PLoS ONE: De mikroRNA-217 Funktioner som en potentiel tumorsuppressor i Gastric Cancer ved at målrette GPC5

Abstrakt

mavekræft (GC) er en af ​​de mest almindelige maligne sygdomme på verdensplan. Emerging beviser har vist, at afvigende ekspression af microRNA (miRNA) spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​kræft. Men lidt om den potentielle rolle for miR-217 i GC. I denne undersøgelse undersøgte vi rollen som MIR-217 på GC celleproliferation og invasion. Udtrykket af miR-217 blev nedreguleret i GC celler og humane GC væv. Tvungen udtryk for miR-217 hæmmede GC celler spredning og invasion. Desuden glypican-5 (GPC5), et nyt ocncogene, blev identificeret som den potentielt mål for miR-217. Desuden overekspression af miR-217 forringet GPC5-induceret fremme af spredning og invasion i GC celler. Afslutningsvis afslørede disse resultater, at miR-217 fungerede som en tumor suppressor og hæmmede spredning og invasion af GC celler ved at målrette GPC5, som kunne derfor tjene som et terapeutisk mål for GC patienter

Henvisning:. Wang H Dong X, Gu X, Qin R, Jia H, Gao J (2015) MicroRNA-217 Funktioner som en potentiel tumorsuppressor i Gastric Cancer ved Målretning GPC5. PLoS ONE 10 (6): e0125474. doi: 10,1371 /journal.pone.0125474

Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, KINA

Modtaget: 10. oktober 2014 Accepteret: 24 marts 2015; Udgivet: 22 juni 2015

Copyright: © 2015 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft (GC) er den fjerde mest almindelige menneskelige maligniteter og den næststørste årsag til kræftrelaterede dødsfald på verdensplan, med anslået en million nye tilfælde om året [1-4]. Trods nylige fremskridt inden diagnostisk metode, kirurgisk teknik og nye kemoterapi, den langsigtede overlevelsesrate for GC er endnu kun [5, 6]. Hos mange patienter er GC diagnosticeret på fremskredent stadium med omfattende invasion og lymfe metastaser. Succesfulde terapeutiske strategier er begrænsede, og dødeligheden er høj [7]. Derfor er det vigtigt at undersøge de grundlæggende molekylære mekanismer bag den resistens, histologisk heterogenitet, og udvikling af metastaser at identificere nye markører til diagnosticering og behandling for GC.

MikroRNA’er (miRNA) er små, ca. 22 -nucleotide, ikke-kodende RNA, der fungerer som negative regulatorer af protein-kodende gener på posttranskriptionel plan [8, 9]. Ved binding til de komplementære sekvenser i 3′-utranslaterede regioner (3′-UTR) af deres mål mRNA’er, kan miRNA inducerer direkte mRNA nedbrydning eller translationel inhibering [10-13]. Stigende bevis har indikeret, at miRNA er involveret i mange vigtige biologiske processer, herunder celleproliferation, differentiering, apoptose, angiogenese og immunrespons. Deregulering af miRNA kan føre til afvigende genekspression i forskellige sygdomme, herunder gastrisk cancer [14-16]. Men forståelsen af ​​den rolle og funktion miRNA i klassementet er stadig i den tidlige fase. Ligeledes roller mange andre afvigende udtrykte miRNA i GC udvikling er stadig ukendt.

nedregulering af miR-217 er en hyppig begivenhed i forskellige kræftformer, tyder vigtig rolle i tumorigenese [17-19]. Men lidt om den potentielle rolle for miR-217 i GC. I denne undersøgelse blev ekspressionen af ​​MIR-217 faldt i GC-cellelinier og væv. Desuden lavere ekspression af MIR-217was forbundet med pTNM fase. Overekspression af MIR-217 undertrykte GC celleinvasion og proliferation. Desuden luciferase reporter assay og western blot bekræftede, at miR-217might funktion som en tumor suppressor i GC ved targetingGlypican-5 (GPC5).

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle patienter enige om at deltage i undersøgelsen og gav skriftligt informeret samtykke. Denne undersøgelse og samtykke blev godkendt af den etiske bestyrelse instituttet af den tilknyttede Yanan Hospital i Kunming Medical University og overholdt Helsinki Deklarationen.

