PLoS ONE: N-terminal polypeptid af Annexin A2 Reducerer Infektion af Mycoplasma hyorhinis til Gastric Cancer Cells

Abstrakt

Mycoplasma-infektion hos mennesker og dens forurening i cellekulturer er verdensomspændende problemer. De lægemidler aktuelt tilgængelige til forebyggelse eller behandling mycoplasmainfektion lider lav følsomhed, stærk modstand og høj toksicitet. Vores tidligere arbejde viste, at

Mycoplasma hyorhinis

(

M

.

hyorhinis

) infektion blev medieret af samspillet mellem P37 af

M

.

hyorhinis

og Annexin A2 (ANXA2) af værtsceller, men den translationelle værdien af ​​denne mekanisme var ukendt. Heri syntetiserede vi den N-terminale ende af ANXA2 polypeptid (A2PP) og fandt, at A2PP kunne reducere infektion af

M

.

hyorhinis

til gastrisk kræftceller og blokere

M

.

hyorhinis

infektion-induceret celle migration. Desuden fandt vi, at A2PP kunne reducere

M

.

hyorhinis

forurening af passage celler. Desuden sammenlignet med de kommercielle antibiotika almindeligvis anvendes i cellekultur at forhindre

M

.

hyorhinis

infektion, A2PP demonstrerede en mere effektivitet, men en lav toksicitet på cellevækst. Således er vores undersøgelse for første gang afsløret A2PP potentiale til behandling og forebyggelse af

M

.

hyorhinis

infektion

Henvisning:. Yuan S, Qu L, Shou C (2016) N-terminal polypeptid af Annexin A2 Reducerer Infektion af

Mycoplasma hyorhinis

til Gastric Cancer Cells . PLoS ONE 11 (1): e0147776. doi: 10,1371 /journal.pone.0147776

Redaktør: Gernot Zissel, Universitätsklinikum Freiburg, Tyskland

Modtaget: 16 oktober, 2015; Accepteret: 7 januar 2016; Udgivet: 26 Jan 2016

Copyright: © 2016 Yuan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret. Microarray data er blevet deponeret i NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (tiltrædelse no.GSE73777)

Finansiering:. Finansieret af National Natural Science Foundation of China (81.572.532). https://www.nsfc.gov.cn/publish/portal1/. SCC modtaget finansiering. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller udarbejdelse af manuskript

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser findes

Introduktion

Patogene mycoplasma, herunder Mycoplasma pneumoniae (

M

.

pneumoniae

), mycoplasma hyorhinis (

M

.

hyorhinis

), oral mycoplasma (

M

.

orale

) og Mycoplasma genitalium (

M

.

genitalium

), hører til klasse mollicutes, som er den mindste mikroorganisme levende i naturen og kan duplikere uafhængigt [1-2]. Mange undersøgelser har vist, at infektion med disse mycoplasma var forbundet med tumorudvikling [3-8].

M

.

orale

forårsager kromosom abnormitet i humane diploide celler og inducerer celle transformation [6]. Infektion med

M

.

hyorhinis

eller

M

.

genitalium

kunne øge migrationen og invasivitet af prostata epitelceller [3].

M

.

hyorhinis

infektion har været forbundet med gigt, serositis, infertilitet og kræft i menneskelig [9-12].

Derudover forurening med mycoplasma i cellekultur er et alvorligt problem, og hastigheden af ​​passage celler inficeret af mycoplasma er høj. Celledyrkning er meget udbredt i biologi, såsom i grundforskning, klinisk forsøg forskning, udvikling og produktion af biologiske produkter samt inden for biofarmaceutiske og vaccinefremstilling. Forebyggelse cellerne fra mikrobiel kontaminering er afgørende for at sikre kvaliteten af ​​forskningen. forurening mycoplasma er det mest almindelige problem i cellekultur med en incidens på 30% -60% [1]. Det blev vist, at fire arter af mycoplasma tegner sig for mere end 95% af infektion i cellekultur, herunder

M

.

orale

, arginin mycoplasma (

M

.

arginini

),

M

.

hyorhinis

, og Levins ingen Acholeplasma (

A

.

laidlawii

) [13,14,15,16]. På grund af lille størrelse, mycoplasma er næppe findes under lysmikroskop og er let ignoreret af forskere. I de seneste år, mange antibiotika, der anvendes til mycoplasma behandling resulterede gentagne gange i fremkomsten af ​​mycoplasma resistens. Af disse grunde er det bydende nødvendigt at udvikle nye midler til forebyggelse eller faldende mycoplasma-infektion.

