PLoS ONE: Phellinus linteus Uddrag sensibiliserer fremskreden prostatacancer celler til apoptose i athymiske Nude Mice

Abstrakt

Phellinus linteus (PL) champignon besidder anti-tumor ejendom. Vi har tidligere rapporteret, at behandlingen med PL forårsagede dyrkede humane prostatacancerceller til at undergå apoptose. For yderligere at undersøge mekanismerne i PL-medieret apoptose, udførte vi xenotransplantat assay sammen med

in vitro

assays for at vurdere virkningen af ​​PL om tilblivelse og progression af tumorerne dannet ud fra podning af prostatacancer PC3 eller DU145 celler. Efter podning blev nøgne mus injiceret med PL hver anden dag i 12 dage. Selvom PL behandling ikke forhindre dannelsen af ​​de podede tumorer, blev væksten af ​​tumorer efter PL behandling dramatisk svækket. Vi derefter testet effekten af ​​PL på tumorerne 12 dage efter inokulering. Efter inokulerede tumorer nået en vis størrelse, blev PL administreres til musene ved subkutan injektion. Den histokemi eller immunkemi analyse viste, at apoptose forekom med aktiveringen af ​​caspase 3 i tumorerne dannet ved podning af prostatacancer DU145 eller PC3-celler. Dataene var i en god aftale med, at der fra dyrkede celler. Således er vores in vivo undersøgelse antyder, at PL ikke kun er i stand til at dæmpe tumorvækst, men også til at forårsage tumorregression ved at inducere apoptose

Henvisning:. Tsuji T, Du W, Nishioka T, Chen L, Yamamoto D Chen CY (2010) Phellinus linteus Extract sensibiliserer fremskreden prostatacancer celler til apoptose i Athymiske nøgne mus. PLoS ONE 5 (3): e9885. doi: 10,1371 /journal.pone.0009885

Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada

Modtaget: 3. december 2009 er; Accepteret: 11 Februar 2010; Udgivet: Marts 31, 2010

Copyright: © 2010 Tsuji et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er støttet af midler fra JCRT Foundation til CYC. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser findes

Introduktion

Prostatakræft er en ødelagt sygdom hos mænd. Selv behandlinger (såsom kirurgi eller androgen ablation) har forbedret overlevelsesfrekvensen af ​​patienterne, manglende succes med hormon-refraktær prostatacancer tilbage. De avancerede tumorer er ofte resistente over for kemoterapeutiske lægemidler. Selvom mekanismerne for modstanden er uklare, har det blevet postuleret, at udviklingen af ​​tumorer, såsom prostatacancer, er relateret til akkumulering af genetiske eller epigenetiske ændringer. I asiatiske, PL er en af ​​veletablerede medicinske svampe, der har brugt til at behandle forskellige menneskelige maligniteter. Undersøgelser viste, at den vandopløselige del af PL er biologisk aktiv, som sandsynligvis er polysaccharid [1] – [3]. Det har også vist sig, at PL er i stand til at undertrykke tumorer

in vitro

enten indirekte ved at øge værtens immunsystem, eller direkte ved at inducere apoptose i tumorceller [4] – [6]. Vi har for nylig rapporteret, at PL er bemærkelsesværdigt effektiv til inhibering af væksten af ​​forskellige prostatakræft-cellelinier uden toksiske virkninger på normale prostata epitelceller [7]. Da PL besidder de anti-tumor, anti-angiogene og immunmodulerende egenskaber, har det trukket store interesser i Asien for at udvikle det for anticancer-midler. For at udvikle dette lægemiddel svamp som anti-prostatacancer middel, er en bedre forståelse af de underliggende molekylære mekanismer i PL funktioner kræves.

En potentiel af et lægemiddel til at fremkalde apoptose har været meget anvendt som en strategi for udvikle ny kræftbehandling. Det er kendt, at apoptose kan udløses af en række interne eller eksterne signaler. Caspaser, et stærkt konserveret familie af cysteinproteaser, er centrale apoptotiske effektorer i celler og spille kritiske roller i reguleringen af ​​apoptose gennem en kæde spaltning reaktion [8], [9]. eksisterer caspaser som pro-enzymer i cytosolen af ​​celler og aktiveres gennem proteolyse. Ved celledød stimulationer, caspase 8, som initiator, udløser aktivering af downstream effektor-caspaser 3 og 7, resulterer i BID spaltning og cytochrom c-frigivelse [10] – [12]. Frigivelse af cytochrom c fra mitochondrierne til cytosolen forårsager dannelsen af ​​den apoptosome, som igen udløser iboende apoptotiske maskineri. PL har vist sig at forårsage prostatacancerceller at undergå apoptose ved at udløse caspasekaskaden [6], [7]. Endvidere lave doser af doxorubicin (et anticancerlægemiddel) sammen med lave koncentrationer af PL, have en synergistisk virkning på induktionen af ​​apoptose i humane prostatacancerceller [13].

