PLoS ONE: Genetiske Variationer i transformerende vækstfaktor Beta Pathway som indikatorer for blærekræft Risk

Abstrakt

Blærekræft er den femte mest almindelige kræftform i USA, og identificere genetiske markører, der kan forudsige følsomhed i højrisiko population er altid nødvendigt. Formålet med vores undersøgelse er at fastslå, om genetiske variationer i den transformerende vækstfaktor-beta (TGF-β) pathway er forbundet med risiko blærekræft. Vi identificerede 356 single-nukleotid polymorfier (SNP) i 37 centrale gener fra denne vej og evalueret deres tilknytning til kræftrisiko i 801 tilfælde og 801 kontroller. Fyrre-én SNPs var signifikant forbundet med kræftrisiko, og efter justering for multiple sammenligninger, 9 forblev signifikant (

Q

-værdi ≤0.1). Haplotypeanalyse yderligere afsløret tre haplotyper inden

VEGFC

to haplotyper i

EGFR

var signifikant forbundet med øget risiko blærekræft i forhold til de mest almindelige haplotype. Klassifikation og regression træ analyse yderligere afsløret potentielle høj-ordens-gen-gen interaktioner med

VEGFC:

rs3775194 være den første split, hvilket tyder på, at denne variant er ansvarlig for den mest variation i fare. Personer, der bærer det fælles genotype for

VEGFC

: rs3775194 og

EGFR

: rs7799627 og varianten genotype for

VEGFR

: rs4557213 havde en 4,22-gange stigning i risiko, en meget større effekt størrelsesorden end den, der ved fælles genotype for

VEGFR

: rs4557213. Vores undersøgelse giver den første epidemiologiske dokumentation for en sammenhæng mellem TGF-beta pathway varianter og blære kræftrisiko

Henvisning:. Wei H, Kamat AM, Aldousari S, Ye Y, Huang M, Dinney CP, et al. (2012) Genetiske Variationer i transformerende vækstfaktor Beta Pathway som indikatorer for blærekræft Risk. PLoS ONE 7 (12): e51758. doi: 10,1371 /journal.pone.0051758

Redaktør: Yan Gong, College of Pharmacy, University of Florida, USA

Modtaget: May 9, 2012; Accepteret: 5. november 2012; Udgivet: 12. december, 2012 |

Copyright: © 2012 Wei et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (U01 CA 127.615, R01 CA 74880, P50 CA 91.846, og R01 CA 131.335) (www.NIH.org). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Blærekræft almindeligvis påvirker ældre og mænd, med en anslået 73,510 nye tilfælde og 14,880 dødsfald i USA i 2012 [1]. Større risikofaktorer for blærekræft omfatter mandlige køn, alder, tobaksrygning, og erhvervsmæssig udsættelse for aromatiske aminer [2]. Det anerkendes i stigende grad, at genetisk modtagelighed kan bidrage til blærekræft carcinogenese [3]. Derfor identificere individer modtagelige for kræft ved hjælp af genetiske markører kan reducere udgifterne til sundhedsvæsenet, øger cost-benefit-screening og overvågning, og forbedre behandlingen og overlevelsen af ​​kræftpatienter.

transformerende vækstfaktor beta (TGF-β) pathway er blevet etableret spille vigtige roller i forskellige cancertyper og impliceret i tumorigenese af blæren overgangsperiode celle karcinom. Mange undersøgelser har indikeret, at TGF-β-signalering bidrager til epitel-mesenchymal overgang, angiogenese, migration, og metastaser i mange typer af maligne tumorer [4] [5], [6]. I normale celler, TGF-β regulerer cellevækst, differentiering, matrixproduktion, og apoptose [7]. TGF-β induceret apoptose ofte medieret af SMAD-afhængige vej, men kan også forekomme gennem både p53-afhængige og p53-uafhængige mekanismer [8], [9], og involverer caspaseaktivering, opregulering af proapoptotiske faktorer (dvs. Bax) og /eller nedregulering af antiapoptotiske faktorer (dvs. Bcl-2 og Bcl-xL) [10] – [12]. Disse faktorer er alle integrerede dele af det humane immunsystem. TGF-β-receptor 1 variant rs11466445 (TGFBR1 * 6A) er blevet forbundet med en øget risiko for bryst- og ovariecancer men ikke colorectal eller blærecancer [13] – [16]. Men en anden undersøgelse om virkningerne af 7 forskellige genetiske varianter i to centrale medlemmer af TGF β sti (

