PLoS ONE: omvendt forhold mellem PSA og IL-8 i prostatakræft: Et indblik i en NF-KB-medieret Mechanism

Abstrakt

Baggrund

Prostata specifikt antigen (PSA) er traditionelt brugt som en indikator for tilstedeværelsen af ​​prostatacancer (PSA) og strålebehandling er generelt bruges til behandling af inoperabel og lokalt fremskreden PCa. Men hvor cellulær PSA-niveau er forbundet med følsomhed PCa til radioterapi er ukendt. Den tidligere konstatering af, at RelB-baserede NF-KB alternative forløb forskelligt regulerer PSA og interleukin-8 (IL-8) i aggressiv PCa har instrueret vores opmærksomhed på den rolle RelB i svaret fra PCa til strålebehandling.

Metode /vigtigste resultater

RelB og dens mål PSA og IL-8 i PCA celler blev manipuleret af ektopisk udtryk i PCA celler med et lavt endogen niveau RelB (LNCaP) og af RNAi-baserede knock-down i PCA celler med et højt konstituerende niveau RelB (PC3). Virkningerne af RelB, PSA og IL-8 på respons PCa til strålebehandling blev undersøgt

In vitro

og i xenotransplantattumorer. RelB regulerer PSA og IL-8 i en omvendt måde. Når de cellulære niveauer af PSA og IL-8 var direkte moduleret ved genetiske manipulationer eller ved tilsætning af rekombinante proteiner, viser resultaterne, at opregulering af IL-8 forstærket radioresistance af PCA-celler og samtidig nedreguleres PSA. I modsætning hertil opregulering af PSA resulterede i reduceret radioresistance med sideløbende nedregulering af IL-8.

Konklusion /Betydning

RelB spiller en afgørende rolle i svaret fra PCa til strålebehandling og den inverse ekspression af IL-8 og PSA. Resultaterne identificerer ikke tidligere indregnet forhold mellem IL-8 og PSA i svaret fra PCA celler til strålebehandling

Henvisning:. Xu Y, Fang F, St. Clair DK, St. Clair WH (2012) omvendt forhold mellem PSA og IL-8 i prostatakræft: et indblik i et NF-KB-medieret mekanisme. PLoS ONE 7 (3): e32905. doi: 10,1371 /journal.pone.0032905

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA

Modtaget: Juni 6, 2011; Accepteret: 7 feb 2012; Udgivet: Marts 5, 2012 |

Copyright: © 2012 Xu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health giver CA 49.797 til DKS og CA 11580 til WHS. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den anden mest almindelige malignitet i Nordamerika og den anden førende årsag til kræftdødsfald i amerikanske mænd [1]. Serumkoncentrationen af ​​PSA hos mænd anvendes som en indikator for sygdom i prostata og øget PSA-niveau er udbredt som en biomarkør for PSA. Strålebehandling er generelt bruges til at behandle tidlige fase, inoperabel og lokalt fremskreden PCa. Men om cellulær PSA kunne anvendes som indikatorer for tumormodtagelighed til radioterapi er ukendt.

NF-KB, en inflammatorisk responsiv transskriptionsfaktor, spiller en vigtig rolle i tumorigenese og resistens over for behandling cytotoksicitet [2] . Den høje konstitutive niveau af NF-KB i cancere er blevet impliceret som en vigtig beskyttende mekanisme mod kræft behandling [3]. Inhibering af NF-KB overvejes som et mål for forbedring af effektiviteten af ​​konventionel kemoterapi og strålebehandling [4]. Vi har tidligere vist, at overekspression af RelB, et NF-KB-medlem, undertrykt PSA ekspression i androgen-responsive LNCaP PCA-celler, hvilket tyder på en negativ virkning af NF-KB på PSA-ekspression [5]. Serendipitously, vi har også konstateret, at i dyr, der bærer RelB-overeksprimeres LNCaP-tumorer, det cirkulerende niveau af IL-8 blev forøget.

