PLoS ONE: Kombination Virkning af epigenetisk regulering og ioniserende stråling i kolorektal cancer Cells

abstrakt

Eksponering af celler for ioniserende stråling (IR) inducerer ikke blot, aktivering af multiple signalveje, der spiller kritiske roller i cellen skæbne beslutsomhed, men også ændring af molekylære veje involveret i celledød eller overlevelse. For nylig er DNA-methylering blevet etableret som en kritisk epigenetisk proces involveret i reguleringen af ​​genekspression i cancerceller, hvilket antyder, at DNA-methylering inhibering kan være en effektiv kræftbehandling strategi. Fordi ændringer af genekspression ved DNA-methylering er blevet anset for at påvirke radioresponsiveness, undersøgte vi virkningen af ​​et DNA-methyltransferase inhibitor, 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-dC), på radiosensitivitet. Derudover undersøgte vi de underliggende cellulære mekanismer i kombinationsbehandlinger af ioniserende stråling (IR) og 5-aza-dC i humane colon cancerceller. Tyktarmskræft cellelinjer blev oprindeligt testet for stråling følsomhed af IR

in vitro

og blev behandlet med to forskellige doser af 5-aza-dC. Overlevelse af disse cellelinjer blev målt ved anvendelse MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid) og klonogene assays. Virkningerne af 5-aza-dC sammen med bestråling på cellevækst, cellecyklusfordeling, apoptose, og apoptose-relaterede genekspression blev undersøgt. Kombination bestråling behandling med 5-aza-dC signifikant nedsat vækst aktivitet sammenlignet med strålebehandling alene eller med 5-aza-dC behandling alene. Procentdelen af ​​HCT116 celler i sub-G1 fase og deres apoptotiske sats blev øget, når celler blev behandlet med bestråling i kombination med 5-aza-dC sammenlignet med enten behandling alene. Disse observationer blev kraftigt støttet af øget caspase aktivitet, øget komet haler hjælp komet analyser, og øget protein niveauer af apoptose-associerede molekyler (caspase 3/9, kløvet PARP). Vores data viste, at 5-aza-dC forstærket radiosensitivitet i colon cancerceller, og de kombinerede virkninger af 5-aza-dC med stråling viste større cellulære virkninger end det enkelt behandling, hvilket tyder på, at kombinationen af ​​5-aza-dC og stråling har potentialet til at blive en klinisk strategi til behandling af cancer

Henvisning:. Kim JG, Bae JH, Kim JA, Heo K, Yang K, Yi JM (2014) Kombination Effekt af epigenetisk regulering og ioniserende stråling i Colorectal Cancer Cells. PLoS ONE 9 (8): e105405. doi: 10,1371 /journal.pone.0105405

Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan

Modtaget: 25. maj 2014; Accepteret: 21 Juli 2014; Udgivet: 19 August, 2014

Copyright: © 2014 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev understøttet af en National R Medical Sciences finansieret af den koreanske ministerium for undervisning, videnskab og teknologi. Dette arbejde blev også støttet af National Research Foundation (NRF) og Ministeriet for Videnskab, IKT og fremtidig planlægning (MSIP), koreanske regering gennem sin National Nuclear Technology Program (2013M2A2A7043665). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epigenetik er studiet af arvelige ændringer i genekspression eller cellulære fænotype forårsaget af andre end ændringer i de underliggende DNA-sekvenser mekanismer [1]. Den epigenetiske regulering af genekspression medieres af mekanismer såsom DNA-methylering, modifikationer af histoner, og positionering af nukleosom langs DNA’et. Typisk DNA hypermethylering spiller en kritisk rolle i inaktivering af gener involveret i cellecyklusregulering, DNA-reparation, apoptose, cellesignalering, transkription, og andre cellulære processer [2].

