PLoS ONE: glyoxalase-I er en roman Prognose Factor associeret med mavekræft Progression

Abstrakt

glyoxalase I (GLO1), en methylglyoxal afgiftning enzym, er impliceret i udviklingen af ​​menneskelige maligniteter. Rolle GLO1 i gastrisk cancerudvikling eller progression er endnu uklart. Ekspressionen af ​​GLO1 blev bestemt i primære gastrisk cancer prøver vha kvantitativ polymerasekædereaktion, immunhistokemi (IHC), og western blotting analyser. GLO1 ekspression var højere i gastrisk cancer væv, sammenlignet med i tilstødende noncancerous væv. Forhøjet ekspression af GLO1 var signifikant associeret med mavevæggen invasion, lymfeknudemetastase, og patologisk stadium, hvilket antyder en hidtil ukendt rolle GLO1 i gastrisk cancerudvikling og progression. Det 5-års overlevelsesraten for de lavere GLO1 udtryk grupper var signifikant større end for de højere udtryk grupperne (log rank

P

= 0,0373) i IHC eksperimenter. Over-ekspressionen af ​​GLO1 i gastrisk cancer cellelinjer øger celleproliferation, migration og invasiv. Omvendt nedregulering af GLO1 med shRNA førte til en markant reduktion i migrationen og invasion evner. Vores data tyder på, at høj ekspression af GLO1 i mavekræft øger metastaser evne tumor celler

in vitro

in vivo

, og støtte dens effektivitet som en potentiel markør til påvisning og prognose af mavekræft

Henvisning:. Cheng WL, Tsai MM, Tsai CY, Huang YH, Chen CY, Chi HC, et al. (2012) glyoxalase-I er en roman Prognose Factor associeret med Gastric Cancer Progression. PLoS ONE 7 (3): e34352. doi: 10,1371 /journal.pone.0034352

Redaktør: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: 8. december 2011; Accepteret: 27 februar 2012; Udgivet: Marts 29, 2012 |

Copyright: © 2012 Cheng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Chang-Gung University, Taoyuan, Taiwan (NMRPD 150.311, NMRPD170441-42, CMRPG 640.042-43, CMRPG 670.291-93) og National Science Council for Republikken Kina (NSC 95-2314-B-182 -027, 97-2314-B-182-009-MY2, 99-2314-B-182-022). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er den fjerde mest almindelige form for kræft og den næsthøjeste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [1]. Den malignitet er den sjette hyppigste årsag til kræft dødsfald i Taiwan [2]. Korrekt screening kan lette påvisning af mavekræft før symptom udvikling på en helbredelig fase [3]. Bestemmelse af udtrykket profiler af de vigtigste molekyler i de forskellige involverede veje i mavekræft progression kan støtte i diagnose, prognose og forudsigelse af tumor progression.

Tumor invasion og metastase er vigtige skridt i fastlæggelsen af ​​aggressive fænotype af humane kræftformer og udgør de væsentligste årsager til kræft-relaterede dødsfald [4]. Høj ekspression af migrationsrelaterede faktorer, såsom cyclooxygenase 2 (COX-2) [5], vaskulær endothelial vækstfaktor (VEGF) [6], CXC kemokin-ligand (CXCL) -8 [7], kemokin (CXC-motivet) receptor (CXCR) -2, og CXCL-1 [8], er forbundet med mavekræft progression. Flere potentielle onkogene pathways (proliferation /stamcelle, NF-KB, og Wnt /β-catenin) er dereguleret i størstedelen af ​​gastriske cancere [9]. Således vil yderligere belysning af de nøjagtige molekylære begivenheder, der førte til mavekræft progression og identifikation af værdifulde diagnostiske eller prognostiske markører og nye terapeutiske strategier være af væsentlig klinisk værdi.

glyoxalase I (også kaldet GLO1) er et væsentligt element i veje, der fører til afgiftning af Methylglyoxal (MG), en af ​​side produkter af glykolysen [10], [11], [12]. GLO1 ekspression er forøget i adskillige humane cancere i colon, bryst, prostata, og melanom [13], [14], [15], [16], [17]. Nylige undersøgelser har rapporteret, at overekspression af GLO1 er associeret med cancer progression og medikamentresistens [17]. Fra vores tidligere data blev GLO1 opregulering observeret i gastrisk cancer prøver anvendelse af cDNA microarray [18]. Men den særlige rolle, GLO1 under gastrisk tumorigenese og dens kliniske betydning tilbage, der skal etableres.

