke nok [2-4]. Derfor er der behov for mere effektive lægemidler eller kombinationsterapier til pancreascancer.

Metformin har været meget anvendt som et lægemiddel til type 2-diabetes i lang tid [5]. Dag, er metformin anses det første valg til oral behandling for type 2 diabetes, fordi der ikke er væsentlige kontraindikationer og omkostningerne af lægemidlet er lav [6]. I mellemtiden har nylige rapporter vist, at metformin er nyttig i forebyggelse og behandling af kræft [7]. Adskillige kliniske undersøgelser af metformin hos patienter med kræft er i gang [8, 9]. Metformin reducerer glucose produktion i leveren, aktiverer leveren kinase B1 (LKB1) /AMP-kinase (AMPK) akse og hæmmer mammalian target of rapamycin komplekse 1 (mTORC1). Det hæmmer også insulin vækstfaktor-1 (IGF-1) [10-13]. Desuden metformin regulerer flere microRNA udtryk [14], og retter sig mod cancer stamceller [12, 15]. En behandling med metformin hæmmede væksten af ​​cancerceller ved at inducere G1-fasen via opregulering af p27 [16]. Imidlertid er de præcise mekanismer, hvormed metformin opregulerer p27 fortsat uklare.

Tumornekrosefaktor-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL /Apo2L) inducerer apoptose ikke i normale celler, men selektivt i maligne tumorceller [17 -19]. Rekombinant human TRAIL og agonistiske antistoffer for TRAIL-receptorer er attraktive anticancermidler og flere TRAIL-baserede kliniske forsøg er undervejs [20]. TRAIL inducerer apoptose i forskellige cancerceller via dødsreceptor 5 (DR5; også kaldet TRAIL-R2), en af ​​de fem TRAIL-receptorer [21-23]. Der er imidlertid et stort problem, at nogle bugspytkirtelkræftceller er ufølsomme over for TRAIL-medieret apoptose [24, 25]. For nylig er der blevet rapporteret specifikke microRNA at være relateret til modstanden af ​​TRAIL i cancerceller [26]. MikroRNA’er er en klasse af små ikke-kodende RNA, der regulerer målgenet udtryk ved translationel undertrykkelse og mRNA spaltning. MikroRNA’er er blevet påvist at spille en vigtig rolle i processen med carcinogenese [27]. MicroRNAers rolle er blevet undersøgt i mange typer af tumorer, herunder pancreascancer. Blandt dem MIR-221 involveret i tumorudvikling ved at regulere celleproliferation og det bidrager til TRAIL resistens [28-31]. Ekspressionen af ​​MIR-221 er forøget i humane bugspytkirtelkræftceller [32]. Interessant nok viste en nylig undersøgelse, at MIR-221 var forhøjet i de interne mammary arterier i patienter med type 2-diabetes, og der var en signifikant omvendt korrelation mellem oral dosis metformin og niveauet af MIR-221 [33].

en nylig undersøgelse viste, at metformin opreguleres DR5 og forbedret TRAIL følsomhed i p53 vild type cancerceller [34], hvilket indikerer, at det er en lovende kandidat til overvindelse TRAIL resistens i cancerceller. Men mere end halvdelen af ​​maligne tumorer besidder inaktivere mutationer i p53-genet [35, 36], og derfor er vi nødt til at undersøge, om metformin øger følsomheden over for TRAIL i p53-mutant kræftceller.

I nærværende undersøgelse fandt vi, at metformin reducerede miR-221 udtryk hvorved G1-fasen anholdelse gennem opregulering af p27, et direkte mål for miR-221. Desuden viste vi, at metformin forbedrede TRAIL følsomhed via opregulering af DR5 i p53-mutant bugspytkirtelkræftceller.