IL-8, en NF-KB-aktiverede cytokin, menes at være en vigtig faktor i tumormetastase og modstand mod behandling [6] – [9]. Den cirkulerende niveau af IL-8 forøges i avanceret PCa i den fase, når tumoren ikke længere reagerer på anti-androgen terapier [10]. Endvidere ekspression af IL-8 forøger PCa androgen-uafhængig metastase [11], [12]. Således kan ekspressionen af ​​IL-8 har betydelig prognostisk værdi for PCa vækst og respons på behandling. Nærværende studie undersøgte roller PSA og IL-8 i radioresistance af PCA celler ved hjælp

in vitro

og

in vivo

tilgange. Resultaterne afslører tidligere indregnede rolle af IL-8 og PSA som determinanter for følsomheden af ​​PCa til strålebehandling.

Resultater

NF-KB opregulerer IL-8, men nedregulerer PSA i PCa celler

Aktivering af NF-KB-vejen menes at være en væsentlig faktor, der bidrager til udviklingen af ​​den radioresistance af kræftceller. Fordi RelA og RelB er de to store medlemmer af NF-KB-familien findes i PCA celler [13], bestemte vi effekten af ​​RelA og RelB på IL-8 og PSA udtryk og radiosensitivitet bruger flere metoder til aktivering og inaktivering af NF -κB pathway. Først blev RelA eller RelB overudtrykt i LNCaP-celler ved transfektion med sine respektive cDNA-konstruktioner. Som vist i fig. 1A, blev niveauerne af PSA faldt med både RelA og RelB når de blev overudtrykt i LNCaP-celler. I modsætning hertil var niveauerne af IL-8 forøget med både RelA og RelB. Den tilsvarende effekt af RelA og RelB om radioresistance af LNCaP celler var større med overekspression af RelB.

For at manipulere NF-KB-funktion, RelA og RelB cDNA konstruktioner (A), RelA og RelB siRNA’er (B), og rela og RelB cellekernetranslokering inhibitorer (IκBαM og p100M) (C) blev transficeret ind LNCaP celler før IR behandling. Niveauerne af transfekterede proteiner og den tilhørende mål PSA blev kvantificeret ved Western blots (øverste panel). De vestlige billeder blev normaliseret ved β-actin og derefter normaliseret ved en vehikelkontrol. Fold ændringer er angivet. IL-8-koncentrationer i mediet blev kvantificeret ved et ELISA-kit (midterste panel). Cell overlevelse blev kvantificeret under anvendelse af trypanblå eksklusion assay (nederste panel). * (P 0,05) og ** (p 0,01) angiver statistiske betydninger sammenlignet med kontrollen køretøjet

For det andet blev det endogene RelA og RelB i LNCaP-celler bankede-ned ved hjælp af RNA. interferens (RNAi) tilgang. RelA siRNA eller RelB siRNA transficeredes i LNCaP celler til tavshed deres udtryk. Som vist i fig. 1B, niveauet af PSA omvendt forhold til de reducerede niveauer af både RelA og RelB, med en større effekt observeret for RelB. Niveauerne af IL-8 blev tilsvarende nedsat i RelA og RelB bankede ned i cellerne, med en større effekt for RelA siRNA. Radiosensitivitet af LNCaP-celler blev forøget ved at reducere enten RelA eller RelB (fig. 1B). Overlevelsen celle i kontrol siRNA blev reduceret til 46,3% efter strålebehandling, hvorimod celleoverlevelse blev yderligere reduceret til 30,1% eller 23,4%, når RelA eller RelB blev slået ned. Statistisk analyse viste signifikante forskelle i RelA siRNA og RelB siRNA sammenlignet med kontrolceller siRNA. Således knock-down af RelB næsten fordoblet celledræbende effekt af stråling. Men drabet på RelB siRNA plus stråling var lidt mindre end den kombinerede effekt af siRNA alene og stråling alene. Således er det muligt andet hit til celler, der allerede var døde kan forklare denne observation. For det tredje blev RelA og RelB hæmmes ved at blokere deres nukleare translokation for yderligere at bekræfte deres roller i reguleringen af ​​PSA og IL-8 udtryk. Mutant konstruktion til kBa (IκBαM) [14] eller p100 (p100M) [15] blev transficeret i LNCaP-celler til at blokere RelA: p50-dimer eller RelB: p52 dimer nuklear translokation hhv. Som vist i fig. 1C, svarene fra PSA og IL-8 udtryk lignede de resultater, der opnås fra RNAi-metoden (fig. 1B). Således blokering af enten RelA eller RelB nukleare translokation effektivt forbedret radiosensitivitet af LNCaP celler.