Vores eksperimenter viser klart, at GLO1 er ofte over-udtrykt i mavekræft og associeret med cancer metastaser. Især udtryk for GLO1 er betydeligt højere i fremskredne stadier af mavekræft. Desuden ombygninger udtryk for GLO1 i gastrisk cancer cellelinjer påvirker celle migration og invasion evner.

Materialer og metoder

Etik Statement

Undersøgelsen protokollen blev godkendt af Medical Etik og menneskelige Clinical Trial Komité Chang Gung Memorial Hospital (IRB NO. 95-0472B). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter

Emner

De 114 patienter (64 mænd og 50 kvinder, median alder, 66 år; range 28-86 år). Diagnosticeret med mavekræft på Chang Gung Memorial Hospital 2000-2005 blev indrulleret i denne undersøgelse. Alle patienter fik opereret for primær mavekræft uden forudgående kemoterapi eller strålebehandling. Hver patient blev udsat for gastrisk resektion (35 patienter gennemgik total gastrektomi og 79 delvis gastrektomi).

klinisk-patologisk undersøgelser

resektion prøver blev undersøgt patologisk bruger kriterierne i den japanske Generelle regler for Gastric Cancer Study [19], og det fælles udvalg amerikanske on Cancer (AJCC) (pTNM) klassifikationssystem [20]. Klinisk-patologisk parametre omfattede patientens alder og køn, tumor placering og størrelse, brutto (BORRMANN s) tumortype, væg invasion, resektion margin, histologisk type, lymfeknude metastaser, vaskulær invasion, lymfe invasion, og perineurale invasion. Efter udledning, havde alle patienter periodiske opfølgningsbesøg på ambulant afdeling af Chang Gung Memorial Hospital indtil døden eller begyndelsen af ​​udarbejdelsen af ​​denne artikel.

Real-time kvantitativ revers transkription polymerasekædereaktion (QRT-PCR )

QRT-PCR blev udført som beskrevet i en tidligere rapport [21]. Følgende primere blev anvendt: human

GLO1

QRT-PCR (fremadrettet primer, 5′-TGAGGATAAAAATGACATCCCTA- AAGA-3 ‘, og revers primer, 5′-TGTGTCAGCTCAAGTGTAGCTTTC-3′), humane 18S rRNA QRT-PCR (fremadrettet primer, 5’-CGAGCCGCCTGGATACC-3 ‘, og revers primer, 5′-CCTCAGTT CCGAAAACCAACAA-3’).

Produktion af anti-GLO1 antistof

cDNA kodende fuldlængde

GLO1

blev klonet i pGEX-4T1. Lysater fra

E. coli

BL21-stammen blev oprenset med glutathion-agarose-kugler (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Opløselige proteiner blev oprenset ved anvendelse af kromatografi med glutathion-agaroseperler, ifølge producentens instruktioner, emulgeret med adjuvans og anvendt til at immunisere kaniner. Polyklonale antistoffer blev fremstillet og affinitetsrenset som tidligere [22] beskrevne. Specificiteten af ​​in-house GLO1 blev valideret ved hjælp af Western blot analyse (figur S1).

Immunblotanalyse

Hele cellelysater, nukleare ekstrakter, og betingede medier blev fremstillet fra humant væv eller stabil GLO1 knockdown cellelinier. Western blotting blev udført under anvendelse af monoklonale antistoffer mod human HIF-1α (Abcam, San Francisco, CA), p65 (Epitomic, Burlingame, CA), eller p50 (Millipore, Billerica, MA) eller polyklonale antistoffer mod human GLO1 (interne, fortynding, 1:500), CXCL1 (PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ), CXCL8 (R .. D Systems Inc., Minneapolis, MN), VEGF (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californien)