Materialer og metoder

Reagenser

Metformin blev købt fra Sigma (St. Louis, MO, USA). Opløseligt rekombinant human TRAIL /Apo2L blev indkøbt fra PeproTech (London, UK). Den humane rekombinante DR5 (TRAIL-R2) /Fc-kimære og pan-caspaseinhibitor, zVAD-FMK, blev købt fra R . Dharmacon, Lafayette, CO , USA) under anvendelse af lipofectamin RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Efter 24 timers transfektion blev celler behandlet med eller uden 40 mM metformin. Cellerne blev høstet 24 timer efter behandling for FACS-analyse og Western blotting.

Statistisk analyse

Data er middelværdier ± standardafvigelse af tre bestemmelser. Dataene blev analyseret ved hjælp af Students

t-

test og forskelle blev betragtet som signifikante ved P. 0,05

Resultater

Metformin undertrykker cellevækst af bugspytkirtelkræftceller

for at undersøge effekten af ​​metformin på humane bugspytkirtelkræftceller, vi undersøgt, om metformin undertrykte cellevækst ved hjælp trypanblåt udelukkelse assay. PANC-1, MIA PaCa-2, og AsPC-1-celler blev behandlet med angivne koncentrationer af metformin i 72 timer, og levedygtige celler blev talt ved trypanblåt-eksklusion assay. Som vist i figur 1, metformin faldt væksten af ​​disse cancerceller i en dosisafhængig måde. Salg

(A) Panc-1, (B) MIA Paca-2, og (C) aspC-1 celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af metformin. Efter inkubation i 72 timer blev cellerne talt ved trypanblåt-eksklusion assay. Dataene er middelværdier ± SD af 3 bestemmelser. * P 0,05, ** P. 0,01

Metformin inducerer G1-fasen anholdelse i bugspytkirtelkræftceller gennem nedregulering af miR-221

Vi næste udførte analyse cellecyklus ved anvendelse af flowcytometri efter behandling med de angivne koncentrationer af metformin i 48 timer i humane pancreas cancerceller. Som vist i figur 2A, og S1, S2 og S4 figurerne, metformin forårsaget G1-fasen på en dosis-afhængig måde. Endvidere undersøgte vi virkningen af ​​metformin på ekspressionen af ​​G1-fasen-relaterede proteiner. Som et resultat, metformin ved 40 mM øgede ekspression af p27-protein (Fig 2B). Lee

et al

. tidligere identificeret en række microRNA med øgede udtryk, herunder miR-21, -221, -301, -376a, -155, samt andre i humane bugspytkirtelkræftceller [32]. Desuden blev p27 proteinet nedreguleres af MIR-221 i humane bugspytkirtelkræftceller [37]. Derfor undersøgte vi effekten af ​​metformin på ekspressionen af ​​miR-221. Som vist i fig 2C, metformin reducerede ekspressionen af ​​MIR-221 på en dosis-afhængig måde.

(A) PANC-1-celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af metformin i 48 timer. Procentdelen af ​​celler i hver fase af cellecyklussen blev bestemt ved flowcytometri. (B), (C) Panc-1-celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af metformin i 48 timer. (B) Western blotting for p27. β-actin er en loading kontrol. (C) Real-time RT-PCR kvantificering af MIR-221-ekspression. Den interne kontrol var RNU48. Værdier er gange ændring i ekspressionen af ​​MIR-221 /RNU48 sammenlignet med ubehandlet kontrol. (D), (E) PANC-1-celler blev transficeret med 5 nM MIR-221 mimic eller 5 nM negativ kontrol. Efter 24 timer blev cellerne inkuberet med eller uden 40 mM metformin i 48 timer. (D) Procentdelen af ​​celler i hver fase af cellecyklussen blev bestemt ved flowcytometri. (E) Western blotting for p27. β-actin er en loading kontrol. Pil, et uspecifikt bånd. Dataene er middelværdier ± SD af 3 bestemmelser. ** P. 0,01

For at undersøge, om ændringen i ekspressionen af ​​miR-221 er forbundet med p27 induktion og G1-fasen anholdelse af metformin behandling, vi transficerede Panc-1-celler med en miR -221 efterligne før metformin behandling og udførte flowcytometri og Western blot-analyse. Transfektion af MIR-221 mimic reduceret cellepopulationen i G1-fasen og ekspressionen af ​​p27-protein induceret af metformin, selvom G1-fasen befolkning i metformin-ubehandlede celler også blev reduceret (figur 2D og 2E, S3 Fig). Kollektivt antyder disse resultater, at G1-fasen induceres af metformin ved 40 mM kan skyldes induktion af p27 delvist gennem nedregulering af MIR-221.