Vi har tidligere rapporteret at PL er i stand til at sensibilisere dyrkede prostatacancerceller til apoptose, hvor caspaser blev aktiveret [7]. Vores nuværende undersøgelse, som en fortsættelse af den undersøgelse af anti-tumor egenskab PL, yderligere demonstreret evne PL til at inducere apoptose i tumorerne ved podning prostatakræft DU145 eller PC3 celler i nøgne mus. Vi viste, at injektion af PL dramatisk svækket tilblivelsen af ​​tumorerne i nøgne mus efter inokulering. Vores undersøgelse viste også, at efter PL injektion, de dannede tumorer ved podning DU145 eller PC3 celler i nøgne mus undergik en regression, ved at udløse en apoptotiske processer.

Metoder

Celler og reagenser

Phellinus linteus

pulver blev købt fra Panbio-Tech (Taejon, Sydkorea) og opløst i vand. Efter kogt i 5 minutter, blev PL opløsning centrifugeret og supernatanten blev opsamlet til undersøgelsen. DMEM (Dulbeccos modificerede Eagles medium); antibiotika (penicillin og streptomycin) og trypsin-EDTA blev indkøbt fra Invitrogen. Humane prostatacancer PC3-celler (American Type Culture Collection) blev dyrket i DMEM medium suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt kalveserum, 2 mM L-glutamin, 100 forener /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin.

xenotransplantat Assay

Male nøgne mus (NCRNU-mM, CrTac: Ncr-Foxn1nu) (Taconic) ved alderen 4-6 uger blev brugt. Human prostatacancer PC3-celler (5 x 106) i 100 pi PBS blev inokuleret i højre flanke område på hver mus. Tre mus blev tjente som en positiv kontrol. Til inhibering af tumordannelse, blev 6 mus behandlet med PL (30 mg /kg i 100 pi PBS) lige efter inokulering og derefter administreres den samme mængde PL hver 2 dage. Yderligere 3 mus blev behandlet med samme mængde kontrol Hitachi champignon opløsning efter samme tidsforløb som anvendt til PL. Størrelserne af tumorerne blev målt hver 4. dag med en passer og beregnet efter Tamayko formel [14]. Til overvågning af tumorregression, efter de implanterede tumorer nået omkring 1,0 cm i diameter, blev musene behandlet med enten PL (30 mg /kg) eller den samme mængde af kontrol champignon opløsning hver 2 dage. Ti dage senere blev musene aflivet, og tumorerne blev isoleret for histopatologi eller histokemi analyse.

Histopatologi eller immunhistokemi analyser

Isolerede tumorer blev fikseret i 4% phosphatbufret neutralt paraformaldehyd-opløsning (pH 7,4). De histologiske prøver blev sektioneret og farvet med hematoxylin /eosin (H 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

PL dæmper DU145 eller PC3 celler til at danne tumorer i nøgne mus

Undersøgelser har antydet, at PL har en anti-tumor ejendom [1], [6], [7]. Vi viste, at PL ikke kun er i stand til at initiere apoptose i forskellige maligne prostatakræft-cellelinier, men inducerer G

1 anholdelse i normale prostata epitelceller [6], [7], [13]. For yderligere at teste anti-tumor effekt af PL blev xenotransplantat assay anvendes. Efter podede humane prostatacancer PC3-celler i nøgne mus subkutant, blev PL samtidigt injiceret i musene. Derefter blev den samme mængde PL injiceret i mus hver anden dag. Tolv dage senere blev billeder af de mus, der bærer tumorer taget (fig. 1A, øvre panel) og objektglassene monteret med tumorvæv blev farvet med HE (fig. 1B, nedre panel). Tumorerne i PL-behandlede mus var meget mindre end i kontrolmusene, og viste en tydelig mønster af HE-farvning.

A. DU145 eller PC3-celler blev inokuleret subkutant i nøgne mus. Tolv dage senere blev billeder af mus med de podede tumorer taget (øverste panel). Tumorerne blev isoleret fra PL behandlede mus eller kontrolmus. Objektglassene monteret med tumorvæv blev fremstillet og farvet med HE farvestof (nederste panel). B og C. En gruppe på 6 mus blev injiceret med PL (30 mg /kg) i vand fra dag 0 og efterfølgende administreres hver 2 dage. En anden gruppe på 3 var som kontrollerne. En uge senere, når den podede tumor begyndte at dannes, blev størrelserne af tumorerne målt hver 4. dag.