Vævsprøver

Prøver af humane GC væv og parret -adjacent ikke-tumor gastrisk væv, der var længere væk end 5 cm fra tumorer blev opnået fra 50 patienter, som gennemgik kirurgi resektion på den tilknyttede Yanan Hospital i Kunming Medical University. Friske prøver var snap frosne inliquid nitrogen umiddelbart efter resektion og opbevaret ved -80 ° C. Alle prøver blev opnået med patienternes informerede samtykke og blev histologisk bekræftet ved farvning med hæmatoxylin-eosin. Den histologiske kvalitet af kræft blev vurderet efter kriterier fastsat af Verdenssundhedsorganisationen. Ingen af ​​patienterne modtog strålebehandling eller kemoterapi før kirurgi. De karakteristiske træk ved patienter er beskrevet i S1 tabel.

cellelinjer og cellekultur

Humane gastriske kræftceller SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 og en normal gastrisk epitelcelle linje GES-1 (som kontrol) blev købt fra Institut for Biokemi og Cellebiologi ved Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 blev propageret i RPMI 1640 medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og GES-1 blev opformeret i Dulbeccos modificerede Eagles medium (Invitrogen). Alle medier blev suppleret with10% føtalt bovint serum. Cellelinier blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO2.

RNA-ekstraktion og QRT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra frosne prøver (eller cellerne) under anvendelse af Trizol ( Invitrogen) ved at følge fabrikantens vejledning. 1 ml RNA blev anvendt til at måle ekspressionen af ​​MIR-217 ved kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) med TaqMan miRNA revers transkription kit andtheTaqMan miRNA assay-specifikke RT-primere for MIR-217 ifølge instruktionerne fra fabrikanten (Applied Biosystems, Foster City, CA). Udtrykket af U6 blev anvendt som intern kontrol. Real-time PCR blev udført med 1 ml af hver cDNA på en Step One Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) i dubletter. Ekspressionen af ​​MIR-217 blev defineret baseret på tærsklen cyklus (Ct), og relative ekspressionsniveauer blev beregnet as22

– [(Ct af MIR-217) – (Ct of U6)] efter normalisering med henvisning til ekspression af U6 lille nukleare RNA [20, 21] (S2 tabel).

Western blot

Samlet protein blev ekstraheret fra frosne prøver (eller celler) ved hjælp af en Total protein Extraction Kit (KeyGen, Nanjing , Kina) ifølge producentens instruktioner. Måling af proteinkoncentration blev udført under anvendelse af et BCA Protein Assay Kit (KeyGen). Western blot-analyse blev udført som tidligere beskrevet [22]. De primære antistoffer anvendt til western blot var kanin-polyklonalt anti-GPC5 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), monoklonalt muse-anti-GAPDH (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA).

Cell transfektion

mIR-217 efterligner, efterligner kontrol (scramble), miR-217-hæmmer, hæmmer kontrol, Pez-GPC5 og kontrol vektor blev købt fra RiboBio (Guangzhou, Kina). De HGC-27-celler blev podet i seks-brønds plader ved 30% konfluens én dag forud for transfektion. Lipofectamin 2000 (Invitrogen) blev anvendt til transfektion af plasmid alene eller sammen med RNA-oligonukleotider.

luciferaseassays

celler fra 8 × 10

3 blev udpladet i plader med 96 brønde. Efter 24-hincubation, en blanding af 100-ng pLUC-3′-UTR, 5-pmol negativ kontrol, MIR-217mimic blev cotransficeret med 20 ng Renilla i celler under anvendelse af Lipofectamine 2000. Fireogtyve hoursafter transfektion, ildflue og Renilla luciferase aktiviteter var målt med et Dual-Luciferase Reporter System (Promega, Madison, WI, USA). Transfektionseffektiviteten blev normaliseret ved cotransfektion med et Renilla reporter vektor.

Celleproliferation

Celler (3000 /brønd) blev opsamlet og udsået i 96-wellplates og inkuberet ved 37 ° C efter transfektion. Efter inkubation i 1 til 5 dage, til medierne af hver brønd blev tilsat 10% Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo, Kumamoto, Japan), og pladerne blev yderligere inkuberet i yderligere 3 timer ved 37 ° C. Derefter blev mediet erstattet med 150 ml dimethylsulfoxid (DMSO; Sigma-Aldrich), og absorbansen blev målt ved 450 nm under anvendelse af en mikropladelæser (Sunrise). Assayet blev gentaget 3 gange med seks replikater.