Vores tidligere arbejde viste, at

M

.

hyorhinis

infektion afhænger af samspillet af P37 (større membranprotein af

M

.

hyorhinis

) og vært ANXA2 gennem deres N-terminale domæner. Vi fandt også polyklonalt antistof mod p37 kunne blokere infektion af

M

.

hyorhinis

formindskelse

M

.

hyorhinis

-promoted migration af mavekræft celle [17]. Baseret på disse opdagelser, vi rejst en hypotese, at peptidet, syntetiseret ifølge aminosyresekvensen af ​​ANXA2 N-terminale region (fra 1

st til 30

th aa, her navngivet vi dette peptid som A2PP), kunne blokere

M

.

hyorhinis

infektion via sin konkurrence med ANXA2 og muligvis anvendes som et lægemiddel til forebyggelse af

M

.

hyorhinis

infektion i cellekultur. I denne undersøgelse, vi testede denne hypotese og også sammenlignet effekten af ​​A2PP med andre lægemidler i at forebygge

M

.

hyorhinis

infektion.

Materialer og metoder

Cell Culture

AGS mavekræft cellelinje var fra American Type Culture Collection (ATCC). BGC823 mavekræft cellelinje blev oprettet af Peking University Folkeparti Hospital og blev købt fra Cell Culture Center of Chinese Academy of Medical Sciences (Beijing, Kina). AGS og BGC823 celler blev dyrket i RPMI-1640-medium suppleret 10% føtalt kalveserum opnået fra Invitrogen (Carlssbab, CA, USA). Mycoplasma test blev gennemført før hvert nyt eksperiment ved PCR-amplifikation af

M

.

hyorhinis P37

.

Mycoplasma Formering og Co-kultur

Mycoplasma formering og co-kultur blev udført som tidligere rapporteret [17,18,19].

Antistoffer og reagenser

Anti-p37 monoklonalt antistof PD4 blev genereret og karakteriseret tidligere [5,20,21]. Polyklonalt anti-p37-antistof blev opnået fra immunisering kanin med GST-p37-fusionsprotein efter standardprotokol. Anti-EGFR og Anti-phospho-EGFR blev købt fra Cell Signaling Technology (CST, USA). Anti-ANXA2 var fra Novus Bioteknologi (Novus Biotechnology, USA). Anti-phospho-ANXA2 var fra Santa Cruz (Santa Cruz, Californien, USA). A2PP (1

st til 30

th aa) og forskellige trunkerede A2PP peptider, herunder A2PP-ND4 (5

th til 30

th aa), A2PP-ND8 (9

th til 30

th aa), A2PP-Nd12 (13

rd til 30

th aa), A2PP-Nd16 (17

th til 30

th aa), A2PP-CD4 (1

st til 26

th aa), A2PP-CD8 (1

st til 22

nd aa), A2PP-Cd12 (1

st til 18

th aa), A2PP- CD16 (1

st til 14

th aa), sammen med tilfældige kontrol-peptider (ConP) blev syntetiseret ved Sbsbio (Beijing, Kina). Antimikrobielle stoffer mycoplasma I (MYCO I) og mycoplasma II (MYCO II) blev købt fra M C genteknologi (Beijing, Kina). Ciprofloxacin (CIP) var fra Double-Crane Pharm (Beijing, Kina).

Påvisning af

M

.

hyorhinis

ved kvantitativ PCR (qPCR)

DNA blev ekstraheret fra AGS eller BGC823 celler efter

M

.

hyorhinis

infektion med DNA lysepuffer (50 mM Tris pH 8,5, 1 mM EDTA, 0,5% Tween-20, og 200 mg /l proteinase K) ifølge standardprotokollen. qPCR blev udført med 30 ng DNA og SYBR Green Real-time PCR 2 × premix kit (Takara, Otsu, Japan) under anvendelse Trin et system fra ABI (Foster City, CA, USA). Reaktionen programmer og

p37

-specifikke primere (forward: 5′-TATCTCATTGACCTTGACTAAC-3 ‘reverse: 5′-ATTTTCGCCAATAGCATTTG-3’) blev rapporteret tidligere [22]. At sammenligne

M

.

hyorhinis

DNA-niveauer i celler,

GAPDH Hotel (frem: 5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3 ‘, reverse: 5′-CCTGGAAGATGGTGATGGG-3’) blev opformeret som kontrol og data blev analyseret ved hjælp af 2

-ΔΔCt metode. Primere blev syntetiseret af Sangon (Shanghai, Kina).