afvigelser i DNA-methylering er jævnligt observeret i mange forskellige typer cancer [3], [4]. Især nedregulering af tumorsuppressorgener eller andre cancerrelaterede gener af Aberrant DNA hypermethylering i promotor eller regulatoriske områder bidrager til tumorigenese [5], [6]. I modsætning til genetiske ændringer, epigenetiske arrangementer, herunder DNA methylering, er reversible, hvilket gør epigenetisk regulering yderst interessant fra et synspunkt om at udvikle nye tilgange til terapi. DNA hypermethylering kan vendes ved DNA-demethylering midler. Derudover kan DNA methyltransferase (DNMT) hæmmere genoprette ekspressionen af ​​gener tavse af DNA-methylering. I de seneste år har DNMT inhibitor, 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-dC), har vist sig at have anticancer aktiviteter i patienter med leukæmi, myelodysplastisk syndrom, og flere faste tumorer [7], [8] . Selv om en enkelt epigenetisk terapi ikke har vist signifikante reaktioner mod de fleste faste tumorer [9], prækliniske undersøgelser tyder på, at en kombination af epigenetiske modifikatorer, såsom DNMT inhibitorer eller histondeacetylaseinhibitorer, kan være effektive. Desuden kan kombinationer af disse epigenetiske modifikatorer med konventionelle kemoterapeutika også være effektive. Derfor er disse typer af kombinatoriske behandlinger, der undersøges i kliniske forsøg [10], [11]. Imidlertid har nogle rapporter undersøgt radiosensitivitet forbundet med udsættelse for 5-aza-dC [12] – [15]. For nylig har der været en stigende interesse for strategier via stoffer, der regulerer cellulær radiosensitivitet at øge tumor radiosensitivitet. Derfor, i denne undersøgelse, rapporterer vi det terapeutiske potentiale for at kombinere 5-aza-dC med ioniserende stråling (IR) for at øge radiosensitivitet i kolorektale carcinomceller og undersøge de cellulære mekanismer bag disse effekter.

Materialer og metoder

Cell kultur og 5-aza-dC behandling

de humane kolorektale karcinom cellelinjer: HCT116, SW480, Colo320, og RKO, der blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, VA, USA), såvel som en dobbelt-knockout-celler (DKO) til DNA methyltransferase-1 og DNA methyltransferase-3b i HCT116 cellelinie [16], som bibeholder 5% genomisk DNA-methylering, blev dyrket ved 37 ° C med 20 % O

2 og 5% CO

2. De HCT116, DKO og SW480-celler blev opretholdt i McCoys 5A medium (WelGENE, Daegu, Korea). Colo320 celler blev holdt i RPMI-medium (WelGENE). RKO-celler blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) (WelGENE) indeholdende 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, UT, USA) og 1% antibiotisk-antimycotisk (Gibco, Grand Island, NY, USA). Cellerne blev behandlet med 5-aza-dC (0,5 eller 1 uM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). En gang dagligt i 3 dage (Figur S1)

Ioniserende bestråling (IR) eksponering Salg

celler behandlet med 5-aza-dC i 3 dage eller ikke-behandlede kontrolceller blev udsat for gammastråler fra en

137Cs-ray source (Eckert Ziegler, Berlin, Tyskland) i en dosis på 2,6 Gy /min. Efter bestråling i doser på 2, 5, og 10 Gy, cellerne blev inkuberet i 3 dage ved 37 ° C, 20% O

2, og 5% CO

2.

klongenicitetsassayet

HCT116 blev SW480, RKO, Colo320, og DKO celler podet i 6-brønds plader (5000 celler /brønd) og behandlet med 5-aza-dC og IR. Celler blev dyrket i 2 uger. Dyrkningsmediet blev udskiftet med frisk medium hver 2. dag. Kolonierne blev fikseret og farvet med 1,25% krystalviolet, vasket omfattende at fjerne overskydende farvestof, og afbildes under anvendelse af en MultiXpress C9250ND scanner (SAMSUMG, Seoul, Korea). Kolonier med 50 celler /koloni blev talt ved hjælp af Image-Pro Plus 7.0 software (Media Kybernetik, Rockville, MD, USA)

celledeling og cellelevedygtighedsassays

Cell spredning var. bestemt under anvendelse af 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay. Celler (2 x 10

5 celler /brønd) blev podet i plader med 6 brønde og inkuberet ved 37 ° C. Efter 48 timer blev cellerne vasket to gange med phosphatbufret saltvand (PBS) og 5 mg /ml MTT i PBS blev tilsat til hver brønd i 4 timer. Efter fjernelse af MTT-opløsning, en opløsning opløsning (dimethylsulfoxid /ethanol, 01:01) blev tilsat til hver brønd for at opløse formazan-krystallerne. Absorbansen ved 570 nm blev målt under anvendelse af en Paradigm mikropladelæser (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). HCT116-celler behandlet med 5-aza-dC og /eller bestråling blev podet ved en koncentration på 5 × 10

4 celler /brønd i plader med 6 brønde. Efter 24, 48, 72 og 96 timer blev cellerne høstet, fortyndet med en trypanblå arbejdsopløsning og talt for at generere en vækstkurve.