Northern blot

Totalt RNA blev isoleret fra hvert væv ved hjælp af TRIzol-reagens (Invitrogen Life Technologies) og Northern blotting blev udført som tidligere beskrevet [23] . Efter Perfekt Hyb Plus hybridisering ved 68 ° C blev membranerne udviklet og analyseret. Northern blots hybridiseret med en 18S ribosomal RNA (rRNA) cDNA blev anvendt som kontroller.

celleinvasion

Invasion assays blev udført tre gange ved anvendelse af Transwell invasion kamre belagt med Matrigel (BD, USA) som beskrevet i fabrikantens protokol. Celler blev transficeret withmiR-217 efterligner, inhibitor eller negativ kontrol-oligonukleotid, dyrket i 48 timer, og overføres på toppen af ​​Matrigelcoatede invasions kamre i et serumfrit DMEM (1 × 10

5 celler pr Transwell). DMEM indeholdende 10% føtalt kalveserum blev tilsat til de nedre kamre. Efter inkubation i 24 timer, celler, der forblev på toppen af ​​filteret blev skrubbes og celler, der migrerede til den nedre overflade blev fikseret in90% alkohol og efterfulgt af krystalvioletfarvning.

Histologi

Histologisk diagnose var i overensstemmelse med den triple-stedet gastrisk biopsi metode. Væv blev fikseret natten over i pufret formalin, indlejret i paraffin, skåret til 3 um tykkelse, og farvet med hematoxylin-eosin (H 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultat

Udtrykket af miR-217 nedreguleres i GC cellelinjer

Vi først kvantificeret udtrykket niveau af miR-217 i fire humane GC cellelinjer (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) og GES-1 ved hjælp af northern blot (fig 1A). Ekspressionsniveauet af MIR-217 wasdecreased i GC cellelinjer sammenlignet med GES-1. QuantitativeRT-PCR viste også, at ekspressionen af ​​MIR-217 blev reduceret i GC cellelinier (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) sammenlignet med GES-1, en normal gastrisk epitelcellelinie (Fig 1B ).

(A) ekspressionsniveauet af mIR-217 i fire humane GC cellelinier (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) og GES-1 blev kvantificeret ved anvendelse af Northern blot . (B) udtrykket af miR-217 blev vurderingen i GC cellelinier (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) andGES-1Brug Kvantitativ RT-PCR.

mIR-217 nedreguleres i GC væv

Kvantitativ RT-PCR blev anvendt til at undersøge miR-217-ekspression i 50 GC væv og deres parrede tilstødende noncancerous væv. De repræsentative histologiske karakteristika GC og dets parrede tilstødende noncancerous væv blev vist i fig 2A. Blandt 50 tumorvæv, 44 sager udviste nedsat MIR-217-ekspression sammenlignet med de hosliggende normale væv (88%, 44 50, Fig 2B). Ekspressionen af ​​MIR-217 var lavere i GC væv end i tilstødende noncancerous væv (fig 2C). . Desuden lavere niveauer af MIR-217-ekspression er forbundet med pTNM fase af GC patienter (Fig 2D)

(A) Vævene var histologisk bekræftet ved anvendelse H 0,05, og ** p 0,01, *** p 0,001. En-vejs ANOVA blev udført til analyse.

miR-217 hæmmer GC celledeling og invasion

udtryk for MIR-217was steg i transfekterede HGC-27 celler ved hjælp af miR-217 efterligner (fig 3A) og faldt under anvendelse mIR-217 inhibitor (fig 3B). Spredningen blev reduceret i HGC-27 celler transficeret withmiR-217 efterligner sammenlignet med celler transficeret med scramble eller ubehandlet (fig 3C). I mellemtiden blev proliferation forøget i HGC-27 celler transficeret withmiR-217inhibitor sammenlignet med celler transficeret med kontrol eller ubehandlede (Fig 3D). Den invasionsevne af celler transficeret med miR-217 efterligner blev faldet i forhold til kapløbet gruppe eller kontrolgruppen celler og miR-217-hæmmer øget celle invasion sammenlignet med de scramble gruppe eller kontrolgruppen celler (Fig 3E).

( A) Real-time RT-PCR-analyse af miR-217 i HGC-27 celler ved transfektion ofmiR-217 mimic. Udtrykket af miR-217 i HGC-27 celler transficeret med miR-217 efterligner var op-regulated.U6 snRNA blev anvendt som intern kontrol. (B) Udtrykket af miR-217 i HGC-27 celler transficeret med miR-217inhibitor var nede-regulated.U6 snRNA blev anvendt som intern kontrol. (C) Ektopisk MIR-217-ekspression signifikant inhiberede celleproliferation, hvilket fremgår af CCK8 assay. (D) Inhibering af MIR-217-ekspression fremmes signifikant celleproliferation, hvilket fremgår af CCK8 assay. (E) Invasion analyse af HGC-27cells efter behandling withmiR-217 efterligner, inhibitorer eller scramble eller kontrol; det relative forhold mellem invasive celler pr felt er vist nedenfor, * p 0,05, ** p 0,01, og *** p. 0,001

miR-217 posttranskriptionel reducerer GPC5 udtryk ved direkte rettet mod dens 3’UTR