Western Blotting

Celler blev høstet fra kultur fad med 2 × SDS loading buffer. Polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og Western blotting blev udført som tidligere beskrevet [23].

Cell ELISA

96-brønd blev podet med celler (1 x 10

4 /brønd), efterfulgt af behandling af angivne peptider og infektion af

M

.

hyorhinis

i 24 timer. Celler blev immobiliseret med 0,05% glutaraldehyd i 10 minutter, derefter celle ELISA blev udført som beskrevet tidligere [24].

Solid-Phase bindingsassay og pull-down assay

Rekombinant GST-p37 og GST-proteiner blev dannet og oprenset som tidligere beskrevet [17]. GST-p37 og GST blev fortyndet i puffer (0,1 M Na

2 CO

3, 0,1 M NaHCO

3, pH 9,6) og overtrækkes på plader med 96 brønde ved 4 ° C natten over. Pladerne blev vasket ved PBS i tre gange og blokeret med 5% skummetmælk /PBS ved stuetemperatur (RT) i 2 timer. Efter vask med PBS, angivne koncentrationer af biotin-konjugeret A2PP (syntetiseret ved Sbsbio) blev tilsat og inkuberet ved stuetemperatur i 2 timer. Efter vask med PBST 3 gange, streptavidin-konjugeret HRP (Baltimore Pike, West Grove, PA, USA) blev tilsat og inkuberet ved stuetemperatur i 30 minutter. Efter farveudvikling med Ortho-phenylendiamin (Sigma), optisk densitet ved 490 nm (OD490) blev registreret med en mikropladelæser (Bio-rad 550). For pull-down assay 100 ng GST-p37 eller GST-protein blev co-inkuberet med 20 pM biotin-A2PP og streptavidinkugler (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA) i bindingspuffer (50 mM Tris-HCI pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% NP-40, 0,5 mM DTT, 1 mM PMSF og 1 × komplette proteasehæmmere) ved 4 ° C natten over. Bundfaldet blev vasket med bindende buffer fire gange og analyseret ved Western blotting.

Co-Immunpræcipitation

M

.

hyorhinis

inficerede celler (BGC823 eller AGS) blev homogeniseret i lyseringspuffer (50 mM Tris-HCI pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 1 mM PMSF og 1 × komplette proteaseinhibitorer) ved 4 ° C i 10 min. Efter 12, 000 g centrifugering i 10 minutter ved 4 ° C, supernatanterne blev udvundet. Proteinlysater (500 ug) inkuberet med 20 pM A2PP eller ConP, 1 ug anti-ANXA2 plus protein G sepharose-perler (GE Healthcare) ved 4 ° C natten over. Præimmun IgG (1 ug) blev anvendt som kontrol. Udfældede perler blev vasket med lyseringspuffer fire gange, elueret i 2 × påsætningsbuffer, kogt og analyseret ved Western blotting.

Immunofluorescens Assay

Celler blev podet på dækglas og dyrket natten over. Den næste dag blev cellerne behandlet med viste peptider og inficeret med

M

.

hyorhinis

i 24 timer. Derefter blev cellerne vasket med iskold PBS i tre gange, fikseret i 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur. Efter blokering i 1 time i 5% BSA /PBS, cellerne blev inkuberet med angivne antistoffer ved stuetemperatur i 1 time. Derefter blev cellerne vasket i 3 gange igen med PBST og inkuberet med FITC eller TRITC-mærkede sekundære antistoffer i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter vask med PBS og kontrastfarvning med DAPI, blev celler anbragt på 50% glycerol /PBS. Et Zeiss LSM780 konfokalt mikroskop (Zeiss Microsystems, Oberkochen, Tyskland) blev anvendt til at observere lokaliseringen af ​​angivne proteiner.

cellemigrationsassay

Transwell kammer med 8,0 um pore membraner (Corning, NY, USA) blev anvendt i cellemigrationsassay. Den nederste kammer blev fyldt med 800 pi medium indeholdende 10% FBS som kemoattraktant. Celler blev resuspenderet i serum-frit medium indeholdende

M

.

hyorhinis

plus A2PP eller ConP, derefter blev omhyggeligt overført til toppen kammer i hver Transwell-apparat ved en densitet på 2 x 10