TGFB1

TGFBR1

) og det kliniske resultat af muskel invasiv blærekræft viste, at

TGFBR1:

rs868, der ligger i 3′-utranslaterede region, var signifikant associeret med sygdomsspecifikke dødelighed [17]. Det er også rapporteret, at genetiske varianter i

RUNX3

, en tumor suppressor af TGF β pathway, kan modulere blærekræft risiko [18].

Da TGF-β-vejen spiller en væsentlig rolle i cellulære processer, vi den hypotese, at polymorfismer af TGF-β pathwaygener kan modulere risikoen for blærekræft. For at teste denne hypotese, gennemførte vi en stor case-kontrol undersøgelse for at vurdere virkningerne af single-nukleotid polymorfier (SNP) i vigtige gener fra denne vej. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse for at undersøge sammenhængen mellem en omfattende panel af polymorfismer i TGF-β pathway-gener og blærecancer risiko og identificere undergrupper, der ville være mere tilbøjelige til at have højere kræftrisiko.

Materialer og metoder

Etik Statement

skriftlige informerede samtykke blev opnået fra alle patienter før indskrivning i denne undersøgelse. Undersøgelsen blev godkendt af Institutional Review Boards på MD Anderson Cancer Center, Baylor College of Medicine, og Kelsey-Seybold Clinic.

Undersøgelse Befolkning og dataindsamling

Denne case-kontrol undersøgelse startede patient rekruttering i 1999 og er i øjeblikket i gang. Blære kræftpatienter blev rekrutteret fra University of Texas MD Anderson Cancer Center og Baylor College of Medicine. Sagerne var patienter med nyligt diagnosticeret, histologisk bekræftet blærekræft. Ingen af ​​patienterne havde undergået kemoterapi eller radioterapi før undersøgelsens indskrivning. Der var ingen restriktioner for alder, køn, eller sygdom scenen på rekruttering. De kontrolpersoner var raske personer uden forudgående historie af kræft (bortset nonmelanoma hudkræft). De blev rekrutteret fra Kelsey-Seybold klinik, den største private multispecialty gruppe praksis i Houston hovedstadsområdet. Cases og kontroller blev matchet med hensyn til alder (± 5 år), køn og etnicitet. Alle undersøgelsens deltagere forudsat underskrevet informeret samtykke og afsluttet en 45-minutters in-person interview af uddannede MD Anderson personale interviewere. Efter hvert interview blev en prøve 40 ml perifert blod trukket ind kodede og hepariniserede rør til efterfølgende DNA isolering og analyse. Personer, der havde røget mindre end 100 cigaretter i deres levetid blev defineret som aldrig rygere, personer, som havde røget mere end 100 cigaretter, men havde forladt mere end 1 år forud for diagnosen eller interview blev defineret som tidligere rygere, og enkeltpersoner, der var i færd med at ryge eller havde stoppet mindre end 1 år før blev defineret som rygere. I denne undersøgelse blev der tidligere og nuværende rygere defineret som nogensinde rygere. Da over 90% af vores rekrutteret tilfælde var ren overgangsperiode cellecarcinom, vi kun medtaget denne histologi i undersøgelsen. Da mere end 90% af vores studiepopulation blev selvrapporteret ikke-spansktalende kaukasiere baseres på spørgeskemaet dato, vi begrænset analysen til kaukasiere at begrænse confounding virkning fra befolkningen lagdeling samtidig bevare det meste af den statistiske styrke.