Tumorvækst analyse

I

in vivo

evaluering af tumorvækst, vi anvendte en subkutan tumor-bærende SCID mus xenograftmodel genereret ved at inficere celler. Kvindelige C.B-17 SCID-mus blev indkøbt fra Central Lab. Dyr (Seoul, Korea). Seks uger gamle hunmus blev opdelt i forsøgsgrupper (n = 3 i hver gruppe). Mus blev injiceret subkutant i den højre side af den dorsale område med 5 × 10

6 celler fortyndet i 100 pi PBS. Tumorvolumenerne blev målt en gang om ugen. Tumorvolumen blev estimeret ved anvendelse af følgende ligning: (korte akse)

2 × (lang akse) × 0,5

Flowcytometrisk analyse

Cellecyklusanalyse blev udført under anvendelse propidiumiodid (PI. ). Celler blev trypsinbehandlet, vasket med PBS og fikseret i 75% ethanol ved 4 ° C i 1 time. Før analyse blev celler vasket igen med PBS, suspenderet i en kold PI opløsning med 1 mg /ml RNase og inkuberet i mørke i 30 minutter ved stuetemperatur. Flowcytometri analyse blev udført under anvendelse af et FACScan-instrument (BD FACSAria, BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Apoptose af behandlede celler blev vurderet ved anvendelse af et Annexin V /FITC Apoptose Detektion Kit (BD Biosciences). Kort fortalt blev alle cellerne podet og behandles i 100 mm skåle. Efterfølgende blev cellerne vasket to gange med kold PBS. Cellerne blev farvet med phycoerythrin (PE) annexin V og 7-amino-actinomycin og inkuberet i 15 minutter i mørke. Efter farvning blev bindingsbuffer tilsat til cellerne, som blev analyseret under anvendelse af FACScan-instrument. FACSDiva software (BD Biosciences) blev anvendt til dataanalyse. Salg

Caspase 3/7 aktivitetsassay

I caspase 3/7 aktivitetsassay, cellerne (5 x 10

3 celler ) blev podet med 100 pi McCoys 5A-medium i en 96-brønds plade. Efter 24 timers inkubation, 100 pi af Caspase-Glu 3/7 assay (Promega, Madison, WI, USA) substrat og puffer blandingen blev tilsat til hver brønd. Cellerne og opløsninger blev forsigtigt blandet i 30 min og inkuberet ved stuetemperatur i 1 time i mørke. Fluorescens blev målt under anvendelse af et luminometer (ATTO, Tokyo, Japan). Alle assays blev gentaget tre gange og indeholdt negative kontroller.

DNA beskadigelse assay

DNA-skader blev bestemt under anvendelse af OxiSelect Comet Assay Kit (Cell Biolabs, San Diego, CA, USA). 5-aza-DC- og /eller IR-behandlede HCT116-celler (1 x 10

5) blev blandet med lavt smeltepunkt agarose (1:10 forhold), og derefter blev komet objektglas blev fyldt med 75 pi blandingen. Objektglassene blev inkuberet ved 4 ° C i 30 minutter og derefter nedsænket i lysepuffer ved 4 ° C i mørke i 1 time. Lysisbufferen blev derefter aspireret fra objektglassene, og objektglassene blev neddyppet i basisk opløsning ved 4 ° C i mørke i 30 min. Dernæst at fjerne den alkaliske opløsning blev objektglassene opbevaret i Tris-acetat-EDTA (TAE) puffer i 5 minutter. Objektglassene blev anbragt i en horisontal elektroforese kammer og underkastet elektroforese med TAE-buffer ved 25 V i 20 minutter. Objektglassene blev tørret og farvet med DNA-farvestof (CELL Biolabs). Komethaler blev påvist under en fluorescerende mikroskop (Nikon, Tokyo, Japan).