PSA omvendt korrelerer til IL-8 i PCA celler

PSA og IL-8 har vist sig at være vigtige biomarkører i flere stadier af PCa progression. Vi har vist, at opregulering af IL-8, men nedregulering af PSA er forbundet med stigende tumorgenicitet af PCA-celler [5]. To PCA cellelinjer blev anvendt til at validere korrelation af PSA til IL-8: LNCaP, et androgen responsive PCa cellelinie udtrykker PSA og et lavt niveau af IL-8; PC3, en androgen-uafhængig PCa cellelinie udtrykker et højt niveau af IL-8, men PSA er målbart. Efter transfektion af en IL-8-cDNA-ekspressionskonstruktion i LNCaP-celler, blev de relative niveauer af PSA kvantificeres. Som IL-8-ekspression øges, cellulær PSA niveauer dosisafhængigt reduceret. Desuden knocking- ned PSA PSA siRNA resulterede i dosisafhængige stigninger i de cellulære IL-8-niveauer (fig. 2A). Endvidere udtrykker PSA i PC3-celler førte til reduktion af IL-8-produktion. Der var imidlertid ingen udtryk for PSA i PC3-celler, selv når IL-8 blev knocked- ned af siRNA (Fig. 2B). Det er blevet vist, at NF-KB-aktivering kan mediere prosurvival pathway af IL-8: CXCR2 signalering [16]. At sondere, om NF-KB kan være en mediator for den observerede omvendt forhold mellem IL-8 og PSA, et NF-KB-luciferase-reporterkonstruktion blev co-transficeret i LNCaP-celler med PSA ekspressionskonstruktet eller PSA siRNA. Som vist i fig. 2C, over- ekspression af PSA undertrykkes men PSA-mangel forøget, NF-kB-medieret transkriptionel aktivering.

Sådan manipulere PSA og IL-8 i PCA-celler, blev LNCaP-celler transficeret med en IL-8-cDNA-konstruktion og en PSA siRNA (A); PC3-celler blev transficeret med PSA cDNA konstruere og IL-8 siRNA (B). For at teste, om PSA påvirker NF-KB transkriptionel aktivering, et NF-KB-luciferase-reporterkonstruktion blev co-transficeret med en PSA-ekspressionskonstruktion eller PSA siRNA og en β-gal-ekspression konstruktion i LNCaP-celler. Luciferase responser blev normaliseret med β-gal aktiviteter (C). PSA og IL-8 niveauer blev kvantificeret ved Western blot med normalisering som beskrevet i figur 1.

PSA og IL-8 play modsatte roller i radiosensitivitet af PCA celler

Being NF -κB regulerede genprodukter, PSA og IL-8 kan spille en vigtig rolle i svarene fra PCa til strålebehandling. Vi manipuleret derfor niveauet af PSA og IL-8 til direkte at bestemme deres roller i radiosensitivitet af PCA-celler. Forøgelse IL-8 i LNCaP-celler ved enten at behandle cellerne med IL-8-protein (fig. 3A, øverste felt) eller stabilt transficere IL-8-cDNA i cellerne (fig. 3A, lav panel) resulterede i et fald i PSA niveauer og følsomhed over for stråling. Desuden lentiviral-baserede shRNA stabil knock-down af PSA i LNCaP-celler resulterede i øget IL-8 niveauer og reducere radiosensitivitet af cellerne (fig. 3B). For yderligere at verificere roller PSA og IL-8 i radiosensitivitet af PCA-celler, PSA og IL-8 i PC3-celler blev moduleret ved transfektion af PSA cDNA og IL-8 siRNA hhv. Lentivirus-baserede ekspression af PSA og knock-down af IL-8 i PC3-celler førte til høje niveauer af PSA, reduktion af IL-8 niveauer og forøget radiosensitivitet af PC3-celler (fig. 3C). Tilsammen indikerer disse resultater det omvendte forhold mellem IL-8 og PSA i PCA-celler og antyder, at PSA og IL-8 har modsatte virkninger på radiosensitivitet af PCA-celler.