Vi målte også diametrene af de inokulerede tumorer, en uge senere efter inokuleringen, når alle mus begyndte at vise tegn på dannelsen af ​​faste tumormasser. Målingerne blev taget hver fjerde dag i 12 dage (fig. 1B og C). På dag 12 er kontrol tumor messer fra podning af to cellelinjer var om mere end 2 folder større end dem behandlet af PL. For at udelukke muligheden for toksicitet afsagt af PL, vægten (fig. 2A) og vandforbrug (Fig. 2B) af musene blev målt og sammenlignet. PL-behandlede mus havde en lignende vægt eller vandforbrug som kontrollerne, hvilket tyder på, at PL ikke havde en bivirkning på behandlede eller ubehandlede mus. For yderligere at fastslå, om PL behandling havde nogen toksiske virkninger på musene blev leverne også isoleret ud fra dyrene. Den histokemi farvning med HE farvestof viste, at strukturerne af leveren fra PL-behandlede mus var tilsvarende som det, der er isoleret fra kontrolmusene (data ikke vist). Begge lever optrådte raske uden tegn på degeneration, fibrose, apoptose eller nekrose. In vivo undersøgelse antyder, at PL er i stand til at dæmpe hastigheden af ​​væksten af ​​de inokulerede tumorer i nøgne mus.

A og B. Efter tumorknuder blev dannet, legemsvægten (A) og vandforbrug (B) på hver mus med eller uden behandling med PL blev målt. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen 3-6 mus.

PL behandling forårsager væksten regression i tumorerne inokuleret ad prostatacancerceller

Vi derefter afprøvet virkningen af ​​PL på eksisterende tumorer. Når de inokulerede tumorerne nåede til størrelsen på 1,0 cm i diameter, blev PL injiceret i mus hver anden dag for total ti dage. Tumorerne blev isoleret og fremstillet til histopatologisk eller immunohistochemitry analyse. HE-farvning viste, at tumorerne isoleret fra PL- eller kontrol muse var godt afgrænset med bindevæv (Fig. 3A). Celledød synes at forekomme i PL-behandlede tumorer fra podning af to forskellige prostatacancer cellelinier med mange ufarvede vakuoler, som var til stede i kontrolgrupperne tumorer. For yderligere at fastslå, om apoptose forekommer i PL-behandlede tumorer blev immunhistokemi-analyse under anvendelse TNUEL farvning (til påvisning af DNA-strengbrud) udført (fig. 3B). Dias fra PL-behandlede tumorer var stærkt farvet med TUNEL-farvning, men kun få TUNEL farvning positive celler blev påvist i kontrol- tumorer. De procentdele af cellerne farvet TUNEL positivt blev målt i kontrollen og PL-behandlede tumorer (data ikke vist). Mere end 30% af cellerne i PL-behandlede tumor havde brudt DNA-streng og meget lille procent af celler fra kontrol- tumorer (ca. 5%) farves positivt. Den immunhistokemi farvning ved anvendelse af anti-caspase 3-antistof blev også udført for at detektere ekspressionen af ​​caspase 3 (fig. 3C). Store antal cellerne i PL-behandlede tumor dannet ved podning af PC3-celler blev omsat med antistoffet. Til sammenligning kun nogle få celler i kontrol tumor udtrykte et højt niveau af caspase 3. Lignende resultater blev opnået fra tumorerne dannet ved podning af DU145 celler (data ikke vist). Således indikerer resultaterne, at celledød indtraf i PL-behandlede tumor er gennem apoptose.

A. Tumorerne blev fremstillet til hematoxylin og eosin-farvning. B og C. Objektglassene monteret med tumorvæv blev farvet med TUNEL middel (B) eller anti-caspase 3-antistof (C).

For yderligere at teste evnen af ​​PL til at inducere apoptose, DU145 og PC3-celler blev behandlet med PL ved 1 mg /ml eller 2 mg /ml i 48 timer. Annexin V-analyse blev udført (fig. 4). Efter at være blevet behandlet med PL, ca. 15% af PL-behandlede celler undergik apoptose, på en dosis-afhængig måde. En baseline farvning af Annexin V blev set i kontrol tumorer. Interessant, PC3-celler var mere følsomme over for PL end DU145 celler. Samlet,

in vitro

data er i overensstemmelse med det opnået fra dyreforsøg.

Cellerne blev behandlet med 1 mg /ml eller 2 mg /ml i 48 timer, og efterfølgende farvet med annexin V. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelsen fra 3 uafhængige forsøg.

diskussion

Tidligere vi demonstreret, at PL inducerer dyrkede prostata kræftceller til at undergå apoptose [7], [13 ]. Her, ved hjælp xenotransplantat assay, viste vi, at PL er stand til at fremkalde en apoptotisk respons

in vivo

at blokere væksten af ​​tumorerne dannet ved podning af human prostatacancer DU145 eller PC3-celler. Den histokemi farvning analyse viste, at størstedelen af ​​cellerne i tumorerne isoleret fra PL-behandlede mus er apoptotiske, manifesteret ved positivt farvet med TUNEL og omsættes med et anti-caspase 3-antistof. Forekomsten af ​​apoptose blev også demonstreret i dyrkede DU145 eller PC3 celler efter behandling med PL i 48 på en dosisafhængig måde. Således er vores studie, at bruge

in vivo

samt

in vitro

analyser, inidcates at PL behandling initierer caspasekaskaden at inducere apoptose i prostatacancerceller, som giver et stærkt bevis for potentialet i PL som et anti-prostatacancer middel.