Western blot-analyse

Celler blev lyseret i lysisbuffer, og totale cellelysater indeholdende lige store mængder af proteiner blev påsat 4-12% geler til natriumdodecylsulfat-polyacrylamid gelelektroforese og derefter overført til polyvinylidendifluorid membraner (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ USA). Membranerne blev blokeret med 5% mælk opløst i PBS indeholdende 0,02% Tween-20 og inkuberet natten over ved 4 ° C med specifikke primære antistoffer. Membranerne blev efterfølgende inkuberet med specifikt peberrod peroxidase-konjugeret sekundære antistoffer. Proteinbånd blev visualiseret under anvendelse af et Fusion FX5-system (Vilber Lourmat, Eberhardzell, Tyskland). De følgende primære antistoffer blev anvendt: anti-spaltet caspase 3 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), anti-spaltet caspase 9 (Cell Signaling Technology), anti-spaltet PARP1 (Cell Signaling Technology), anti-survivin (Abcam , Cambridge, MA, USA), anti-p53 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), og anti-α-actin (Sigma-Aldrich).

Statistisk analyse

resultaterne var præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af Students

t

-test. En

P

-værdi mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Etik Statement

Alle dyr protokoller, der anvendes i den aktuelle undersøgelse blev gennemgået og godkendt af Institutional Animal Care og Brug udvalget på Dongnam Institute of Radiologisk Sundhed og Sygdom (dirams-IACUC-11-005).

Resultater

Effekter af 5-aza-dC på radiosensitivitet af kolorektal cancer cellelinjer

For at afgøre, om 5 aza-dC øger den cellulære følsomhed over for IR, den tyktarmskræft cellelinjer HCT116, SW480, RKO, Colo320, og DKO blev udsat for 5-aza-dC ved to forskellige doser (0,5 uM og 1 uM) for 72 timer, før de udsat for tre forskellige IR-doser (2 Gy, 5 Gy og 10 Gy) (Figur S1). Dernæst blev en klongenicitetsassayet udført viser, at 5-aza-dC kunne radiosensitize alle de afprøvede kolon cancercellelinier, og kombinationen af ​​5-aza-dC og IR var bedre behandling end 5-aza-dC alene. DKO celler, genetisk inhibere DNMT1 og 3b viste også vækstsuppression ved IR med dosisafhængig måde (figur 1A).

(A) klongenicitetsassayet af HCT116, SW480, Colo320, og RKO-celler behandlet med 5-aza -dC (0,5 og 1 uM) og /eller IR (2 Gy, 5 Gy og 10 Gy). Klongenicitetsassayet af bestrålet (2 Gy, 5 Gy, og 10 Gy) DKO-celler. Celler blev podet i plader med 6 brønde (5000 celler /brønd) og behandlet med 5-aza-dC /IR. Efter 2 uger blev kulturerne fikseret med ethanol og farvet med 1,25% krystalviolet. Fotografier af enkelte kolonier er også vist. (B-E) Overlevelse fraktion (SF), i HCT116 /DKO (B), SW480 (C), Colo320 (D) og RKO (E) -celler behandlet med 5-aza-dC (0,5 og 1 uM) og /eller ioniserende stråling (IR, 2 Gy, 5 Gy og 10 Gy). SF blev beregnet som middelværdier kolonier /sederede celler. Dosis enhancement blev beregnet som forholdet mellem SF kurve opnået ved behandling med en kombination af 5-aza-dC og IR med den opnået ved behandling med IR alene. Data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse for tre uafhængige forsøg.

P

-værdier blev beregnet ved hjælp af Students

t

-test. *

P

0,05; **

P

0,01; ***

P

. 0,001

Stråling overlevelseskurver blev genereret for hver cellelinje behandlet med 5-aza-dC og IR at forstå, om bestråling kan sensibiliseret med 5 aza-dC i colon cancer cellelinjer (figur 1B-E). Brug af dosis, der kræves for at generere en overlevelse fraktion (SF) på 0,5 som reference, blev dosis ekstraudstyr satser (ders) estimeret. Celler behandlet med 5-aza-dC i 72 timer inden bestråling viste en stigning i radiosensitivitet, med en DER af: 1,19 (0,5 pM 5-aza-dC) og 1,41 (1 pM 5-aza-dC) i HCT116-celler, 1,23 (0,5 uM 5-aza-dC) og 1,42 (1 pM 5-aza-dC) i SW480 celler, 1,23 (0,5 uM 5-aza-dC) og 1,28 (1 pM 5-aza-dC) i Colo320 celler, og 1.14 (0,5 uM 5-aza-dC) og 1,31 (1 pM 5-aza-dC) i RKO-celler (Figur 1B-E). Vore data antydede, at en lavere dosis af 5-aza-dC kunne radiosensitize colorektale cancerceller. Fordi en pM 5-aza-dC eller 10 Gy IR er cytotoksiske, relativt lave doser af 5-aza-dC (0,5 uM) og IR (2 Gy og 5 Gy), blev valgt til yderligere undersøgelser for at undersøge virkningerne af at kombinere en DNMT inhibitor, 5-aza-dC og IR.