Metformin øger TRAIL-induceret apoptose i TRAIL -resistente bugspytkirtelkræftceller

for nylig blev det rapporteret, at opregulering af dødsreceptor 5 (DR5) ved metformin forbedret TRAIL-induceret apoptose af p53 vildtype maligne tumorceller [34]. Derfor undersøgte vi effekten af ​​metformin på TRAIL sensibilisering i p53-mutant og TRAIL-resistente bugspytkirtelkræftceller. Tre cellelinier, Panc-1, aspC-1, og MIA Paca-2, blev testet for deres følsomhed over for TRAIL og /eller metformin. Ved første, behandlede vi cellerne med exogent rekombinant humant TRAIL i de angivne koncentrationer i 72 timer, og levedygtige celler blev talt ved et WST-8 assay. Vækst af cellelinier blev ikke mærkbart hæmmet med TRAIL (figur 3A, S4A Fig). Derefter undersøgte vi virkningen af ​​TRAIL eller metformin på apoptose induktion ved måling af sub-G1 population. Metformin eller TRAIL alene lidt induceret apoptose i disse tre bugspytkirtelkræft cellelinier (Fig 3B og 3C s4b og S4C Fig). Men den kombinerede behandling med metformin og TRAIL markant øgede apoptose i alle testede cellelinier (figur 3D, s4b og S4C Figs).

(A) PANC-1 celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af TRAIL. Efter inkubation i 72 timer blev levedygtige celler vurderes ved anvendelse af en Cell Counting Kit-8. (B), (C) PANC-1-celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af TRAIL (B) eller metformin (C) i 48 timer. Sub-G1 populationer blev analyseret ved flowcytometri. (D) Kombinerede effekter af 40 mM metformin og /eller 10 ng /mL TRAIL i 48 timer. Sub-G1 populationer blev analyseret ved flowcytometri. Dataene er middelværdier ± SD af 3 bestemmelser. * P 0,05, ** P. 0,01

Metformin up-regulerer ekspressionen af ​​DR5 i bugspytkirtelkræftceller

For at undersøge de mekanismer, hvormed metformin forbedrer TRAIL-induceret apoptose undersøgte vi apoptose-relaterede proteiner, der var reguleret af metformin anvendelse af Western blot-analyse. PANC-1-celler blev behandlet med metformin i 48 timer, og vi undersøgte udtrykket for TRAIL-receptorer, DR4 og DR5 og flere proteiner, som sensibilisere cancerceller for TRAIL. Som vist i fig 4A, metformin signifikant opreguleret ekspression af DR4, DR5 og Bim proteiner. Vi derefter undersøgt celleoverflade udtryk for DR4 og DR5 i PANC-1-celler ved flowcytometri. Metformin øgede ekspression af celleoverflade DR5 (Fig 4B og 4C). Desuden undersøgte vi DR5 mRNA-niveauet ved kvantitativ real-time RT-PCR efter behandling med metformin i de angivne koncentrationer i 48 timer. Som vist i fig 4D, metformin steg betydeligt DR5 mRNA-ekspression.