Analyse ved hjælp af tilgængelige algoritmer indikerede, at GPC5 var en teoretisk target gen af ​​miR-217 (fig 4A) [24]. For at bevise at MIR-217 direkte målrettet GPC53’UTR udførte vi luciferasereportergenet assays. Ektopisk af MIR-217 reducerede luciferaseaktivitet i GPC5 vildtype reportergenet men ikke den mutante GPC5 3’UTR, hvilket indikerer, at MIR-217 direkte målrettet GPC5 3’UTR (Fig 4B). MRNA-niveauet af GPC5 blev reduceret efter transfektion med MIR-217 efterligner og forøget efter transfektion med MIR-217-inhibitor under anvendelse af QRT-PCR (figur 4C). I overensstemmelse med dette resultat blev evnen hos MIR-217 til at regulere ekspressionen af ​​GPC5 proteinet verificeret ved Western blotting (Fig 4D). Salg

(A) 3′-UTR af GPC5 mRNA indeholder bindingssekvenser af miR-217. (B) Relativ luciferaseaktivitet af de angivne GPC5reporter konstruktet i HGC-27cells vises. Ildflueluciferase værdier blev normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet og afbildet som relativ luciferaseaktivitet. (C) MIR-217 overekspression reducerede signifikant GPC5 mRNA-niveauer i HGC-27-celler og MIR-217 inhibitor væsentligt forbedret de GPC5 mRNA niveauer i HGC-27-celler. (D) Western blotting blev udført for at undersøge virkningerne af miR-217 på ekspressionen af ​​GPC5. GAPDH blev også påvist som en belastning kontrol.

Restaurering af miR-217 hæmmer GPC5-medieret GC celledeling og invasion

Overekspression af GPC5 fremmet GC celledeling og invasion. Når MIR-217 mimic og PEZ-GPC5 blev cotransficeret ind i HGC-27-celler, MIR-217-ekspression reducerede GPC5-inducerede GC celleproliferation og invasion (figur 5A og 5C). Inhibering af GPC5 reducerede GC celleproliferation og invasion. Når MIR-217-inhibitor og shGPC5 blev cotransficeret ind i HGC-27-celler, MIR-217 inhibitor fremmet shGPC5-inhiberede celleproliferation og invasion (figur 5B og 5D).

(A) cellevækst i HGC- 27co-transficeret med enten mIR-217 mimic eller 2,0 ug pez-GPC5 eller pCDNA tom vektor ved anvendelse CCK-8 proliferationsassay. (B) Den cellevækst i HGC-27co-transficeret med enten mIR-217 inhibitor eller 2,0 ug shGPC5 (stød ned GPC5) eller pCDNA tom vektor ved anvendelse CCK-8 proliferationsassay. (C) cellen invasive i HGC-27co-transficeret med enten mIR-217 mimic eller 2,0 ug pez-GPC5 eller pCDNA tom vektor ved anvendelse invasion assay. (D) Den celle invasive i HGC-27co-transficeret med enten mIR-217inhibitor eller 2,0 ug shGPC5 eller pCDNA tom vektor ved anvendelse invasion assay. * P 0,05, ** p 0,01, og *** p. 0,001

GPC5 opreguleres i GC cellelinjer og prøver

udtryk for GPC5 var højere i GC cellelinier (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) sammenlignet med GES-1, en normal gastrisk epitelcellelinie (fig 6A). Protein- niveauerne af GPC5 var også højere i GC væv end i tilstødende noncancerous væv under anvendelse western blot (Fig 6B).

(A) mRNA ekspression af CPG5 blev vurderingen i GC cellelinier (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) og GES-1 under anvendelse af kvantitativ RT-PCR. (B) Proteinet niveau CPG5 i otte humane GC væv og de tilstødende normale kontroller blev kvantificeret ved hjælp af Western blot.