kombinationen af ​​5-aza-dC og IR-induceret vækst undertrykkelse i kolon kræftceller

Vi analyserede celleproliferation i HCT116 celler behandlet med 5 aza-dC eller IR alene eller med kombinationen af ​​5-aza-dC og IR. Kurverne vækst viste, at behandling med en kombination af 5-aza-dC og IR (2 Gy og 5 Gy) medførte statistisk signifikant vækstinhibering i HCT116 og SW480-celler ved hvert tidspunkt undersøgt (24, 48, 72, og 96 h ) sammenlignes med den i kontrolceller, i celler kun behandlet med 5-aza-dC, eller i celler behandlet kun med IR (2 Gy og 5 Gy) (figur 2A;

P

0,05). Desuden har vi udført MTT-analysen i både HCT116 og SW480 celler, der var blevet behandlet med eller uden 5-aza-dC (0,5 uM) og derefter bestrålet dem med 2, 5 og 10 Gy, hhv. Absorbansen fra assayet udført på celler behandlet med en kombination af 5-aza-dC og IR var signifikant lavere (

P

0,05) end fra celler behandlet med 5-aza-dC eller IR alene ( Figur 2B). Vi udførte også vækstkurve analyse og MTT-assayet i DKO-celler, som også viste et fald på væksthæmning samt proliferation, afhængigt af dosis stråling (figur 2A og B). Således indikerer disse resultater, at virkningerne af 5-aza-dC og IR på væksthæmning er additiv. Baseret på vores

in vitro

data for betydelig vækst hæmning i celler behandlet med kombinationen af ​​5-aza-dC og IR, vi var interesserede i at afgøre, om disse virkninger kunne observeres

in vivo

. Til dette formål blev HCT116 celler eksponeret for 5-aza-dC (0,5 uM) i 72 timer før eksponering for IR (2 Gy og 5 Gy), og derefter blev subkutant injiceret i SCID-mus. Figur 2C viste forsinket betydeligt tumorvækst med kombinationsbehandlingen af ​​5-aza-dC og IR (2 Gy og 5 Gy) i forhold til enkelt behandling med enten 5-aza-DC eller IR. Desuden omfanget af xenotransplantater fra celler behandlet med både 5-aza-dC og IR blev reduceret sammenlignet med dem fra celler behandlet med enten 5-aza-dC eller IR alene.

(A) Cellevækst kurver opnået ved hjælp af 0,5 uM 5-aza-dC og to forskellige strålingsdoser (2 Gy og 5 Gy) i colon cancerceller (HCT116, DKO og SW480) og (B) MTT-analyser i tyktarmskræft celler behandlet med 5-aza-dC (0,5 uM) og /eller bestråling (2 Gy og 5 Gy). Data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse af tredobbelte eksperimenter. (C) Tumorvækst følgende 5-aza-dC (0,5 uM) behandling og /eller bestråling (2 Gy og 5 Gy) i SCID-mus. HCT116-celler (5 x 10

6 celler), som var blevet behandlet med 5-aza-dC (0,5 uM) og bestrålet (2 Gy og 5 Gy) injiceret subkutant i SCID mus (n = 4), og den gennemsnitlige tumorstørrelse blev målt en gang om ugen i 7 uger.