For at bestemme rollerne for PSA og IL- 8 i radiosensitivitet af PCA-celler, blev LNCaP-celler behandlet med IL-8-protein eller stabilt transficeret med IL-8-cDNA (A) og stabilt transduceret med PSA shRNA lentivirus (B); PC3-celler blev stabilt transduceret med PSA cDNA og IL-8 shRNA lentivirus (C). Niveauerne af PSA blev kvantificeret ved Western blots og niveauet af IL-8 blev kvantificeret ved enten Western-blots eller et ELISA-kit. Celleoverlevelse blev kvantificeret ved trypanblåteksklusion assays. Western blots blev normaliseret med kontrol og celle overlevelse fraktion analyse som beskrevet i figur 1.

opregulering af RelB reducerer radiosensitivitet af LNCaP tumor

in vivo

opnået ovenstående data

in vitro

implicerer RelB og det mål, IL-8 og PSA, som havende en vigtig rolle i radiosensitivitet af PSA. For at verificere rolle RelB i radiosensitivitet af PCa og omvendt forhold mellem IL-8 og PSA udtryk

in vivo

, en stabil RelB-udtrykkende LNCaP klon blev genereret (fig. 4A) og subkutant injiceret i flankerne af nøgne hanmus; tumorvækst blev overvåget i 50 dage ved måling af tumorstørrelse. Tumorvæksthastighed ændring blev kvantificeret ved den tid (dage) kræves for tumorstørrelse at nå et volumen på 500 mm

3. Fig. 4B viser, at den gennemsnitlige tid for kontrolgruppen til at nå 500 mm

3 var 54 ± 6,7 dage. Tumor vækst stigning i RelB-udtrykte klon tog 43 ± 5,6 dage for at nå 500 mm

3. Dyr med en gennemsnitlig tumorstørrelse på 500 mm

3 blev randomiseret i to grupper for 1) Behandling med fraktioneret stråling (3 Gy stråling per dag i 5 dage) og 2) skinkontroller. Musene blev humant aflivet, når tumorerne nåede den maksimale størrelse på 2000 mm

3. Som vist i fig. 4C, i unradiated mus, vektor kontrol tumorer voksede fra 500 mm

3 2000 mm

3 i 25 ± 3,7 dage, mens tumoren udtrykker RelB nået samme størrelse i 14 ± 2,3 dage. Ioniserende stråling (IR) effektivt forhindrede vækst af kontrol tumor inden for den periode af forsøget 50 dage. Imidlertid IR kun stoppet væksten af ​​RelB udtrykkende tumorer i 20 dage post-stråling, hvorefter tumor genvækst blev observeret. Eksperimentet blev afsluttet, fordi nogle mus i de udstrålede grupper udviklede dårlig sundhedstilstand impliceret ved kliniske tegn på systemisk sygdom såsom dehydrering, anstrengt eller overfladisk vejrtrækning, og miste 20% af deres maksimale vægt. Efter tumorerne blev fjernet, blev ekspressionen af ​​RelB og niveauer af PSA og IL-8 i tumorvæv kvantificeret ved anvendelse af et passende antistof for hvert protein. I overensstemmelse med de høje niveauer af RelB identificeret i RelB-udtrykte tumorer, blev IL-8 steget, men PSA blev reduceret i de samme tumorvæv (Fig. 4D).