Immunhistokemi (IHC)

formalin-fikseret og paraffin-embedded væv blev undersøgt med IHC ved hjælp af polyklonale antistof mod human GLO1 produceret in-house (fortynding, 1:3000) og avidin-biotin kompleks (ABC ) metode, som beskrevet tidligere [23], [24]. Sammenligninger blev udført mellem intensiteten af ​​farvning af carcinom celler og godartede overfladisk epitel, der var placeret på samme glas. Til semi-kvantitativ analyse af GLO-1 immunreaktivitet blev et Histoscore (H) -scoring anvendte [25]. Kort fortalt er den negative gruppe bestod af cancerceller uden påviselig (-) eller kun spor farvning for GLO-1 (+1). Den positive gruppe bestod af kræftceller med moderate (2) eller høje niveauer (+3) af GLO-1 immunreaktivitet. H-scoring blev beregnet og gennemsnittet af to uafhængige patologer, blindede til den oprindelige score for hver patient. Resultaterne blev scoret ved at gange procentdelen af ​​positive celler (P) af intensiteten (I), ifølge formlen: H = P × jeg. For eksempel kan et afsnit, hvor 10% af vævet havde en farvning score på +1, 60% en score på +2, og 30% en score på +3, H = (10 x 1) + (60 x 2) + (30 × 3) = 220.

Etablering af GLO1 overekspression i SC-M1-cellelinje

SC-M1 cellelinje, der udtrykker lavere GLO1 blev brugt. Transfektion af

GLO1

cDNA blev udført med lipofectamin-reagens (Life Technologies, Grand Island, NY). Efter inkubation i 24 timer blev cellerne overført til medium indeholdende G418 til udvælgelse, og blev derefter brugt i spredning, migration og invasion assays.

Etablering af GLO1 knockdown i TSGH og AGS cellelinjer

To humane gastrisk cancer cellelinjer, AGS, og TSGH, var ansat. De korte hårnål RNA (shRNA) sekvenser rettet mod

GLO1 Salg (TRCN0000118630 ​​og TRCN0000118631) blev købt fra National RNA Interference Core Facility (Institut for Molekylær Biologi, Academia Sinica, Taiwan). Den specifikke undertrykkelse af GLO1 blev bekræftet under anvendelse western blot analyse.

Celleproliferationsassay Salg

Celler (1 x 10

4) blev dyrket på en 6 cm plade ved 37 ° C under 5 % CO

2. Ved hvert tidspunkt, blev væksthastigheden af ​​cellerne bestemt ved celletælling. Resultaterne er givet som fold ændring i forhold til hver enkelt kontrol værdi.

In vitro

assay af migration og invasiv aktivitet

Effekten af ​​GLO1 udtømning eller overekspression på migration og invasive aktivitet af gastrisk kræft cellelinjer blev vurderet ved hjælp af en hurtig

in vitro

assay (Transwell teknik), som tidligere beskrevet [26].

RNA forberedelse og microarray analyse

GLO1-lyddæmpet klon TSGH (KG2) og kontrol-celleklon (C1) blev kortvarigt skyllet med iskold PBS og lyseret i TRIzol-reagens (Invitrogen) til RNA-ekstraktion. Genekspressionsprofiler mellem kg2 og C1-celler blev analyseret med det humane U133A GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, CA) ifølge fabrikantens protokol [27].

Statistisk analyse

GLO1 udtryk for hver undergruppe af clinicopatholgoical parametre i tabel 1 er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse (SD) af IHC score af patienterne i denne undergruppe. Den Kolmogorov-Smirnov testen er en ikke-parametrisk test til at sammenligne prøver med en reference sandsynlighedsfordeling. Hvor det er hensigtsmæssigt, blev Mann-Whitney U eller Fishers eksakte test anvendt til sammenligninger mellem de to grupper, mens Kruskal-Wallis eller Pearsons chi-square testen blev brugt til at sammenligne mere end to grupper. Forholdet mellem data fra de to forskellige undersøgelser blev analyseret med Spearmans korrelation test. Patienterne blev overvåget indtil det tidspunkt, hvor manuskriptet forberedelse eller død. Kræftspecifikke overlevelse resultat blev bestemt ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden for alle patienter, undtagen dem, der døde af kirurgiske komplikationer. Log-rank test blev anvendt til at sammenligne den prognostiske betydning af individuelle variabler på overlevelse. Den Cox proportionel risiko model blev ansat i multivariat analyse for at identificere de uafhængige prædiktorer for overlevelse.