P

-værdier blev beregnet ved hjælp af Students

t

-test. *

P

0,05; **

P

. 0,01

For at belyse de mekanismer væksthæmning med 5-aza-dC, IR, og kombinationen behandling, vi brugte flowcytometri analyse for at fastslå hvorvidt vækstinhibering var forbundet med cellecyklus ændringer. Cellecyklusfordeling analyse viste, at andelen af ​​behandlede celler i G1, S og G2-M-faser ikke var forskellig fra kontrolcellerne, bortset fra at der var en stigning i andelen af ​​celler i sub-G1-fasen, tyder på en stigning i apoptose (figur 3). Andelen af ​​HCT116 celler behandlet med 5-aza-dC eller IR (2 Gy) alene i sub-G1 fasen af ​​celler var otte gange (5-aza-dC), to gange (IR, 2 Gy), og fire gange (5 Gy) større end den for kontrolceller og over otte gange større i celler behandlet med 5-aza-dC og IR end i kontrolceller. Interessant, i modsætning HCT116 celler, viste SW480 celler G2 /M anholdelse efter IR alene (2 Gy og 5 Gy) sammenlignet med kontroller [2-Gy G2 /M fraktionen: 46,77% (vs. 28,03% i kontrol- celler); 5 Gy G2 /M fraktionen: 58,88% (vs. 22,03% i kontrol celler)]. Men den sub-G1 fasen af ​​celler behandlet med 5-aza-dC eller IR (2 Gy) alene var seks gange (5-aza-dC), to gange (2 Gy), og syv gange (5 Gy) er større end kontrolceller og en over 19 gange forøgelse i celler behandlet med 5-aza-dC og IR end i kontrolceller. Vi bekræftede også, at sub-G1 fasen af ​​celler bestrålet med 2 Gy eller 5 Gy sammenlignet med kontrol- celler blev øget i DKO celler. Derfor konkluderer vi, at de væksthæmmende effekter af 5-aza-DC eller IR skyldes en stigning i apoptose.

Kolon kræftceller (HCT116, DKO og SW480) behandlet med 5-aza-dC (0,5 uM) og /eller bestråling (2 Gy og 5 Gy) blev farvet med propidiumiodid og analyseret ved anvendelse af en FACS flowcytometer. Søjler viser andelen af ​​celler i hver celle cyklus fase. Sort søjle, sub-G1 fasen; lyse grå søjle, G1-fasen; mørkegrå søjle, S-fase; hvid søjle, G2-M-fasen.

Kombinationen af ​​5-aza-dC og IR bidrager til induktion af apoptose i kolon kræftceller

For at tydeliggøre induktion af apoptose ved 5-aza-dC kombineret med IR i HCT116 og SW480 celler blev celler dobbelt farvet med fluoresceinisothiocyanat-mærket annexin V og PI. Niveauet af apoptose induceret af 5-aza-dC kombineret med IR var større end ved IR (1,7 gange i 2 Gy eller 1,8 gange i 5 Gy) eller 5-aza-dC alene ( 2,4 gange) i HCT116 celler. Interessant, observerede vi lignende resultater i forhøjede apoptose niveauer induceret af kombinationsbehandling med 5-aza-dC og IR sammenlignet med IR (3,4 gange i 2 Gy eller 2,4 gange for 5 Gy), eller 5-aza-dC ( 1,5 gange) alene i SW480-celler (figur 4A). Endvidere undersøgte vi de cellulære mekanismer bag de apoptotiske virkninger af kombinationen af ​​5-aza-dC og IR. En af de mest almindelige signalleringskaskader involveret i apoptose er aktiveringen af ​​den meget apoptose specifik familie af caspaser, som, når aktiverede, initiere celledød ved spaltning og aktivering effektor-caspaser køre apoptose [17]. For at bestemme om caspaser medierede effekten af ​​5-aza-dC og IR, målt vi aktiviteterne af caspaser 3 og 7, som er centrale effektorer for apoptose i mammale celler [18]. I begge celleekstrakter behandlet med 5-aza-dC og IR, enten alene eller i kombination, blev aktiviteterne af caspaser 3 og 7 i høj grad øget i celler behandlet med 5-aza-dC og IR (2 Gy og 5 Gy) sammenlignet med dem i celler behandlet med IR eller 5-aza-dC alene (figur 4B). Disse resultater stemmer overens med forøget i apoptose forårsaget af kombinationsbehandlingen af ​​5-aza-dC og IR og er vist i figur 4A. I begge analyser blev DKO-celler også vist at øge niveauet for apoptose ved IR. Disse resultater er stærkt understøttet af længere komet haler observeret i kometen assay, hvilket indikerer større mængde af cellulært DNA-skader i celler behandlet med en kombination af 5-aza-dC og IR sammenlignet med kontrol- celler eller celler behandlet med 5-aza-dC eller IR alene (figur 4C og D).