En stabil RelB udtrykte LNCaP klon var præget af Western blots (A). De RelB /LNCaP-celler blev injiceret i hanmus for tumordannelse og vækst når ned til 500 mm

3 (B). Tumorerne blev behandlet IR (5 x 3 Gy) og tumorvolumener blev målt, indtil de nåede 2000 mm

3 (C). RelB, PSA og IL-8-niveauer blev kvantificeret i tumorlysater og analyseres statistisk (D). Statistiske betydninger af tumor volumen (C) og niveauerne af målet proteiner (D) mellem RelB udtrykt og køretøj kontrol i både no- IR og IR behandlede grupper er angivet.

nedregulering af RelB forbedrer radiosensitivitet af PC3 tumorer

for yderligere at validere den beskyttende rolle RelB mod stråling blev en lentivirus-baserede RelB siRNA PC3 klon valgt (fig. 5A) og injiceret i flankerne af nøgne hanmus. I kontrolgruppen siRNA-gruppen, at den gennemsnitlige tid for en tumor nå 500 mm

3 var 11 ± 2,1 dage, mens den gennemsnitlige tid i RelB knock-down gruppe udvides til 26 ± 5,1 dage (fig. 5B). Tumorer blev behandlet med IR på 3 × 5 Gy efter tumor nåede en gennemsnitlig størrelse på 500 mm

3. I unradiated kontrol mus, tumor størrelse i kontrolgruppen siRNA gruppen voksede hurtigt fra 500 mm

3 til 2000 mm

3 inden for 15 ± 3,1 dage. Sammenlignet med kontrolgruppen siRNA gruppen, tumorvækst i RelB knock-down-gruppen var signifikant langsommere end i kontrolgruppen siRNA gruppen. IR hæmmede væksten af ​​kontrollen tumor med tendensen til genvækst efter 20 dage efter IR. Interessant, IR ikke blot kontrolleret tumorgenvækst, men det også reduceret tumorstørrelse i RelB siRNA-gruppen (fig. 5C). Forskellene observeret

in vivo

ikke simple refleksioner af vækst forskelle

in vitro

fordi der ikke er væsentlige fald i cellevækst da RelB blev stabilt bankede-down i PC-3 celler. Således strålingssensibilisering virkning ved knock-down af RelB skyldes hæmning af stråling-inducerbar NF-KB-aktivering. Virkningerne af siRNA-medieret knock-down af RelB blev bekræftet ved Western blot-analyser af RelB og IL-8 i tumorvæv (fig. 5D). Disse resultater understøtter rolle RelB i svaret fra PCa til strålebehandling.

En lentivirus-baserede RelB siRNA knock-down PC3 klon var præget af Western blots (A). De RelB shRNA /PC3-celler blev injiceret i hanmus for tumordannelse (B). Tumorerne blev behandlet med IR (3 x 5 Gy), når tumorvolumener nåede 500 mm

3 og tumorer fik lov at vokse til 2000 mm

3 (C). RelB og IL-8-niveauer blev kvantificeret i tumorlysater og analyseres statistisk (D). Statistisk analyse for tumor mængder og niveauerne af målproteiner, som beskrevet i figur 4.

Diskussion

PSA er en androgen receptor (AR) -regulated serinprotease produceret af prostata epitelceller [17]. Selv om et forhøjet serum PSA-niveau korrelerer med tilstedeværelsen af ​​PCa, mange faktorer, såsom inflammation, infektion, prostatahyperplasi samt væv processer, føre til visse tab af integritet af den prostatiske kirtel og udsivning af PSA fra hulrummet til det interstitielle flydende og i den generelle cirkulation. [18], [19]. Desuden kan PCa være til stede i fravær af forhøjede serum PSA niveauer [20]. Faktisk er der ingen detekterbare niveauer af PSA i androgen-uafhængige PCA-cellelinier, såsom PC3 og DU-145. Selvom PSA anvendes som biomarkør i diagnosen af ​​PCa, dets biologiske funktion er ikke fuldt belyst. Resultaterne fra denne undersøgelse viser, at cellulære PSA-niveau kan være en vigtig indikator for PCa celle respons på IR. Nedregulering af PSA i androgen responsive LNCaP-celler fører til reduceret radiosensitivitet og ekspression af PSA i androgen-uafhængige PC3 celler resulterer i forbedret radiosensitivitet, hvilket antyder, at PSA spiller en vigtig rolle i reaktionen af ​​PCA-celler til strålebehandling.