P

værdier. 0,05 blev betragtet som signifikante

Resultater

GLO1 mRNA og protein niveauer opreguleret i gastrisk kræftpatienter

Brug cDNA microarray har vi identificeret adskillige opreguleres gener fra gastriske væv, sammenlignet med tilstødende nontumorous væv [18]. Blandt disse gener, vi fokuseret på

GLO1

som en molekylær mål for mavekræft. Ekspression af GLO1 blev målt i cancervæv, og sammenlignes med den i matchede nontumorous gastrisk mucosa under anvendelse QRT-PCR (n = 89) (tabel 2) eller IHC (n = 114) (Tabel 1). Data fra QRT-PCR-forsøg afslørede GLO1 overekspression (≥1.5 gange) i 51 (57,3%) af gastrisk cancer væv, sammenlignet med noncancerous væv. Den gennemsnitlige GLO1 ekspression i tumorvæv var 2,87 gange den i noncancerous væv. Vores resultater bekræfter en signifikant stigning i GLO1 udtryk i tumorvæv (

P

= 0,005, en-prøve Kolmogorov-Smirnov test).

Angivelse af GLO1 protein i parrede prøver blev yderligere analyseret under anvendelse western blotting. Figur 1A viser GLO1 ekspression i otte repræsentative patienter. Ens mængder af totale proteiner farvet med Coomassie blue efter SDS-PAGE blev anvendt som lastning kontrol. Alle kræft væv fra mavekræft prøver (G1 til G8) vises opreguleret GLO1 udtryk, sammenlignet med matchede noncancerous tilstødende slimhinde (fig. 1A).

Overekspression af GLO1 protein i gastrisk karcinom. (A) Western-blot der viser tilstedeværelsen af ​​GLO1 protein i cancervæv. GLO1 proteiner blev overudtrykt i de fleste tumorvæv (T), sammenlignet med matchede noncancerous tilstødende slimhinder (N). Alle kræft væv fra mavekræft prøver (G1 til G8) viste opregulering af GLO1, sammenlignet med matchede noncancerous tilstødende slimhinde. En ækvivalent mængde (30 ug) protein blev påsat for hver prøve og underkastet 12% SDS-PAGE, efterfulgt af farvning med Coomassie blue som en loading kontrol. Kanin polyklonalt antistof mod human GLO1 fremstillet internt blev anvendt. (B) Paneler a, c, e og g afbilder noncancerous slimhinde, mens panel b, d, f og h skildrer mavekræft væv. Positiv farvning for GLO1 er indiceret som en mørkebrun farve. GLO1 ekspression blev observeret, overvejende gastriske cancerceller og sjældent i stromale celler. Scale søjle repræsenterer 100 um.

Immunfarvning demonstrerer GLO1 protein overekspression i gastrisk kræft væv

For yderligere at fastslå, om GLO1 opregulering er korreleret med klinisk progression af mavekræft, blev IHC udført på paraffin-fikseret mavekræft væv og matchede noncancerous slimhinde 114 patienter. Fire par repræsentative tilfælde (a /b, c /d, e /f, og g /h) er vist i figur 1B. IHC data for noncancerous mucosa modstykker (a, c, e og g) og cancer væv (b, d, f, og h) blev sammenlignet i par. Mørkebrunt immunfarvning var mest fremherskende i kræftceller mens niveauer af farvning var lavere i stromale celler eller fibroblaster af mavekræft væv. Stærk farvning for GLO1 blev ofte observeret i avancerede gastriske tumorceller, i modsætning til svag eller ingen farvning i normale gastriske epitelceller (fig. 1B, øvre panel). Farvning var mere intens på de avancerede mavekræft stadier [etape III i fig. 1B (f, h)], sammenlignet med trin I [Fig. 1B (b)] og II [Fig. 1B (d)]. Blandt de 114 patienter, analyserede, var den gennemsnitlige IHC score i tumorvæv var 139,8 ± 62,8, hvilket var signifikant større end (36,7 ± 40,4) i den matchende tilstødende slimhinde (n = 87) (

P

0,001 , Wilcoxon-test). Endvidere parret sammenligning af immunoreaktivitet for GLO1 (n = 87) viste, at de ICH snesevis af cancervæv var højere end for de nontumorous modstykker i 77 (88,5%) patienter, lig hos tre patienter (3,4%), og lavere i syv patienter (8,0%).