(a) niveauerne af apoptose blev målt under anvendelse annexin V og 7-amino-actinomycin og analyseret under anvendelse af en FACS flowcytometer. Niveauerne af apoptose i HCT116, DKO og SW480 celler behandlet med 5-aza-dC (0,5 uM) og /eller bestråling (2 Gy og 5 Gy), blev udtrykt i procent af den samlede cellepopulation på både de tidlige og sene stadier af apoptose. (B) aktiviteter caspaser 3 og 7 blev bestemt ved hjælp af Caspase-Glo assay og var repræsenteret i procent af HCT116, DKO og SW480 celler behandlet med 5-aza-dC (0,5 uM) og /eller bestråling (2 Gy og 5 Gy) sammenlignet med ubehandlede celler. Grafen repræsenterer data (middelværdi ± standardafvigelse) fra tre uafhængige forsøg. (C) Repræsentative mikrografier af fluorescerende DNA-farve ved hjælp af comet assay. DNA-fragmentering af kometen assay i HCT116, SW480 og DKO celler behandlet med 0,5 pM 5-aza-dC og /eller bestråling (2 Gy og 5 Gy). (D) Kvantificering af DNA beskadigede celler repræsenterer middelværdien af ​​tre tilfældige mikroskopiske felter per prøve, og fejlsøjlerne repræsenterer ± standardafvigelser. NS angiver ikke signifikant.

P

-værdier blev beregnet ved hjælp af Students

t

-test. *

P

0,05; **

P

. 0,01

Caspaser 3 og 9 er også kendt for at være involveret i stråling-induceret apoptose [19]. , Brugte således vi western blotting for at bekræfte aktivering niveauer af caspaser 3 og 9 i celler behandlet med 5-aza-dC og /eller IR. Figur 5 viser højere niveauer af aktiverede caspaser 3 og 9 i HCT116, DKO og SW480 celler behandlet med 5-aza-DC eller IR alene sammenlignet med dem i kontrol celler. Interessant, western blotting, i tre, testede tyktarmskræft cellelinjer, vist, at proteinniveauer af caspaser 3 og 9 også blev forøget i celler behandlet med en kombination af 5-aza-dC og IR sammenlignet med celler behandlet med enten middel alene eller kontrolbestemmelserne celler. Niveauet af spaltede PARP1, som er en anden vigtig effektor af apoptose induktion [20], [21], blev også øget i celler behandlet med 5-aza-DC eller IR alene sammenlignet med kontrol- celler, og endnu mere forøget i celler behandlet med en kombination af 5-aza-dC og IR. Derimod blev protein ekspressionsniveauerne af survivin faldt i celler behandlet med 5-aza-dC og IR alene og i kombination sammenlignet med dem i kontrolceller. Desuden testede vi niveauet af p53 samt. Interessant p53 ekspressionsniveauet steg i celler behandlet med en kombination af 5-aza-dC og IR end i celler behandlet med 5-aza-dC alene. Disse data er enighed med tidligere rapport, som er celler, der udtrykker vildtype af p53 er bedre følsomme IR end mutant type p53 [14]. Disse protein ekspressionsmønstre blev bekræftet i bestrålede DKO-celler. Tilsammen vore data tyder på, at kombinationen af ​​5-aza-dC og IR synergistisk inducerer et højere niveau af apoptose sammenlignet med enkelt behandling ved anvendelse af 5-aza-dC eller IR i flere colon cancerceller.

Western blot analyse for ekspression af apoptose-associerede proteiner (spaltet caspase 3, spaltet caspase 9, spaltet PARP1, survivin, og p53) i HCT116 og SW480-celler behandlet med 5-aza-dC (0,5 uM) og /eller bestråling (2 Gy og 5 Gy), såvel som i bestrålede DKO celler, ved hjælp af kløvet caspase 3, kløvet caspase 9, kløvet PARP1, survivin, og p53-antistoffer.