5 celler /ml (120 uL /​​kammer). Cellerne fik lov til at migrere i 24 timer ved 37 ° C. Den øverste overflade af hver membran blev renset for celler med en vatpind. Celler trængt til undersiden af ​​membranen blev fikseret i kold methanol, farvet med 0,1% krystalviolet og talt i ni tilfældigt udvalgte mikroskopiske felter per brønd. Hver prøve blev fremstillet i tredobbelte kamre og hvert eksperiment blev gentaget mindst 3 gange.

celleproliferationsassay

mavekræft celler blev podet i 96-brønds dyrkningsplader ved densitet på 5 x 10

3/100 gl /brønd i tre eksemplarer, og blev behandlet med angivne reagenser. Proliferation af celler blev kvantificeret af cellen sammenløbet med en CloneSelect Imager (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

microarray analyse og Real-Time RT-PCR

AGS og BGC823 celler ( 1 × 10

6 pr 10 cm

2 plade) blev behandlet med A2PP, CIP, MYCO i og MYCO II i 24 timer, vasket med PBS, og høstet i Trizol reagens. RNA-prøver blev undersøgt i OE Bioteknologi (Shanghai, Kina) ved hjælp af Affymetrix GeneChip

® PrimeView

™ Human Gene Expression Array. Microarray data er blevet deponeret i NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (accession no.GSE73777). Rå data blev registreret ved hjælp af Affymetrix GeneChip kommandokonsollen (version 4.0, Affymetrix). Dernæst Genespring software (version 12.5, Agilent Technologies) blev anvendt til at afslutte den grundlæggende analyse med de rå data. Til at begynde med, de rå data blev normaliseret med RMA-algoritmen. Differentielt udtrykte gener blev derefter identificeret gennem gange ændring. Tærsklen sat for op- og ned-regulerede gener var en fold ændring ≥ 2,0. Bagefter, GO og Kegg analyse blev anvendt til at vælge ud gener, relateret til cellecyklus og celle apoptose. Real-time RT-PCR blev anvendt til at validere resultaterne af microarray og udført i overensstemmelse med fabrikanternes instruktion (SYBR, TOYOBO). Ekspressionsniveauer af beslægtede gener blev normaliseret via

GAPDH

og 2

-ΔΔCT blev anvendt til at beregne relativ genekspression. De primere til real-time RT-PCR (

ATF

, fremad, 5′-GAGTGGCGACAGGATAGAGC-3 ‘, omvendt, 5′-TTTAGCCTCCCTCCCTTAGC-3’;

DDIT3

, fremad, 5 ‘ -GCGCATGAAGGAGAAAGAAC-3 ‘, omvendt, 5′-ACCATTCGGTCAATCAGAGC-3’;

CEBPB

, fremad, 5′-AGCGACGAGTACAAGATCCG-3 ‘, omvendt, 5′-AGCTGCTCCACCTTCTTCTG-3’) blev syntetiseret af Sangon

Statistisk Analyse

data blev præsenteret som gennemsnit ± SD. Forskellene blev analyseret ved ANOVA under anvendelse SPSS 11.0 software og P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Microarray tiltrædelse Antal

Microarray data er blevet deponeret i NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (tiltrædelse nej. GSE73777).

Resultater

A2PP har ingen effekt på levedygtighed eller Migration af mavekræft Cells

for at vurdere betydningen af ​​ANXA2 s N-terminale domæne i

M

.

hyorhinis

infektion, vi først syntetiseret A2PP peptid svarende til N-terminalen af ​​ANXA2 (Fig 1A). Biotinmærket A2PP blev vist at specifikt at interagere med GST-p37 i fastfasebindingsassay (fig 1B) og pull-down assay (Fig 1C). Vi har bemærket, at A2PP ikke påvirkede morfologi AGS og BGC823 celler (Fig 1D). Derudover i koncentrationer på under 20 pM, A2PP inhiberede ikke celleproliferation (Fig 1E), hvilket antyder, at A2PP har minimal toksicitet for celler. EGFR har været impliceret i reguleringen ANXA2 fosforylering [17,25,26], mens A2PP havde nogen indvirkning på phosphoryleringer eller protein niveauer af EGFR og ANXA2 [Fig 2A]. Desuden A2PP havde nogen indvirkning på migration af AGS og BGC823 celler (Fig 2B og 2C). Cellulær lokalisering af ANXA2 reguleres af sin fosforylering, som er afgørende for dets funktion [17,27,28]. Vi fandt A2PP ændrede ikke den subcellulære lokalisering af endogene ANXA2 (Fig 2D). Disse resultater indikerer, at A2PP alene har nogen virkning på maligne fænotyper eller EGFR-ANXA2 signalering af gastriske cancerceller.