(A) PANC-1-celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af metformin i 48 timer. Western blotting for DR4, DR5 og Bim blev udført. β-actin er en loading kontrol. Pil, uspecifik band. (B), (C) Celleoverfladeproteiner udtryk for DR4 og DR5 i Panc-1-celler behandlet med eller uden 40 mM metformin i 48 timer. Celler blev farvet med isotypekontrol IgG og monoklonale antistoffer mod DR4 og DR5. Data blev analyseret ved flowcytometri. (B) Gray histogram, ingen behandling; hvid histogram, metformin behandling. (C) The Y-aksen repræsenterer de geometriske middelværdier for cellepopulationerne i histogrammerne. Grå bar, ingen behandling; hvide bar, metformin behandling. (D) Kvantitativ real-time RT-PCR af DR5-mRNA i Panc-1-celler behandlet med de angivne koncentrationer af metformin i 48 timer. Den interne kontrol var β2MG. Værdier er gange ændring i ekspressionen af ​​DR5 mRNA /β2MG mRNA sammenlignet med ubehandlet kontrol. Dataene er middelværdier ± SD af 3 bestemmelser. ** P. 0,01

Styrkelsen af ​​TRAIL-induceret apoptose ved metformin afhænger caspaser og DR5, men ikke miR-221

For at analysere inddragelse af caspaser og DR5 på TRAIL-induceret apoptose forøges ved metformin i PANC-1-celler, undersøgte vi virkningen af ​​pan-caspase inhibitor zVAD-fmk eller DR5 /Fc-kimære protein med dominant negativ funktion mod DR5. Den apoptose induceret af kombinationen af ​​metformin og TRAIL blev markant reduceret ved tilsætning af DR5 /Fc-kimære eller zVAD-fmk (Fig 5A). Disse resultater indikerer, at TRAIL-induceret apoptose forøges ved metformin blev udløst i det mindste delvis i et caspase-afhængig måde og samspillet mellem TRAIL og DR5. Dernæst testede vi, om nedregulering af MIR-221 ved metformin bidraget til TRAIL-induceret apoptose. Vi transficerede PANC-1 celler med en miR-221 efterligne før samtidig behandling med metformin og TRAIL. Som vist i fig 5B, kunne transfektion af MIR-221 ikke reducere apoptose population ved co-behandling. Disse resultater indikerer, at miR-221 er ikke ansvarlig for forbedring af TRAIL-induceret apoptose ved metformin.

(A) Panc-1 celler blev behandlet med 40 mM metformin og /eller 10 ng /mL TRAIL for 48 timer med eller uden 1 ng /mL DR5 /Fc-kimære, eller 20 uM zVAD-fmk pan-caspaseinhibitor. Sub-G1 populationer blev analyseret ved flowcytometri. (B) PANC-1-celler blev transficeret med 5 nM MIR-221 mimic eller 5 nM negativ kontrol. Efter 24 timer blev cellerne inkuberet med eller uden 40 mM metformin og /eller 10 ng /mL TRAIL i 48 timer. Sub-G1 populationer blev analyseret ved flowcytometri. Dataene er middelværdier ± SD af 3 bestemmelser. ** P. 0,01

Diskussion

Metformin, den “klassiske” lægemiddel til type 2-diabetes, har for nylig tiltrukket sig opmærksomhed som et antitumormiddel [5-7]. Derudover vores data viser nye funktioner i metformin mod bugspytkirtelkræftceller.