IL-8, en pro-inflammatorisk cytokin, entydigt udtrykker i androgen-uafhængige PCA-celler, men ikke i androgen-responsive PCA-celler [8], [21]. Forhøjede IL-8 niveauer i avancerede PCa er blevet anset for at være en væsentlig faktor, der bidrager til kræft celledeling og overlevelse efter behandling [6], [12]. Den foreliggende undersøgelse afslører en interessant forhold mellem PSA og IL-8 i svaret fra PCA celler til strålebehandling. Det omvendte forhold mellem PSA og IL-8 udtryk forvirrer en konklusion, at de observerede ændringer i radiosensitivitet af PCa er afhængige af PSA-niveau; alternativt kan den observerede effekt af PSA medieres delvist af en ændring i IL-8 niveau. De data, der præsenteres i denne rapport direkte demonstrere rolle af IL-8 i radiosensitivitet af PCA celler. Tilsammen udgør disse resultater fremhæve den indviklede forhold mellem IL-8 og PSA, som bidrager til svar på PCA celler til strålebehandling.

NF-KB er konstitutivt aktiv i mange cancertyper, og det fungerer i opregulering af antiapoptotiske og onkogene gener [10], [22], [23]. En anden vigtig biologisk funktion af NF-KB er relateret til koordinering af de medfødte og adaptive immunrespons, der opretholder cellulære forsvarssystemer [3]. Hæmning af NF-KB anses derfor et nyttigt supplement til traditionel kemo- eller radio-terapi. NF-KB består af fem Rel-relaterede proteiner, som indeholder det RelA /p50 heterodimer-medieret klassiske vej og RelB /p52 heterodimer-medieret alternativt forløb [3], [10], [13]. RelB er unikt udtrykkes i avancerede PCA-celler og RelB-baserede alternative forløb spiller en vigtig rolle i tumorigenese af PCa [24], [25]. Vi har tidligere vist, at selektiv inhibering af det alternative forløb bemærkelsesværdigt undertrykker tumorigeniciteten af ​​PCA-celler [5], [26], [27]. Resultaterne fra denne undersøgelse viser, at RelB også kan spille en kritisk rolle i radioresistance af PCA-celler, til dels via en omvendt virkning på udtrykkene for IL-8 og PSA.

AR-aktivitet er essentiel for PCa initiering og progression. Selv når PCa udvikler sig til hormon-refraktær stadier, forbliver AR signalering gennem en række androgen-uafhængige mekanismer [28]. , Ablation af AR-funktionen er således målet for første-linje-behandling. Selv om disse behandlinger er oprindeligt effektive, opstår tilbagevendende tumorer med gendannede AR aktivitet [29] eller endda med en anden ligand bindende receptorer [30]. Som en AR mål, PSA-screening overvåger forvaltningen af ​​PSA. Tilstedeværelsen af ​​AR er ikke tilstrækkelig til at forudsige effektiviteten af ​​behandlingen på grund niveauet af PSA kan også reguleres af mange andre faktorer. Et stort antal undersøgelser har vist, at både AR og NF-KB-signalering er vigtige faktorer i udviklingen af ​​PSA. Restaureringen af ​​AR aktivitet i fravær af androgen betragtes som en mekanisme for PCa som det udvikler sig til det hormon-refraktær fase [29]. Desuden NF-KB-medieret IL-6-STAT3-aktivering menes at være en anden vigtig mekanisme til tumormetastase [31]. Men krydstale mellem de to signalveje er undvigende. Resultaterne af denne undersøgelse viser, at overekspression af RelB øgede cellulære niveau af IL-8, men faldt niveauet af PSA, hvilket antyder, at NF-KB målgener kan differentielt reguleret af forskellige medlemmer af NF-KB familie eller at RelB kan tjene som co-aktivator for IL-8 transskription samtidig tjener som en negativ co-regulator for PSA transskription. Det er blevet vist, at kombinationen af ​​RelB og aryl hydrocarbon receptor (AhR) kan aktivere transkription fra en RelB /AhR element unikt placeret opstrøms for IL-8-KB site [32]. Det har også vist sig, at NF-KB undertrykker PSA transkription gennem en androgen receptor element placeret i promotorregionen af ​​et gen [33]. Vores konklusion er konsistent med den mulighed, at NF-KB ikke kun har kapacitet til at aktivere sit mål gen, men også at inhibere sit målgen afhængig af sammensætningen af ​​faktorer, der påvirker transkription.