(A) Skematisk diagram af aminosyresekvensen af ​​N-terminalen af ​​ANXA2 polypeptid (A2PP). (B) Fastfase-bindingsassay. OD490 af 15 nM biotin-A2PP til GST blev fastsat som en og relative bindinger blev caculated. Middelværdi ± SD af tre uafhængige assays med tredobbelte prøver. ***, P 0,001. (C) Streptavidin pull-down assays identificeret Biotin-A2PP som et GST-p37-bindende polypeptid. (D) Cell morfologi AGS og BGC823 følgende angivne koncentrationer af A2PP behandling i 24 timer og 48 timer. (E) spredning af gastrisk kræft cellelinier (AGS og BGC823) behandlet med stigende koncentration af A2PP for 72 timer. Middel ± SD fra tre forsøg med tredobbelte prøver.

(A) Western blotting af phospho-EGFR, phospho-ANXA2, EGFR, og ANXA2 fra AGS og BGC823 celler behandlet med A2PP i 24 timer. GAPDH blev anvendt som indlæsning kontrol. (B) Repræsentative billeder af migration af AGS og BGC823 celler behandlet med A2PP i 24 timer. Scale barer, 200 um. (C) Statistisk oversigt over migration assay. Middelværdi ± standardafvigelse fra tre eksperimenter med tredobbelte prøver. ns, uden betydning. (D) Immunofluorescens af ANXA2 lokalisering (rød) i AGS og BGC823 celler behandlet med A2PP i 24 timer. Scale barer, 5 um.

A2PP Fald

M

.

hyorhinis

Infektion

Vores tidligere arbejde har vist, at N-terminal ANXA2 medierer

M

.

hyorhinis

infektion [17]. Som det fremgår af resultatet af celle-ELISA-assay, fandt vi, at

M

.

hyorhinis

infektion blev blokeret af A2PP på en dosis-afhængig måde i BGC823 og AGS celler, men ConP-behandlede celler blev stadig stærkt inficeret af

M

.

hyorhinis

(Fig 3A). Disse resultater blev støttet af qPCR assays (figur 3B). Konsekvent, A2PP faldt også proteinniveauer af p37-protein i Western blotting-analyse (fig 3C og 3D). I mellemtiden, niveauer af phophos-AXNA2 og phophos-EGFR i de inficerede celler blev nedreguleret ved behandling med A2PP (fig 3C og 3E), mens de samlede niveauer af AXNA2 og EGFR var relativt stabilt (figur 3C). I immunfluorescens analyse blev A2PP sig at hæmme

M

.

hyorhinis

infektion-induceret p37 ophobning og co-lokalisering mellem p37 og ANXA2 (Fig 4A). I co-immunopræcipitationsassay med proteinlysater fra

M

.

hyorhinis

inficerede celler, A2PP faldt interaktionen mellem P37 og ANXA2 (Fig 4B). Tilsammen udgør disse beviser støttede idéen, at A2PP kunne falde

M

.

hyorhinis

infektion og bekræftet vores tidligere opdagelse, at N-terminalen af ​​ANXA2 er påkrævet for at mediere

M

.

hyorhinis

infektion [17].

Cell ELISA-analyse af p37 (OD 490 nm) af p37 protein i AGS og BGC823 celler inficeret med 10

5 CCU (farveskiftende enheder) /ml

M

.

hyorhinis

og behandles med A2PP eller ConP i 24 timer.

M

.

hy

,

M

.

hyorhinis

. Middelværdi ± standardafvigelse fra 3 eksperimenter med tredobbeltbestemmelse for hver prøve. (B) Kvantitativ PCR (qPCR) analyse af

p37

i AGS og BGC823 celler inficeret og behandlet som i (A). Middelværdi ± standardafvigelse fra 3 eksperimenter med tredobbeltbestemmelse for hver prøve. (C) Western blotting af p37, p-EGFR, EGFR, p-ANXA2 og ANXA2 fra AGS og BGC823 celler behandlet som i (A). (D) Kvantificering af p37 proteinniveauer af i (C). Niveauer af p37 blev normaliseret til de af GAPDH. Middelværdi ± standardafvigelse fra 3 uafhængige eksperimenter. (E) Kvantificering af p-EGFR og p-ANXA2 niveauer i (C). Niveauer af p-EGFR eller p-ANXA2 blev normaliseret til de af EGFR eller ANXA2. Middelværdi ± standardafvigelse fra 3 uafhængige eksperimenter. **, P 0,01; **, P 0,001; ns, uden betydning.