SNP Valg og Genotypning

Et panel af 356 SNPs i 37 gener (tabel S1) blev udvalgt på grundlag af følgende kriterier. Kort fortalt vi udnyttet Ingenuity System Pathway Analysis software (https://www.ingenuity.com) og National Center for Biotechnology Information (NCBI) PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) at opstille en liste over TGF-p pathway-gener. For hvert gen, valgte vi tagging SNPs ved Binning algoritme LDSelect software (https://droog.gs.washington.edu/ldSelect.pl, version 1.0) (r

2 0,8, MAF 0,05) inden 10 kb opstrøms for det transkriptionelle startsted eller 10 kb nedstrøms for det transkriptionelle stop site. SNP frekvens og LD data blev baseret på den internationale HapMap projektdatabase, frigive 22, menneskelige genom build 36. Vi inkluderede også potentielt funktionelle SNPs med mindre allel frekvens (MAF) større end 0,01 i kodningen (synonym og ikke-synonyme SNP’er) og regulatoriske regioner (promotor, splejsning sted, 5′-utranslaterede region, og 3′-utranslateret område). Genotypebestemmelse blev udført ved anvendelse Illumina s iSelect custom SNP-array (Illumina, San Diego, CA). Genotyper blev analyseret og eksporteret ved hjælp af Illumina BeadStudio softwaren. Eventuelle SNPs med et opkald sats 95% blev udelukket fra yderligere analyse

Statistisk analyse

Laboratorie og epidemiologiske data blev lagt sammen, og de fleste blev udført ved hjælp af STATA 10.0 (Stata Corporation, College Station. , TX) og HelixTree (Golden Helix, Bozeman, MT) software. Udlodning af karakteristika i sager og kontroller blev evalueret af χ

2 test (for kategoriske variabler) eller t-test (for kontinuerlige variabler). For hver SNP, vi testede Hardy-Weinberg ligevægt ved hjælp af goodness-of-fit χ

2 test til at sammenligne observeret med den forventede hyppighed af genotyper i kontrolpersoner. Virkningerne af genotyper SNPs om risiko blærekræft blev anslået som odds ratio og 95% konfidensintervaller (95% CI) ved hjælp af multivariat ubetinget logistisk regression under de dominerende, recessive, og additive modeller af arv korrigeret for alder, køn og rygning status , Hvor det er passende. Den bedst passer model var den ene med den mindste

P

værdi blandt de tre modeller. En

Q

-værdi blev beregnet til at redegøre for flere sammenligninger.

Q

-værdien målte andelen af ​​falsk positive afholdt (falsk opdagelse sats), når en SNP vist signifikant. Bootstrap resampling blev udført 100 gange til internt validere resultaterne [19]. Analyse af de kombinerede effekter af ugunstige genotyper involverer en sum af alle risikofaktorer genotyper fra disse SNPs viser statistisk signifikans i de vigtigste analyse (

P

0,05) med lige bidrag fra hver variant. Haplotype analyse blev udført ved anvendelse maksimering algoritme, der implementeres i HelixTree software. Højere-ordens-gen-gen interaktioner blev vurderet ved anvendelse klassificering og regression træ (CART) analyse gennemført i HelixTree software. Alle statistiske analyser var tosidet.

Resultater

Karakteristik af den undersøgte population

Som vist i tabel 1, 801 kaukasiske tilfælde og 801 kaukasiske kontroller blev inkluderet i denne undersøgelse . Der var ingen signifikante forskelle i risiko blærekræft på grund af køn (

P

= 1) eller alder (

P

= 0,051). Som forudsagt, rapporterede tilfælde en højere Antal cigaretter /dag end kontroller (25,6 versus 22,5,

P

0,001). Blandt rygere, tilfælde rapporteret højere pack-års rygning end kontroller (43,0 versus 29,9,

P

0,001). Der var en signifikant forskel mellem cases og kontroller ved at ryge status (

P

0,001) med en højere procentdel af rygere i tilfælde og højere procentdel af aldrig rygere i kontroller (