diskussion

resultater IR eksponering i den samtidige aktivering eller nedregulering af multiple signalveje, der spiller kritiske roller i celletype-specifik kontrol af overlevelse eller død. IR er et velkendt genotoksisk middel og kræftfremkaldende for mennesker, der inducerer cellulære skader gennem direkte og indirekte mekanismer [22]. For nylig har mange undersøgelser fokuseret på molekylerne og processer, der påvirker responset af celler til IR. Mange forskellige typer af molekyler er kendt for at øge radiosensitivitet ved at påvirke cellecykluskontrolpunkter, DNA-reparation, gentranskription og apoptose. De seneste undersøgelser har antydet, at epigenetiske mekanismer såsom histon modifikation og DNA-methylering er forbundet med gendæmpning og kan være involveret i regulering radiosensitivitet i cancerceller. Et antal tidligere undersøgelser har rapporteret, at adskillige histondeacetylaseinhibitorer er cytotoksiske og kan sensibilisere tumorceller til strålebehandling. Men sparsomme oplysninger om virkningerne af DNMT inhibitorer på strålingssensibilisering [13], [23]. Desuden har 5-aza-dC blevet påvist at have lidt aktivitet i solide tumorer som enkeltstof [24], [25], og lidt er kendt om de molekylære eller cellulære mekanismer bag den radiosensitivitet fremkaldt af epigenetiske hæmmere. Kombinere epigenetiske lægemidler med strålebehandling er særligt interessant i denne sammenhæng, og har vist forbedret effektivitet både

in vitro

in vivo

i flere solide tumorer [13] – [15], [26 ]. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi de cellulære virkninger af DNMT inhibitor, 5-aza-dC, og IR, både alene og i kombination, på colon cancerceller. Vi fandt, at 5-aza-dC demonstrerede additive virkninger på væksthæmning kombineret med IR, tyder på, at 5-aza-dC kunne være en nyttig stråling sensibilisator i tyktarmskræft behandling. En ting, som vi er nødt til at overveje yderligere baseret på vores resultater, DKO celler, genetiske model system til hæmning af DNA methyltransferase, synes ikke at have mere stærk vækst undertrykkende effekt med IR end at bruge farmakologisk model system, som vi behandlede 5-aza-dC med IR.

da vores resultater indikerer, at denne effekt er medieret af induktion af apoptose, apoptose tidligere er blevet betragtet som en potentiel mekanisme til radiosensibilisering. Flere forskellige resultater er blevet rapporteret vedrørende strålingssensibiliserende virkninger af DNMT inhibitorer. Tilbede et al. tidligere rapporteret, at kombinationen af ​​IR og zebularin ikke øge apoptose [13]. Derimod Qiu et al. viste, at 5-aza-dC induceret strålingssensibilisering i visse mavekræft cellelinjer og forårsagede en stigning i apoptose, som blev ledsaget af øget ekspression af

p53

,

RASSF1

, og

DAPK Salg genfamilier [14]. I vores undersøgelse, 5-aza-dC øget niveau af apoptose i HCT116 og SW480 celler, en konstatering, der var i overensstemmelse med resultater fra Qiu et al. Meget interessant, Qiu et al. også foreslået, at gastrisk cancer cellelinjer, der udtrykker vildtype-p53 er mere følsomme over for kombinationsbehandlingen med IR og 5-aza-dC sammenlignet med dem, der udtrykker mutant p53. Den HCT116 cellelinie anvendt i denne undersøgelse udtrykker vildtype-p53, og vi observeret, at p53 niveauet øges som reaktion på 5-aza-dC behandling både med og uden IR. Desuden p53 ekspressionsniveauet steg i celler behandlet med en kombination af 5-aza-dC og IR end i celler behandlet med 5-aza-dC alene. Men i modsætning til i HCT116-celler, blev ingen effekt vist på p53 niveauet i SW480-celler, som udtrykker mutant-p53 (figur 5). p53 er blevet klassisk beskrevet som en mediator for IR cytotoksicitet og handlinger ved at fremme enten cellecyklusstop eller apoptose [27], [28]. Tidligere undersøgelser har rapporteret, at 5-aza-dC inducerer p53-ekspression, som er associeret med inhibering af celleproliferation i vildtype p53-celler, men ikke i mutant p53 celler i prostatacancer [29], [30]. Men fordi kun få cellelinjer og p53-associerede molekyler blev undersøgt i disse studier, yderligere forskning i den mulige sammenslutning af 5-aza-dC med p53 er nødvendig. Yderligere undersøgelser er også forpligtet til at identificere yderligere epigenetiske ændringer forbundet med radiosensitivitet. Der er begrænsede undersøgelser rolle DNA methylering i resistens over for IR. En tidligere undersøgelse viste, at behandling med 5-aza-dC forårsager global hypometylering, som har en strålingssensibiliserende effekt [23]. Derfor bør gennemføres endelige undersøgelser for at afgøre, om IR har en effekt på site-eller gen-specifikke DNA-methylering i cancer (manuskript under udarbejdelse).

I denne undersøgelse cellecyklus analyse blev ikke ændret signifikant ved en enkelt