Strålebehandling forårsager vækststandsning og død i cancerceller enten ved direkte ionisering af DNA eller ved generering af reaktive oxygenarter (ROS), der kan beskadige DNA’et. Det er blevet vist, at genotoksiske midler, herunder IR, induceret af dobbelt-strenget pauser (DSBs) stimulere NF-KB-vejen til frembringelse af positiv feedback loops via cytokinproduktion, som igen aktiverer DNA reparationsmekanismer [34] – [36]. Den cytokin-aktiverede NF-KB-vejen kan også føre til induktion af antioxidant enzymer, som beskytter kræftceller mod ROS genererer terapeutiske midler. Vores tidligere undersøgelser, som viser, at hæmning af NF-KB og dens antioxidant mål, mangan superoxiddismutase (MnSOD), bemærkelsesværdigt øge radiosensitivitet af aggressive prostatacancerceller [5], [25], er i overensstemmelse med konstateringen af ​​denne senere mekanisme.

Den mekanisme, hvorved PSA kan modulere cellulære respons på stråleterapi fortsat ukendt. Det er muligt at den observerede negative virkning af PSA skyldes til dels, at stigningen i IL-8 niveau når PSA reduceres. Faktisk blev revers sammenslutning af PSA og IL-8 hos begge androgen-responsiv og androgen-uafhængige PCA-celler, hvilket antyder, at forøget forhold af IL-8 til PSA bidrager til radioresistance af PCA-celler. Fremtidig undersøgelse for at bestemme, hvordan niveauet af PSA påvirker produktionen af ​​IL-8 ville være interessant.

Sammenfattende den foreliggende undersøgelse anvender komplementære eksperimentelle metoder til at vise, at RelB bidrager til radioresistance af PCA-celler og omvendt regulerer IL -8 og PSA udtryk. Det omvendte forhold mellem IL-8 og PSA niveauer er prædiktiv for svaret fra PSA-celler for stråling, hvilket antyder potentiale til at forbedre strålebehandling af PCa ved direkte modulation af IL-8 og /eller PSA niveauer. Dette er den første eksperimentelle bevis til indblande rolle PSA i radioterapi af PCA-celler. Insights opnået fra denne undersøgelse giver et videnskabeligt grundlag for anvendelsen af ​​IL-8 /PSA forhold som en cellulær indikator for forvaltningen af ​​PCA celler ved stråling.

Materialer og metoder

Cell kultur og behandling

Humant prostata carcinoma LNCaP og PC3 (American Type Culture Collection, ATCC) blev dyrket og opretholdt i RPMI-medium med 10% føtalt bovint serum. Celler blev behandlet med IR under anvendelse af en 250 kV røntgenapparat (Faxitron X-ray Corp.) med peak energi på 130 kV, 0,05 mm Al filter, i en dosis på 0 til 5 Gy. For at undersøge virkningen af ​​IL-8 på stråling responser blev LNCaP-celler forbehandlet med IL-8 (BD Biosciences) i koncentrationer på 0 til 100 pg /ml i 12 timer forud for bestråling. Radiosensitivitet af PCA celler blev kvantificeret ved hjælp af celle overlevelse fraktion bestemmes af trypanblå eksklusion assay, som beskrevet tidligere [26].