Diskussion

GC forårsager næsten en million dødsfald på verdensplan om året [ ,,,0],25]. For nylig er akkumulerende beviser, at der miRNA spiller en afgørende rolle i patogenesen af ​​GC gennem regulering af celleproliferation, apoptose, migration, annoncer invasion [26-28]. I denne undersøgelse blev MIR-217 hyppigt nedreguleret i humane GC cellelinjer og væv og det lavere niveau af MIR-217 var forbundet med pTNM fase af GC. Yderligere forsøg indikerede, at overekspression af MIR-217 kan undertrykke GC cellemigration og invasion. GPC5 blev identificeret som en direkte og funktionel mål for miR-217. Vi konkluderer, at MIR-217 synes at være en hidtil ukendt tumorsuppressor i GC og at nedreguleret MIR-217 kan bidrage til tumorudvikling og progression i GC patienter. Nedregulering af miR-217 er en hyppig begivenhed i forskellige kræftformer, tyder vigtig rolle i tumorigenese [17-19]. Li og hans kolleger har vist, at MIR-217 blev nedreguleret i klar celle renalcellecarcinom (ccRCC) sammenlignet med parrede normale væv [29]. Lower MIR-217 ekspressionsniveauet var forbundet med højere tumorklassificering og scene. I denne undersøgelse blev MIR-217 hyppigt nedreguleret i GC. Interessant nok patienter med lavere ekspression af MIR-217 tendens til at have mere avanceret TNM stadie, hvilket antyder, at lav ekspression ofmiR-217was forbundet med GC progression. Yderligere undersøgelser viste, at overekspression af MIR-217 undertrykt GC celleinvasion og proliferation. Sammen med tidligere resultater, antyder disse data at MIR-217might spille en afgørende rolle i GC vævshomeostase og deregulatedmiR-217 kan bidrage til udviklingen af ​​en mave neoplasi.

For at undersøge den molekylære mekanisme af tumor suppressor rolle af miR-217 i GC, brugte vi luciferase reporter assay og western blot at bekræfte, at GPC5 var et mål på miR-217 i GC celler. For at bekræfte den direkte regulering af GPC5 af miR-217, brugte vi GPC 3’UTR reporter vektor bærer potentialet miR-217 bindingssted i fluorescerende reporter. Desuden QRT-PCR og western blot analyse viste, at overekspression af miR-217 hæmmede GPC udtryk. Glypicans er en familie af proteoglycaner, som er knyttet til exocytoplasmic overflade af plasmamembranen via en glycosyl phosphatidylinositol anker [30, 31]. Seks glypicans er blevet identificeret i pattedyr (GPC1 til GPC6) [32, 33]. GPC5 der primært udtrykkes i udviklingen centralnervesystemet, lemmer, nyre, lunge og lever [34, 35]. Nylige undersøgelser har indikeret, at nogle GPCs, især GPC3 andGPC5, kan spille en vigtig rolle i regulering af udviklingen af ​​kræft [35, 36]. For eksempel,

Zhang

et al. viste, at GPC5 blev højt udtrykt i SACC-M (høj lunge-metastatisk cellelinie) og i kliniske prøver af spyt adenoid cystisk carcinom (SACC) tilfælde med lunge metastase [36]. Det samlede udtryk niveau GPC5 i kliniske tilfælde af SACC med lunge metastase var højere. Williamson et al. viste, at genet, der koder GPC5was amplificeret i 20% af patienter med alveolær rhabdomyosarcom (RMS), og at dette glypican blev overudtrykt i RMS patienter. Desuden nedregulering af GPC5 ekspression ved siRNA inhiberede proliferation på RMS-celler. En anden undersøgelse viste, at høje niveauer af GPC5 udtryk forudsagde dårlige postkirurgiske overlevelsestid for kurativt respekterede NSCLC patienter, hvilket tyder på værdien af ​​GPC5 som en molekylær prognostisk indikator [35, 37]. I vores undersøgelse ekspressionen af ​​GPC5 var højere i GC cellelinier og proteinet niveauer af GPC5 var også højere i GC væv end i tilstødende noncancerous væv. Inhibering af GPC5 reducerede GC celleproliferation og invasion. Restaurering af miR-217 hæmmede GPC5-medieret GC celledeling og invasion. Disse resultater viste, at MIR-217might fungere som en tumorsuppressor i gastrisk cancer ved at målrette GPC5.

Som konklusion den foreliggende undersøgelse viste, at MIR-217was nedreguleret i GC væv og cellelinier. Lave niveauer af miR-217-ekspression var forbundet med pTNM etape af patienterne. Ektopisk MIR-217-ekspression resulterede i inhibering af GC-celleproliferation og invasion. Yderligere undersøgelser afslørede, at GPC5 var et potentielt mål for miR-217. miR-217 kan tjene som en indikator for prognose og en terapeutisk mål for GC patienter.

Støtte Information

S1 Table. Oversigt over klinisk-patologiske parametre for patienter med mavekræft

doi:. 10,1371 /journal.pone.0125474.s001

(DOCX)

S2 Table. Primer sekvens

doi:. 10,1371 /journal.pone.0125474.s002

(DOCX)