GLO1 udtryk og kliniske korrelationer

GLO1 udtryk i tumorvæv ikke var signifikant associeret med alderen, tumor placering eller histologiske type (tabel 1 og 2). Højere niveauer af GLO1 var tydelig i T3 /T4 grupper, hvor den serøse overflade af mavevæggen blev invaderet af kræft, sammenlignet med den i T1 /T2 grupper, hvor ingen invasion var tydelig (

P

= 0,015 for QRT – PCR og

P

= 0,001 for IHC, fig 2A, tabel 1 og 2).. Ekspression af GLO1 blev signifikant øget, med metastaser til lymfeknuderne (

P

= 0,001 for QRT-PCR og

P

0,001 for IHC,. Figur 2B, tabel 1 og 2) . Højere udtryk var tydelig hos patienter med lymfatisk invasion (

P

= 0,001 og

P

= 0,016 for QRT-PCR og IHC henholdsvis; tabel 1 og 2) og perineurale invasion (

P

= 0,024 for QRT-PCR, tabel 2). Forøget GLO1 ekspression var ikke forbundet med vaskulær invasion eller fjernmetastaser, herunder peritoneal seeding eller levermetastaser, i begge QRT-PCR og IHC eksperimenter. Ekspression af GLO1 var signifikant højere hos patienter med mere avancerede patologiske stadier (III /IV) af gastrisk kræft, i forhold til dem i de tidligere patologiske stadier (I /II) (

P

= 0,001 og

P Salg 0,001 for QRT-PCR og IHC henholdsvis) (fig 2C;. tabel 1 og 2)

(A) Scatter plot efter dybde af væg invasion (

P

= 0,001, T1 /T2 vs T3 /T4). (B) Scatter plot ifølge lymfeknude metastaser (

P

0,001, n0 versus N1-3). (C) Scatter plot i henhold til patologisk stadie (

P

0,001, stadier I /II versus trin III /IV). (D) Kaplan-Meir overlevelseskurverne for to grupper af mavecancerpatienter defineret af et GLO1 ekspressionsniveauet cutoff værdi på 90, der er etableret på grundlag af IHC scoring. Det 5-års overlevelsesraten for de lavere ekspression grupper (n = 24) var signifikant bedre end de højere udtryk grupperne (n = 90; 69,6% vs. 43,3%; log rank

P

= 0,0373) .

resultater Survival

den gennemsnitlige varighed af follow-up perioden for 52 overlevende var 70,4 måneder (interval, 28-119 måneder). Fire patienter døde for postoperative komplikationer og seks af andre årsager. Fifty-to patienter døde på grund af mavekræft progression. Den samlede kumulative fem års overlevelse af de 114 patienter var 49,3% efter gastrektomi. For at bestemme indflydelsen af ​​GLO1 ekspression på overlevelse resultat blev patienten delt i to grupper, højere og lavere udtryk, ifølge cutoff-værdien, som ville vise en signifikant forskel (log rank

P

0,05) i overlevelsesrater mellem 2 grupper. Medianen (= 140), øvre kvartil (= 180 eller 75

percentil), og laveste kvartil (= 90 eller 25

percentil) af IHC snesevis af vores patient blev indledningsvis testet for at bestemme de cutoffværdier. Blandt dem, kunne kun den laveste kvartil viser en signifikant forskel i overlevelse resultat. Fig. 2D illustrerer de kumulative overlevelseskurverne for patienter i de lavere og højere udtryk GLO1 grupper, opdelt efter en cutoff IHC score på 90. 5-års overlevelsesraten for de lavere GLO1 udtryk grupper var signifikant større end for de højere udtryk grupperne ( 69,6% vs. 43,3%; log rank

P

= 0,0373) i IHC eksperimenter. Univariate analyse beskrevet en række væsentlige prognostiske faktorer, herunder status lymfeknudemetastase, fjernt metastase, peritoneal seeding, vaskulær invasion, lymfe invasion, dybde af invasion, patologiske stadium, levermetastaser og perineural invasion, foruden GLO1 ekspression. Andre vigtige parametre var histologisk type, tumorstørrelse, og brutto type (tabel 1). Endvidere i multivariat analyse, de uafhængige prognostiske faktorer, der påvirker patientens overlevelse inkluderet lymfeknude metastaser (relativ risiko = 5,954, 95% CI = 1,183 til 29,977,