(A) Lokaliseringer af ANXA2 (rød) og P37 (grøn) i BGC823 og AGS celler inficeret med 10

5 CCU /ml

M

.

hyorhinis

og behandles med A2PP eller ConP i 24 timer. Colokalisering blev vist ved flettede signaler (gul). Scale barer, 5 um. (B) Co-immunopræcipitationsassay at validere ANXA2-p37 interaktion i BGC823 og AGS celler inficeret med

M

.

hyorhinis

og behandles med A2PP eller ConP i 24 timer.

A2PP Undertrykker

M

.

hyorhinis

induceret Migration

Vores tidligere undersøgelser antydet, at

M

.

hyorhinis

infektion kan fremme migration af mavekræft celler [17, 23]. I denne undersøgelse, bemærkede vi, at

M

.

hyorhinis

-promoted migration af gastriske kræftceller blev ikke påvirket af ConP, men var dosisafhængig hæmmet af A2PP (Fig 5A og 5B). Disse resultater tyder på, at A2PP hæmmede

M

.

hyorhinis

-induceret migration, der var forbundet med dens evne til at reducere infektion forfremmet phosphoryleringer af EGFR og ANXA2 (fig 3C og 3E).

(A) Migration af 10

5 CCU /ml

M

.

hyorhinis

inficerede AGS og BGC823 celler behandlet med angivne peptider i 24 timer. (B) Sammenfatning af migration assays (n = 3). Middelværdi ± standardafvigelse fra 3 uafhængige forsøg med tredobbelte prøver. ***, P. 0,001

A2PP Har Essential Motiv til Fald

M

.

hyorhinis

Infektion

For at karakterisere kritiske del af A2PP, vi søgte at afgøre, om diverse trunkerede peptider A2PP (Fig 6A) kunne reducerer

M

.

hyorhinis

infektion. I qPCR analyser, A2PP og afkortede peptider A2PP-ND4, ND8, Nd12, CD4, CD8, og Cd12 reduceret

M

.

hyorhinis

infektion i gastriske kræftceller, men A2PP-Nd16 og A2PP-CD16 undladt at falde

M

.

hyorhinis

infektion (Fig 6B). Lignende mønster af inhibering blev opnået fra Western blotting assay (Fig 6C). Disse resultater tyder på, at der findes en bestemt motiv i A2PP er afgørende for dens evne til at reducere

M

.

hyorhinis

infektion. For yderligere at kortlægge de centrale sekvenser af dette potentiale motiv, vi syntetiseret de to peptider, der svarer til 11

th -20

th aa (betegnes som A2PP-10aa) og 13

th -18

th aa (betegnet som A2PP-6aa) (fig 7A). I qPCR assay, kunne begge peptider falde

M

.

hyorhinis

infektion (fig 7B), som blev støttet af Western blotting assay (Fig 7C). Især de inhiberende virkninger af A2PP-10aa var bedre end A2PP-6aa, men virkningen af ​​begge peptider var mindre robuste som de i A2PP (fig 7B og 7C). Thesefore, de centrale sekvenser (11

th -20

th) i A2PP kunne være den afgørende motiv til at hæmme

M

.

hyorhinis

infektion.

(A) Skematisk diagram af afkortede peptider A2PP. (B) qPCR-analyse af

p37

i AGS og BGC823 celler inficeret med 10

5 CCU /ml

M

.

hyorhinis

og behandles med 20 pM angivne peptider i 24 timer. Middelværdi ± standardafvigelse fra 3 eksperimenter med tredobbeltbestemmelse for hver prøve. (C) Western blotting af p37 fra AGS og BGC823 celler inficeret og behandlet som i (B). Middel ± SD fra 3 uafhængige forsøg.

Skematisk diagram af to afkortede former af A2PP. (B) qPCR-analyse af

p37

i AGS og BGC823 celler inficeret med 10

5 CCU /ml

M

.

hyorhinis

og behandles med 20 pM angivne peptider i 24 timer. Middelværdi ± standardafvigelse fra 3 eksperimenter med tredobbeltbestemmelse for hver prøve. (C) Western blotting af p37 fra AGS og BGC823 celler inficeret og behandlet som i (B). Middelværdi ± standardafvigelse fra 3 uafhængige eksperimenter. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001.