P

0,05). Blandt de 356 SNPs undersøgte, blev 41 SNPs signifikant associeret med cancer risiko (

P

0,05), og efter justering for multiple sammenligninger, 9 fortsat betydelig, med en

Q

-værdi ≤ 0.1. Disse SNP’er var placeret i tre gener i TGF β vej, herunder

VEGFC

, epidermal vækstfaktor receptor genet (

EGFR

), og

SMAD3

.

til internt validere disse resultater, vi næste udført tilfældige bootstrap prøvetagning af de betydelige SNPs for 100 iterationer og opført det antal gange, at

P Drømmeholdet værdi var 0,05. Otte af disse ni top SNPs havde meget ensartede resultater, med bootstrap

P

værdier 0,05 for mere end 90% af de prøvetagninger (tabel 2)

kumulative virkninger af flere Ugunstige genotyper på. cancer Risk

Fordi unormal TGF-β-signalering kan resultere i aktiveringen af ​​multiple downstream gener og 9 SNP’er nåede statistisk signifikans efter multiple sammenligninger i hovedsagen virkning analyse anvendte vi kombineret analyse at bestemme, om flere ugunstige genotyper i TGF-β vej har en additiv virkning på risikoen blærekræft. Der var en signifikant dosis-respons tendens til øget risiko for blærekræft med stigende antal ugunstige genotyper. Sammenlignet med den følgegruppe bestående af personer med 0~2 ugunstige genotyper, grupperne med 3 eller 4 ugunstige genotyper havde en signifikant forhøjede risici med den yderste periferi på 1,73 (95% CI, 1,28-2,33,

P

0,001) henholdsvis mens højrisikogruppe med 5~9 ugunstige genotyper havde en signifikant forhøjede risici med OR på 2,57 (95% CI, 1,92-3,43,

P

0,001). (

P

trend = 1,07 × 10

-10) (tabel 3)

haplotypeanalyse af VEGFC og EGFR SNPs

Som flere SNPs i

VEGFC

og

EGFR

gener viste signifikante sammenhænge, ​​vi næste udført haplotypeanalyse for 8 top SNPs i disse gener i vores studiepopulation. Vi observerede tre haplotyper signifikant forbundet med blærekræft risiko (tabel 4). Haplotype H7 var sammensat af SNPs rs1485762-rs6828869-rs17697515-rs3775194-rs4557213, og fag der bærer rs1485762 vildtype, rs6828869 variant, rs17697515 vildtype, rs3775194 variant, og rs4557213 vildtype alleler viste en betydelig stigning i risiko 78% (OR, 1,78; 95% CI, 1,13-2,82;

P =

1,4 × 10

-2) sammenlignet med dem, der udfører haplotype H0. Haplotyper H11 andH15 nåede også signifikante sammenhænge med blærekræft risiko med OR på 1,63 (95% CI, 1,09-2,43;

P

= 1,6 × 10

-2) og OR på 1,78 (95% CI, 1,23-2,57;

P

= 2,0 × 10

-3) (tabel 4). Siden tre SNP’er i

EGFR

gen viste signifikante associationer efter flere sammenligninger (

Q

≤0.1, tabel 2), vi også udført haplotypeanalyse for disse tre SNPs i

EGFR

i den samlede befolkning og identificeret to væsentlige haplotyper (

P

0,05) (tabel 5). Haplotype H3 var sammensat af SNPs rs11238349- rs7799627- rs6593205, og fag der bærer rs11238349 vildtype, rs7799627 variant, og rs6593205 variant alleler viste en signifikant 25% reduktion i risiko (OR, 0,75; 95% CI, 0,56-1,00;

P

= 0,05) i forhold til haplotype H0. Haplotypen H4 nåede også en signifikant sammenhæng med risiko blærekræft med en OR på 1,41. (95% CI, 1,09-1,83;

P

= 1,0 × 10

-2) (tabel 5)

højere-ordens Gene-gen interaktioner

Vi næste udforskede højere-ordens-gen-gen interaktioner at afgøre, om et kompliceret samspil mellem disse betydelige SNPs yderligere kunne modulere blærekræft risiko. Den endelige træstruktur identificeret flere potentielle interaktioner blandt de ni SNPs (figur 1).