Det er blevet rapporteret, at metformin fremkaldt G1-fasen anholdelse med induktion af p27 udtryk som en af ​​de mekanismer i humane cancerceller [16]. Ligeledes i vores resultater, metformin fremkaldt G1-fasen anholdelse (Fig 2A), og opreguleret p27 protein-ekspression (figur 2B) i humane bugspytkirtel kræft PANC-1 celler. Det blev rapporteret, at nedregulering af miR-221 hæmmede væksten af ​​bugspytkirtelkræftceller gennem opregulering af PTEN, p27, p57, og PUMA [38]. Blandt disse mål-molekyler af miR-221, p27 er en CDK-inhibitor, som inducerer G1-fasen anholdelse i cancerceller [39]. Derfor vi hypotese, at metformin kunne nedregulere miR-221-ekspression, hvilket resulterer i induktion af P27 med G1-fasen anholdelse i bugspytkirtelkræftceller. I denne undersøgelse fandt vi, at metformin nedreguleret ekspression af MIR-221 i bugspytkirtelkræftceller (fig 2C). Desuden blev både G1-fasen anholdelse og induktion af P27 med metformin undertrykt af en miR-221 efterligne i bugspytkirtelkræftceller (Fig 2D og 2E). Ud fra resultaterne, viser vi for første gang, at metformin-induceret G1-fasen i det mindste delvist forårsaget af p27 induktion gennem nedregulering af MIR-221. Imens metformin faldt udtryk for cyclin D1 og CDK4 proteiner ved 10 mM eller mere (S5 Fig), i overensstemmelse med tidligere rapporter [16, 40]. Derfor kan den nedregulering af cyklin D1 og CDK4 protein udtryk bidrager til G1-fasen anholdelse af metformin ved lavere doser. Det blev rapporteret, at MIR-221, en af ​​de mest kendte OncomiRs blev opreguleret i flere maligniteter herunder pancreascancer [32]. Derfor er miR-221 anses for at være et attraktivt mål for selektiv behandling mod kræft [27-29]. Interessant nok viste det tidligere undersøgelse, at MIR-221 var forhøjet i de interne mammary arterier i patienter med type 2-diabetes, og der var en signifikant omvendt korrelation mellem oral dosis metformin og niveauet af MIR-221 [33], øge muligheden at vores resultater kan være fysiologisk.

på den anden side, rapporterede tidligere undersøgelser, at mIR-221 også bidraget til TRAIL resistens i humane cancerceller [28-31]. Vi hypotese derfor, at metformin kan være i stand til at forbedre følsomheden af ​​TRAIL via nedregulering af miR-221 i bugspytkirtelkræftceller. For at bekræfte denne hypotese, vi først undersøgt effekten af ​​metformin på TRAIL følsomhed i humane bugspytkirtelkræftceller. I humane bugspytkirtel kræft PANC-1 celler (Fig 3D), AsPC-1 celler (s4b Fig) og MIA PaCa-2 celler (S4C Fig), metformin forbedrede følsomhed TRAIL. Vi næste undersøgt, om miR-221 var involveret i forbedring af TRAIL følsomhed af metformin. I den foreliggende undersøgelse, har MIR-221 mimic ikke undertrykke apoptose induceret af kombinationen af ​​metformin og TRAIL humane pancreas cancer PANC-1-celler (Fig 5B). Som den mulige årsag til forskellen fra tidligere undersøgelser [28-31], vi spekulere, at den anti-apoptotiske vej fra MIR-221 ikke kan eksistere i humane bugspytkirtelkræftceller testet. Det foreslås derfor, at nedregulering af miR-221 ved metformin er involveret i G1-fasen anholdelse, men ikke apoptose nævnt ovenfor.

Vi analyserede derefter de molekylære mekanismer, der øger TRAIL-følsomhed, og fandt, at metformin inducerede udtryk for DR5, en af ​​tRAIL-receptorer (figur 4, S6 fig), og ekspressionen af ​​Bim (fig 4A). Der er ingen rapporter om, at metformin opreguleret ekspression af Bim-protein i humane cancerceller. Bim har en pro-apoptotisk funktion i nedstrøms for TRAIL-DR5-vejen. Opreguleringen af ​​Bim blev også rapporteret at være ansvarlig for forøgelse af TRAIL følsomhed [41]. Vores data tyder derfor, at DR5 og Bim opregulering af metformin kan bidrage til sensibilisering af TRAIL-induceret apoptose.