Sammenligning af A2PP med andre lægemidler i Forebyggelse

M

.

hyorhinis

Infektion

M

.

hyorhinis

var en af ​​de vigtigste forureningskilder i cellekultur [13,14,15]. Den bedste måde at fjerne

M

.

hyorhinis

infektion er at kassere celler og hurtigt sterilisere alle de kontaktede skibe, men nogle inficerede celler kunne ikke erstattes i flere tilfælde. Derfor er det bydende nødvendigt at anvende specifikke antimikrobielle tilgange at forebygge eller fjerne

M

.

hyorhinis

infektion. Der har været forskellige antimikrobielle midler til forebyggelse

M

.

hyorhinis

inficere. For eksempel kunne Ciprofloxacin (CIP) udrydde

M

.

hyorhinis

i en passende koncentration [29]. To antimikrobielle komponenter navngivet som mycoplasma I (MYCO I) og mycoplasma II (MYCO II) kan reducere

M

.

hyorhinis

infektion ved at blokere dens protein og nukleinsyre syntese. nogle bekymringer, såsom lav følsomhed, stærk modstand og høj toksicitet, kan dog begrænse deres anvendelse i cellekultur. På baggrund af disse overvejelser mener vi, det er nødvendigt at sammenligne effektiviteten af ​​A2PP, CIP, MYCO I og MYCO II i forebyggelsen

M

.

hyorhinis

infektion. Ved Western blotting og qPCR assays, fandt vi, at A2PP s hæmmende effekt på

M

.

hyorhinis

infektion var ligner MYCO I, men var bedre end CIP og MYCO II (Fig 8A og 8B). Interessant, fandt vi, at A2PP også effektivt kunne fjerne

M

.

hyorhinis

infektion i kraftigt inficerede celler i processen af ​​passager fra P

1 til P

3 (fig 8C og 8D). Derudover sammenlignet med MYCO I og MYCO II, A2PP havde mindre inhiberende virkning på celleproliferation (Fig 9A). At udforske mekanismerne i A2PP, CIP, MYCO I og MYCO II effekter på celler spredning, vi udførte microarray analyse og screenet en delmængde af differentielt udtrykte gener i A2PP, CIP, MYCO I og MYCO II behandlede celler. Kvantitativ RT-PCR-analyse viste forøget ekspression af apoptose-relaterede gener (

ATF5

,

DDIT3

,

CEBPB

) ved MYCO I og MYCO II behandling, men små ændringer var observeret i A2PP og CIP grupper (fig 9B). Disse resultater indikerer, at A2PP har mindre toksicitet og bedre forebyggende potentiale i blokerende

M

.

hyorhinis

infektion i dyrkede celler.

(A) Western blotting af p37 fra AGS og BGC823 celler inficeret med 10

5 CCU /ml

M

.

hyorhinis

og behandlet med A2PP (20 uM), CIP (4 ug /ml), MYCO I (5 ug /ml), eller MYCO II (10 ug /ml) i 24 timer. Middelværdi ± standardafvigelse fra 3 uafhængige eksperimenter. (B) qPCR-analyse af

p37

i AGS og BGC823 celler behandlet som i (A). Middelværdi ± standardafvigelse fra 3 eksperimenter med tredobbeltbestemmelse for hver prøve. (C) Western blotting af p37 fra AGS celler inficeret med 10

5 CCU /ml

M

.

hyorhinis

og behandlet med A2PP i processen af ​​celle- passager fra P

1 til P

3. Middelværdi ± standardafvigelse fra 3 uafhængige eksperimenter. (D) qPCR-analyse af

p37

i AGS celler inficeret og behandlet som i (C). Middelværdi ± standardafvigelse fra 3 eksperimenter med tredobbelte prøver. **, P 0,01; ***, P 0,001; ns, uden betydning.

(A) Proliferation af AGS og BGC823 behandlet med A2PP (20 uM), CIP (4 ug /ml), MYCO I (5 ug /ml), eller MYCO II (10 ug /ml) i 72 timer. Middelværdi ± standardafvigelse fra 4 uafhængige forsøg med tredobbelte prøver. (B) RT-PCR-analyse af

ATF5

,

DDIT3

,

CEBPB

i AGS og BGC823 celler behandlet med A2PP (10 uM), CIP (4 pg /ml ), MYCO i (5 ug /ml), MYCO II (10 ug /ml) i 24 timer. Middel ± SD fra 3 eksperimenter med tredobbelte prøver.