VEGFC

: rs3775194 blev identificeret som den første split, hvilket tyder på dens vigtige rolle i gen-gen-interaktion og potentialet til at forudsige risikoen for kræft. Den endelige træstruktur identificerede også fire terminal noder med betydeligt højere risiko end lav risiko genetiske profil node 1 (figur 1). Især knude 5 havde en signifikant forhøjede risiko med OR på 3,28 (95% CI, 1,88-5,72), mens knudepunkt 6 havde en endnu højere signifikant forhøjede risiko med OR på 4,22 (95% CI, 1,46-12,17).

Bemærk: Hver node angiver antallet og procentdelen af ​​sager og OR med 95% konfidensinterval i parentes. * Signifikant på

P

. 0,05

Diskussion

Blærekræft fortsat at være en udfordrende sygdom på grund af den høje sats for fornyet og ledsaget høj medicinsk omkostninger. Brug genetiske markører for at bestemme risici kan bidrage til at identificere risici befolkning høj for tidlig screening, diagnostik og behandling, som kan forbedre det kliniske resultat. Dette er den første undersøgelse for at undersøge sammenhængen mellem en omfattende panel af polymorfier af TGF-p pathway-gener og blærecancer risiko og identificere undergrupper, der ville mere sandsynligt har højere risiko for kræft. Vi identificeres og evalueres 356 SNPs i 37 centrale gener fra TGF-β vej for deres foreninger med risiko blærekræft. Vores resultater identificeret 41 SNPs signifikant forbundet med blærekræft modtagelighed, og ni af dem forblev signifikant efter justering for multiple sammenligninger (

Q

≤0.1). Især SNPs i

VEGFC

viste de væsentligste foreninger i enkelt SNP og haplotype analyser. CART analyse yderligere afsløret potentielle høj-ordens-gen-gen interaktioner og kategoriserede emner i forskellige risikogrupper i henhold til deres specifikke polymorfe underskrifter. Vores undersøgelse giver den første epidemiologiske dokumentation for en sammenhæng mellem en omfattende TGF-β pathway SNPs og blære kræftrisiko.

Fem af de øverste ni betydelige SNPs var i

VEGFC

, som er kendt for har vigtige funktioner, der bidrager til blærekræft risiko (tabel 2). VEGFC er medlem af den blodpladeafledte vækstfaktor /vaskulær endotel vækstfaktor (PDGF /VEGF) familie. Dette gen funktioner i angiogenese, lymfangiogenese, endotelcellevækst og overlevelse, påvirker permeabiliteten af ​​blodkar, og også letter nodal metastase. Flere undersøgelser har korreleret forhøjede VEGF udtryk med recidiv eller progression, ofte som en uafhængig prædiktor på multivariate analyse. Der er en positiv sammenhæng mellem

VEGF-C

udtryk og lymfe invasion i patienter med bryst-, mave-, og livmoderhalskræft [20] – [22]. VEGF-C-ekspression blev fundet i cytoplasmaet i overgangs- carcinomceller og var forbundet med lymfeknudemetastaser i blærekræft [23] – [24] og også har vist sig at korrelere med kliniske parametre som tumorstørrelse, patologiske T stadium, patologisk bedømmelse , lymfatisk-venøs involvering, og bækken lymfeknudemetastase i blærecancerpatienter [23]. Haplotypeanalyse yderligere identificeret tre væsentlige haplotyper af

VEGFC

, hvilket tyder på, at haplotype-baseret analyse kan være mere informative end enkelt SNP analyse og igen at sekventere DNA-prøver bærer de høj-risiko og lav risiko haplotyper kan være i stand til at forbedre risikovurdering. De fem mest signifikant (

Q

0,1)

VEGFC

SNP’er vi identificeret er alle beliggende i intron-regionen, som kan bidrage til ændringer i genekspression eller splejsning. Alternativt er det også muligt, at disse SNPs er knyttet til andre kausale varianter i

VEGFC

.