P

= 0,031) og fjernmetastaser (relativ risiko = 2,464, 95% CI = 1,030-5,896,

P

= 0,043).

over-ekspressionen af ​​GLO1 i SC-M1 øger celleproliferation, migration og invasion aktiviteter.

til bestemme virkningerne af overekspression af

GLO1

i SC-M1 celler, celledeling, migration og invasion aktiviteter blev analyseret. Efter to ugers transfektion blev stabil ekspression af GLO1 protein etableret. Figur 3A viser 2,36 gange og 2,29 gange højere GLO1 ekspression hhv. Celleproliferation blev bestemt ved celletælling og angivet som en fold af kontrol med op til fem dage.

GLO1

-overexpressing celler udviser signifikant (

P

0,01) højere spredning satser (1.86- eller 2,06 gange) end dem transfekteret med kontrol vektor på dag 5 (Fig 3B.). Desuden

GLO1

-overexpressing celler vises signifikant (

P

0,01) højere migration (5.53- eller 4,57 gange) og invasive evner (henholdsvis 3,7 eller 3,47-fold) end deres kontrol modstykker (fig. 3C og D). Billeder af celledensitet blev vist for to kontrol og to over-udtrykkende cellelinjer (venstre paneler i fig. 3C og D).

To SC-M1-GLO1 overekspression kloner (OG1 og OG2), og to kontrol cellelinjer (C1, C2) blev etableret. (A) Ekspression af GLO1 blev bestemt under anvendelse western blot analyse. β-actin blev anvendt som en intern kontrol. (B) celleproliferation, (C) Migration, og (D) Invasion evner blev analyseret som beskrevet i “Materialer og metoder”. Data blev præsenteret som folder fra mindst tre uafhængige forsøg udført i duplikeret. De fold ændringer (B-D), og forskelle undersøgt ved hjælp af Mann-Whitney U-metoden til at sammenligne værdier med vektor kontrol. **

P

. 0,05

Down-ekspressionen af ​​GLO1 i TSGH eller AGS celler reducerer celle migration og invasion aktiviteter

Vores resultater bekræftede høj ekspression af GLO1 i fremskreden mavekræft, sammenlignet med noncancerous maveslimhinden. For at bestemme om GLO1 ekspression er forbundet med invasivitet af gastriske cancer cellelinjer, blev virkningerne af GLO1 depletering ved anvendelse korte hårnål (sh) RNA plasmider på tumorcelleinvasion aktiviteter TSGH eller AGS celler vurderet. ShRNA ekspressionsvektorer, der koder antisense GLO1 sekvens blev transficeret ind TSGH og AGS cellelinier, der udtrykker høje niveauer af endogen GLO1. GLO1 ekspression blev signifikant undertrykt i TSGH-KG1, -KG2 (0.32- og 0,14 gange) og AGS-KS1, -KS2 (0.26- og 0,21 gange) underlinjer, sammenlignet med det i celler transficeret med styrevektorerne ( C1, C2,. 4A og B). KG1 og KG2 GLO1-udtømte celler udviste signifikant (

P

0,05) reducerede migration satser (0.16- eller 0,044 gange, henholdsvis) og invasion evner (0.43- eller 0,29 gange, henholdsvis) end kontrol vektor transficerede celler (fig. 4C og D). Lignende resultater blev opnået med AGS-KS celler (KS1 og KS2) (fig. 4E og F). Vores resultater kollektivt tyder på, at GLO1 positivt regulerer migration og invasion evner gastriske kræftceller.