Diskussion

Mycoplasma-infektion og forurening er stadig fremherskende i dag og bringe betydelige risici for patienter og kvalitet i forskningen. I de senere år har flere undersøgelser antydet, at mycoplasma-infektion var også forbundet med tumorigenese [3-8]. Mycoplasma-infektion kan forårsage DNA-skader, påvirker genekspression, og forstyrre cellecyklussen checkpoint og apoptotisk respons [30].

M

.

hyorhinis

blev fundet i 56% af gastriske cancere, 55,1% coloncancersygdomme og 39,7% brystkræft væv [20]. Desuden viste serologisk test, at 36% benign prostatahyperplasi (BPH) og 52% prostata cancer væv var

M

.

hyorhinis

positiv [4]. Disse undersøgelser antyder en mulig sammenhæng mellem

M

.

hyorhinis

infektion og forekomsten af ​​tumorer [4,20]. Hvad mere er, i færd med cellekultur, de mest almindelige forureningskilder er mycoplasma, bakterier og mug, men forureningen på mycoplasma er relativt højere [13]. Resultater fra forskellige grupper, har vist, at antallet af forurening med mycoplasma varierede fra 15 til 80%, nogle endda nået 100% [15,31]. En analyse af DNA-sekvenser fra 1000 genomer-projektet underforstået, at 7% af prøverne blev forurenet med mycoplasma [32]. Dermed at forhindre mycoplasmainfektion og kontaminering er vanskelig. For det første på grund af pleomorfe, plasticitet, filtrerbarhed og let opløselighed, kan mycoplasma passere gennem mikrofiltreringsmembran let, hvilket gør dem eksistere på værtscellens overflade eller skal endocytoseres af celler [1,13,33]. For det andet, mycoplasma mangler cellevægge, hvilket gør dem ufølsomme over for antibiotika, som inhiberer cellevægssyntese, såsom penicillin. Effektive antimikrobielle stoffer eksisterer, men deres vedvarende applikationer i cellekultur kan ikke anbefales på grund af toksicitet for cellerne. Endelig mycoplasma er en atypiske bakterier, der forårsager difficulities i korrekt diagnose [34].

er blevet udviklet talrige anti-mycoplasma lægemidler, såsom erythromycin, leucomycin, Roxithromycin, Ofloxacin, og Ciprofloxacin. Men de negative virkninger, toksicitet og modstand stadig bringe problemer for forureningsbekæmpelse [10,11,35-38]. Desuden kunne kontinuerlig administration af disse antibiotika ikke helt eliminere mycoplasma for en eller endda flere uger [39,40]. Derfor er det afgørende at finde nye måder, der kan eliminere mycoplasma infektion eller smitte effektivt og rettidigt. kan sandsynligvis findes Løsningen på dette mål gennem karakterisering af molekylære mekanismer bag mycoplasma infektion.

Vores tidligere undersøgelse viste, at interaktionen af ​​P37 protein med AXNA2 medieret

M

.

hyorhinis

infektion [17]. I denne undersøgelse har vi først syntetiseret den N-terminale polypeptid af ANXA2 (A2PP) og valideret sin specifik interaktion med GST-p37 protein i fast-fase binding og streptavidin pull-down assays. Inspireret af en sådan interaktion, spekulerede vi om A2PP kunne modvirke infektion af

M

.

hyorhinis

. Vi fandt, at A2PP, i en passende koncentration (20 uM), faldt

M

.

hyorhinis

infektion, hæmmet infektion forfremmet migration, og reduceret infektion-provokeret de phosphoryleringer af EGFR og ANXA2 i gastriske kræftceller. Disse effekter blev forbundet med nedsat interaktion mellem P37 og ANXA2. Det skal bemærkes, at A2PP alene udviste minimale virkninger på proliferation af celler og phosphoryleringer af EGFR og ANXA2, hvilket antyder, at A2PP sandsynligvis vil være et nyttigt reagens til at reducere

M

.

hyorhinis

infektion. Dette begreb blev støttet af sammenligninger af A2PP-og kommercielle antibiotika ‘virkninger på celleproliferation og

M

.

hyorhinis

infektion, som viste, at A2PP faktisk havde mindre toksicitet for celler men stærk evne til at modvirke infektion.

På trods at A2PP, en 30 aa polypeptid, kunne falde

M

.

hyorhinis

infektion effektivt, vi stadig nødt til at forstå, om trunkerede former af A2PP kunne opnå lignende anti-

M

.

hyorhinis

evne.