Det er kendt, at PL er ikke-toksisk i almindelighed [1]. Vi har tidligere rapporteret, at PL, ved høje doser, inducerer kontrol lungeepitelceller at standse i G

1 fase af cellecyklussen ved at blokere ekspressionen af ​​cyclin D

1 og dets interaktion med cellecyklus-afhængige kinaser 4 og 6 [6]. I vores nuværende undersøgelse, data fra histopatologisk analyse viser, at injektion af PL i nøgne mus podet med enten DU145 eller PC3 prostatacancerceller har nogen toksisk virkning på musene, manifesteret ved, at behandlingen ikke spiller nogen rolle i væksten eller vandforbrug af musene. Vigtigt er det, leveren prøver fra de behandlede mus er normale uden degeneration eller fibrose. Det er muligt, at, ligesom

in vitro

eksperimenter, behandling med PL fremkalder celle checkpoint styrer i normale væv eller organer, hvilket ikke er skadeligt for mus. I de podede tumorer, vises den samme behandling for at være meget cytotoksisk.

Programmeret celledød er vigtig maskiner for at udelukke unormale eller kræftceller. Aktivering af caspase familiemedlemmer er kernen af ​​apoptose, der repræsenterer en skæringspunktet mellem forskellige apoptotiske veje i forskellige typer af cancerceller, herunder prostata kræftceller. TNF eller Fas /CD95 receptorer, mitokondrielle proteiner (såsom cytochrom c) og granzym kan inducere celledød ved aktivering af caspasekaskaden [8], [9]. Skade på eller stress i ER eller Golgi er vist at være i stand til at udløse apoptose [15], [16]. Undersøgelser har vist, at det udfoldede protein respons eller mangel på calcium er ansvarlig for ER apoptose [15]. ER stress har vist sig at forårsage translokation af visse caspaser til ER eller Golgi og udførelsen af ​​apoptose der. Calcium frigøres fra ER i tider med ATP-mangel er et vigtigt element i apoptose induceret af iskæmi-reperfusionsskade. Vi har vist, at PL behandling udløser caspaseaktivering i dyrkede prostatacancerceller [7], [13]. Vores

in vivo

undersøgelse viser, at PL behandling er også i stand til at initiere apoptose via aktivering caspase 3, som er effektoren i caspase kædereaktion. Undersøgelsen af, om andre caspaser er involveret i induktion af apoptose

in vivo

er på vej.

PL er en af ​​veletablerede medicinske svampe, der er blevet taget oralt som en fælles sundheds- fremme kosttilskud eller en adjuvans til behandling af maligniteter i Asien i mange årtier. Udvindingen fra vandopløselige PL fraktionen viser en relativt homogen molekylvægtsfordeling på gel permeation HPLC og anslås at være omkring 150-180 kD fra retentionstiden på HPLC pullulan molekylære markører [1]. De vigtigste komponenter i PL er blevet foreslået at være forskellige polysaccharider [1] – [3]. Det har også vist sig, at den vandopløselige del af PL er i stand til at undertrykke tumorer, enten indirekte ved at øge værtens immunsystem, eller direkte ved at inducere apoptose i tumorceller [4], [5]. Det er dog stadig uklart, hvilke sammensætninger af polysaccharid i PL besidder anti-cancer effekt.

Sammenfattende vellykket brug af PL til behandling af prostatacancer kræver fuldt forståelse af mekanismerne for, hvordan PL formidler anti- tumoraktivitet i tumorer. Vores tidligere undersøgelse viste, at PL, gennem aktivering af caspaser, er i stand til at inducere apoptose i dyrkede cancerceller. I denne undersøgelse, hjælp xenograft assay, vi viser yderligere, at injektion af PL i nøgne mus med dannede subkutane tumorer ved podede med prostatakræft DU145 eller PC3 celler inducerer størstedelen af ​​podede tumorceller til at miste deres levedygtighed. Således er vores

in vivo

data understøtter opfattelsen af, at PL, ved at skifte på en tumor undertrykkelse-relaterede maskiner, kan udvikles som en effektiv terapi til behandling af humane maligniteter, såsom prostatacancer.

tak

Vi takker Dr. Hu (Harvard Medical School, MA) for at levere reagenser til projektet.