To TSGH-GLO1-tavshed kloner (kg1 og kg2), to AGS-GLO1-tavshed kloner (KS1 og KS2) underlinjer og kontrol cellelinier (TSGH-C1 og C2, AGS-C1 og C2) blev etableret. (A, B) Ekspression af GLO1 blev bestemt under anvendelse western blot analyse. β-actin blev anvendt som en intern kontrol. Cellevandring (C, E) og invasion (D, F) evner blev analyseret som beskrevet i “Materialer og metoder”. Data blev præsenteret som folder fra mindst tre uafhængige forsøg udført i duplikeret. De fold ændringer (C-F), og forskelle undersøgt ved hjælp af Mann-Whitney U-metoden til at sammenligne værdier med vektor kontrol. **

P

. 0,05

Down-ekspressionen af ​​GLO1 resulterer i reduceret ekspression af gener, der er involveret i metastase-associerede veje

For at undersøge, om GLO1 protein påvirker metastase-relaterede gener, sammenlignede vi hele genomet ekspression af KG2 og C1. Adskillige gener opregulerede (≥1.5 gange) i C1, sammenlignet med KG2, blev udvalgt. MetaCore ™ analyse [28] viste, at de top-ranking molekylære veje ændret i KG-kloner var adhesion_cytokines og vedhæftning veje. Proteiner [såsom matrixmetalloproteinase (MMP), CXCL8, og CXCL1] er involveret i disse veje blev nedreguleret på GLO1 lyddæmpning. Blandt de cytokin-relaterede veje, er høj ekspression af VEGF, CXCL8, CXCR2, og CXCL1 forbindelse med cancer metastase og progression [8], [29]. Tidligere Daniel J.

et al.

[30] rapporterede, at overekspression af GLO1 kunne forbedre stromal celleafledt faktor-1 (SDF-1), CXCR4, og VEGF-ekspression i hypoksisk endotel progenitorceller kultur i høj glucose. Derfor analyserede vi også udtryk for VEGF i KG stabile linjer.

Vi yderligere valideret udtrykket mønstre af proteiner i VEGF eller cytokin-relaterede veje via Western blot analyse. Niveauerne af målgener, herunder CXCL1, CXCL8, CXCR2, og VEGF, blev hæmmet betydeligt i TSGH-KG stabil cellelinier (kg1 og kg2) sammenlignet med vektor-transficerede kontroller (Fig. 5A). Endvidere niveauerne af NF-KB og HIF1-α, velkendte transskriptionsfaktorer af pro-angiogeniske vækstfaktorer (såsom CXCL8, CXCL1, og VEGF) [31], blev reduceret i kernerne i TSGH-KG stabile cellelinier sammenlignet med kontrolceller (fig. 5A). MMP2 og MMP9, de vigtigste enzymer til nedbrydning af type IV-kollagen, menes at spille en kritisk rolle i tumorinvasion og metastase [32]. Især, udtømning af GLO1 førte til markant undertrykkelse af MMP2 og MMP9 aktiviteter (fig. 5B). Vore data viser, at GLO1 regulerer aktiveringen af ​​metastase-associerede signaleringsveje i gastriske cancerceller. Baseret på disse resultater, foreslår vi, at GLO1 medierer mavekræft cellemigration og invasion i det mindste delvis medieret gennem aktivering af CXCL1, CXCL8, og VEGF.

(A) HIF-1α, NF-kB, VEGF, CXCL8 , CXCL1, og CXCR2 proteinniveauer i TSGH celler transficeret med GLO1 shRNA (KG1 og KG2) og kontrol shRNA (C1 og C2). Gelen blev farvet med Coomassie blue (CB), som blev anvendt som en loading kontrol med betingede medier. β-actin blev anvendt som en intern kontrol for totale cellelysater, og lamin A /C i kerneproteiner. (B) Knockdown af GLO1 undertrykt aktivering af MMP2 og MMP9. Betingede medier fra C1, C2, KG1 og kg2 celler blev opsamlet og underkastet gelatinezymografi. (C) Dele af formalin-fikseret og paraffin-embedded væv fra tre humane gastriske tumorvæv blev immunfarvet med anti-GLO1 (a og b), anti-CXCL1 (c og d) eller anti-CXCR2 antistoffer (E og F). Coekspression af GLO1, CXCL1, og CXCR2 proteiner detekteret i humane mavekræft væv (b, d, og f). Noncancerous maveslimhinden med negativ eller lavere ekspression af GLO1, CXCL1 og CXCR2 proteiner (a, c og e). Scale søjle repræsenterer 200 um.