Truong

et al

., Viste, at metformin opreguleret DR5 via en p53 -afhængig reaktionsvej [34]. I modsætning hertil har vores nuværende data klart vist, at metformin opreguleres DR5 i p53-mutant pancreascancer PANC-1 (figur 4), AsPC-1 og MIA PaCa-2-celler (S6 Fig), hvilket viser, at metformin opregulerer DR5 udtryk i en p53-uafhængig måde. Desuden blev apoptose induceret af kombinationen af ​​metformin og TRAIL markant reduceret af DR5 /Fc-kimær (Fig 5A), hvilket indikerer, at den forøgede TRAIL følsomhed forårsaget af metformin var i det mindste delvist DR5 afhængige. Interessant, Ozawa

et al

. viste, at ekspressionsniveauerne af DR5-protein i bugspytkirtelkræft prøver var 5,1 gange højere (P 0,01). end den normale pancreasvæv [24]

Det er blevet rapporteret, at metformin har forskellige funktioner [6, 7 , 10-16]. For nylig, kliniske undersøgelser af kombinationer med metformin og forskellige anticancer-midler er i gang fra synspunktet af lægemiddel repositionering [8, 9]. I den tidligere undersøgelse, Gritti

et al

. viste, at 40 mM metformin ikke påvirkede levedygtigheden af ​​humane navlestrengen-afledte mesenkymale stamceller, og beskrevet, at metformin specifikt fremkalder antitumorale virkninger uden at forstyrre normal celle levedygtighed [42]. Vi demonstrerer her, at kombinationen af ​​metformin og TRAIL er meget effektiv mod humane bugspytkirtelkræftceller, øge muligheden for en kombination strategi i behandlingen af ​​kræft i bugspytkirtlen.

Støtte Information

S1 Fig. Metformin inducerer G1-fasen i PANC-1-celler.

(A), (B) De repræsentative histogrammer af fig 2A. (A) ingen behandling. (B) 40 mM metformin

doi:. 10,1371 /journal.pone.0125779.s001

(TIF)

S2 Fig. Metformin inducerer G1-fasen i MIA PaCa-2-celler.

MIA PaCa-2-celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af metformin i 24 timer. Procentdelen af ​​celler i hver fase af cellecyklussen blev bestemt ved flowcytometri. Dataene er middelværdier ± SD af 3 bestemmelser. * P 0,05, ** P 0,01

doi: 10,1371 /journal.pone.0125779.s002

(TIF)

S3 Fig.. Metformin inducerer G1-fasen anholdelse i PANC-1 celler gennem nedregulering af miR-221.

De repræsentative histogrammer for fig 2D. (A) Mock. (B) 40 mM metformin. (C) efterligner negativ kontrol. (D) efterligner negativ kontrol og 40 mM metformin. (E) miR-221 mimic. (F) miR-221 mimik og 40 mM metformin

doi:. 10,1371 /journal.pone.0125779.s003

(TIF)

S4 Fig. Metformin sensibiliserer ASPC-1 og MIA PaCa-2 bugspytkirtelkræftceller til TRAIL.

(A) AsPC-1 celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af TRAIL. Efter inkubation i 72 timer blev levedygtige celler vurderes ved anvendelse af en Cell Counting Kit-8. (B) AsPC-1-celler blev behandlet med den 10 ng /mL TRAIL og /eller 40 mM metformin i 48 timer. (C) MIA PaCa-2-celler blev behandlet med den 4 ng /mL TRAIL og /eller 40 mM metformin i 24 timer. Sub-G1 populationer blev analyseret ved flowcytometri. Dataene er middelværdier ± SD af 3 bestemmelser. * P 0,05, ** P 0,01

doi: 10,1371 /journal.pone.0125779.s004

(TIF)

S5 Fig.. Metformin nedregulerer udtrykkene for cyclin D1 og CDK4.

PANC-1-celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af metformin i 48 timer. Western blotting for cyclin D1 og CDK4 blev udført. β-actin er en belastning kontrol

doi:. 10,1371 /journal.pone.0125779.s005

(TIF)

S6 Fig. Metformin opregulerer DR5 proteiner i p53 mutante bugspytkirtelkræftceller. Salg (A) AsPC-1-celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af metformin i 48 timer. (B) MIA PaCa-2-celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af metformin i 24 timer. Western blotting for DR5 blev udført. β-actin er en belastning kontrol

doi:. 10,1371 /journal.pone.0125779.s006

(TIF)