Cell transfektion

For at udtrykke RelA, RelB, PSA, IL-8, p100M og IκBαM proteiner i PCA-celler, blev ekspressionskonstrukter, der koder disse proteiner anvendes. RelA (p65) ekspressionskonstrukt er en gave fra laboratoriet i Nancy Rice (NIH); den p65 cDNA blev klonet mellem H

ind

III – X

ba

I sites i PRC-CMV vektor; RelB, PSA og IL-8 ekspressionskonstruktioner blev købt fra Open Biosystems. RelB katalog-nr .: MHS1010-7507797; PSA katalog-nr .: MHS1010-9205472; IL-8 katalog Nr .: MHS1010-58052. CDNA blev klonet mellem E

Cor

V – N

ot

I sites i pCMV-Sport6 ​​vektor; P100M konstruktionen blev leveret af Dr. Shao-Cong Suns laboratorium på Pennsylvania State University [37]. P100M sekvens blev klonet mellem H

ind

III – X

ba

I sites i pCMV4 vektor; IκBαM konstruktionen blev leveret af Dr. Veronique Imbert laboratorium, vedhæftning cellulaire, Hôpital de Sainte Marguerite, Marseille, Frankrig. KBa (S32-36A) mutant sekvens blev klonet i E

Cor

V websted i pcDNA 3.1 vektor. Alle vektorer indeholder en CMV-promotor og blev anvendt uden nogen inducerbar tilstand. De stabile transficerede kloner blev selekteret ved neomycinresistens. For at knock-down endogene RelA, RelB, PSA og IL-8 i PCA celler, blev den specifikke siRNA (Santa Cruz Biotech.) Transficeret. Lentivirus-baserede shRNA konstruktioner (Open Biosystems) blev anvendt til stabilt at knock-down målene ifølge producentens instruktioner. Niveauerne af proteiner blev bekræftet ved Western blots. En NF-KB-luciferase reporter plasmid indeholdende fire kopier af NF-KB elementer i tilknytning til en SV40-promotor i pGL3-vektoren (Promega) er tidligere blevet konstrueret [25]. Reporterkonstruktet blev co-transficeret med PSA ekspressionsvektoren eller PSA siRNA (Santa Cruz Biotech.) Og β-galactosidase (β-gal) konstruktion i LNCaP-celler for at bestemme virkningen af ​​PSA på NF-KB transkriptionel aktivering.

Dyr

Fire uger gammel mand NCRNU (nu /nu athymiske nøgne) mus blev indkøbt fra Taconic (Hudson). 1,8 X 10

6 PCA-celler blandet med Matrigel (BD Biosciences) blev injiceret i de rigtige flanker musene. Tumorvolumener blev beregnet ugentligt ved hjælp af en standard formel (A × B

2 × 0,52, A og B repræsenterer diagonal tumor længder). De tumorvæv blev opsamlet, og 100 ug væv blev lyseret at kvantificere proteinniveauer anvendelse af Western blots. Dyreforsøg procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of Kentucky, Godkendelse protokol nr 01077M2006.

Western blot.

For at kvantificere protein niveauer, celler og væv ekstrakter var separeret ved anvendelse af SDS-PAGE, 8% (vægt /volumen) polyacrylamidgel, og derefter overført på en nitrocellulosemembran og blottet med primære antistoffer mod RelA, RelB, P100, kBa, PSA, IL-8 og β-actin. En ged anti-mus IgG-HRP konjugeret sekundært antistof blev anvendt til påvisning RelA, PSA, IL-8, og β-actin. Andre proteiner blev påvist under anvendelse af et gede anti-kanin IgG-HRP konjugeret sekundært antistof. Immunoblots blev visualiseret ved en forøget kemiluminescens påvisningssystem (ECL, Amersham Pharmacia Biotech.).

IL-8 kvantificering

Dyrkede medier blev opsamlet ved slutningen af ​​eksperimentelle fremgangsmåder. Niveauerne af IL-8 udskilt fra dyrkede celler blev kvantificeret ved anvendelse af et IL-8 ELISA-kit (BD Biosciences) ifølge producentens protokol.

Statistiske dataanalyser

blev udført flere uafhængige eksperimenter for hvert datasæt. Billeder i Western blots blev kvantificeret ved hjælp Carestream Molecular Imaging software (Carestream Health Inc.). Statistisk signifikans blev analyseret ved hjælp af en envejs ANOVA og Tukeys multiple sammenligningstest, efterfulgt af dataanalyse med Graphpad Prism.