IHC viser coekspression af GLO1 med CXCL1 og CXCR2 proteiner og dets overekspression i gastrisk kræft væv

Tidligere undersøgelser har rapporteret, at cytokin receptor interaktion og VEGF signalveje er forbundet med malignitet funktioner i gastrisk cancer [8], [33]. Tidligere viste vores gruppe en signifikant association af CXCR2 og CXCL1 overekspression (n = 116) med gastrisk cancer progression [8]. Konsekvent, i IHC-analyse, en positiv signifikant sammenhæng blev udelukkende fundet mellem snesevis af GLO1 og CXCL1 eller CXCR2 i kræft væv (Spearman korrelationskoefficient = 0,238 og 0,293;

P

= 0,013 og

P

= 0,003). Endvidere immunfarvning af konsekutive sektioner viste betydelig ekspression af GLO1, CXCL1, og CXCR2 proteiner i tumor epitelceller [Fig. 5C (b), (d) og (f)], i modsætning til ingen eller lav ekspression i noncancerous væv [Fig. 5C (a), (c) og (e)].

Diskussion

Som den næsthyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald, mavekræft er stadig en udfordrende sygdom. Data fra denne undersøgelse viste, at opregulering af GLO1 i gastrisk cancer væv er signifikant associeret med tumorudvikling og fremskredne stadier af sygdommen. Samstemmende, patienter med lavere GLO1 niveauer havde bedre sygdom prognose. Desuden QRT-PCR og IHC eksperimenter beskrevet en korrelation mellem forøget GLO1 ekspression med lokal tumorprogression og lymfeknude invasion. Vi observerede et markant fald i metastaser og invasion evner GLO1-manglende celler, samtidig med reducerede niveauer af flere metastase-associerede faktorer, herunder VEGF, CXCL1, CXCL8, MMP’er, og CXCR2. I IHC studie blev en positiv signifikant sammenhæng mellem GLO1 og CXCL1 ekspressionsmønstre observeret i resektion eksemplarer af mavekræft. Desuden forhøjet GLO1 og samtidig CXCL1 overekspression i patienter med mavekræft var signifikant korreleret med overlevelse. Vores resultater giver direkte beviser til støtte for inddragelse af GLO1 i mavekræft progression og magt gennem vekslen af ​​dens downstream migration og invasion veje.

Høj udtryk for GLO1 har været forbundet med flere kræftformer [16], [17] . Nylige undersøgelser har antydet en vital rolle GLO1 i flere cancertyper på fjernelsen af ​​methylglyoxal (MG), som anses carcinostatisk, hvilket resulterer i udvikling af GLO1 inhibitorer som antitumormidler [34], [35]. Således er høj ekspression af GLO1 involveret i cancer celle resistens overfor apoptose induceret af antitumormidler [36]. Sakamoto

et al.

[36] foreslået, at GLO1 er ikke kun en tumor, men også en lægemiddelresistensmarkør. Konsekvent, de GLO1 knockdown-kloner var følsomme over for flere kemoterapeutiske midler, såsom camptothecin, etoposid (data ikke vist). Klinisk vores resultater viser, at GLO1 i høj grad udtrykkes i gastrisk cancer og signifikant associeret med tumorudvikling og fremskredne stadier af sygdommen.

glycolytiske ændringer i cancerceller repræsenterer en metabolisk tilpasning til hypoxiske tumorer via virkningen af ​​hypoxia- induceret transkriptionsfaktor (HIF-1) [37], [38]. Desuden er transkriptionsfaktorer, HIF1-a og NF-KB, spiller afgørende roller i forskellige processer, såsom inflammation, mikrobiel drab og cancer progression [39]. Tumor hypoxia synes at være stærkt forbundet med tumor formering, malign progression, og resistens over for behandling. HIF-1α pathway er klart involveret i carcinogenese af gastrisk cancer [39]. Desuden er immunhistokemisk ekspression af HIF-1α målgener (Glut1, VEGF, CA9, iNOS) forbundet med gastrisk tumor progression [40]. Blandt de onkogene veje, er NF-KB-signalering forhøjet i en betydelig del af gastriske cancere [9]. Desuden flere linjer af beviser support krydstale mellem NF-KB og HIF-1a signalveje [41]. I vores eksperimenter blev niveauer af både HIF-1α og NF-KB reduceret i kerner ved GLO1 silencing i gastrisk cancer cellelinjer, sammen med nedstrøms målgener (VEGF, CXCL1, CXCL8, MMP’er).

I vores