Tre af de ni mest betydningsfulde SNPs var i

EGFR

(tabel 2) . EGFR er en tyrosinkinase transmembranreceptor i ERB familien af ​​receptorer udtrykt på overfladen af ​​epitelceller [25]. EGFR regulerer vigtige processer i carcinogenese, herunder celle overlevelse, tumor invasion, og angiogenese og er involveret i mange maligniteter, herunder blærekræft [26]. EGFR overekspression ofte observeret i tumorer og forstadier til kræft og inducerer tumordannelse i dyreforsøg. EGFR i blærekræft uafhængigt forudsiger sygdomsprogression og dødelighed, og begge VEGF og EGFR dukker op som vigtige mål for behandling af metastatisk blærecancer [25]. . Det er muligt, at disse EGFR SNPs kan påvirke gentranskription, således ændre proteinniveau, eller de kan være knyttet til andre kausale varianter i

EGFR

Derudover har vi også identificeret

SMAD3

: rs12324036 signifikant associeret med kræftrisiko. Det er velkendt, at TGF-β /Activin /Nodal signalering transduceres af SMAD2 og SMAD3 og forøget TGF-β1-niveau kan vende en malign fænotype til en mindre aggressiv fænotype i rotte blærecarcinom-cellelinje som mangler TGF-β1 [27]. Vores tidligere undersøgelse identificerede også

SMAD3

: rs11632964 bliver signifikant associeret med lungekræft samlet overlevelse [28], som også fremhæver den vigtige rolle, SMAD3 i kræft. Det er muligt, at varianten allel af

SMAD3:

rs12324036 kan påvirke gentranskription således ændre proteinniveau. Alternativt kan det være forbundet med andre kausale varianter i

SMAD3

. Samlet set vores undersøgelse fremhæver sammenslutning af

EGFR VEGFC

, og

SMAD3

polymorfier med risiko blærekræft.

Vi anvendte næste en vej tilgang til omfattende vurdere effekten af de ni betydende SNPs (

Q

0,1) om risikoen for blærekræft. Vi identificerede et gen-dosering effekt for de ni SNPs, der var signifikant efter multipel justering sammenligning. Dem med 5~9 risiko genotyper havde den højeste risiko for blærekræft, hvilket tyder på yderligere variationer inden for denne centrale pathway var til skade og havde en større effekt end en enkelt variant. Desuden størrelsen af ​​hver enkelt SNP var beskeden, men risikoen for personer med 08:55 af disse risikofaktorer genotyper var mere end fordoblet. Dette understreger også betydningen af ​​at inddrage flere SNPs inden for en fælles vej for at undersøge fælles virkninger i risikovurderingen.

Inden for rammerne af en vej, vi hypotese, at gen-gen interaktioner vil yderligere modulere risiko for blærekræft . Potentielle gen-gen interaktioner mellem tre varianter blev observeret, med

VEGFC:

rs3775194 være den første splittelse i vores CART analyse, hvilket tyder på dens betydning i fastlæggelsen af ​​den mest variation i fare. Personer, der bærer det fælles genotype for

VEGFC

: rs3775194 og

EGFR

: rs7799627 og varianten genotype for

VEGFR

: rs4557213 havde en 4,22-gange stigning i risiko, en meget større effekt størrelsesorden end den, der ved fælles genotype for

VEGFR

:. rs4557213

sammenfattende har vi udført en sti-baseret analyse af TGF-beta pathway gener og blærekræft risiko. Disse data giver vigtige genetiske information til at forudsige individer med risiko for blærekræft og identificere tumorer i en tidlig, hærdelig fase. Desuden er vores relativt omfattende forespørgsel af TGF-beta pathway polymorfier og vores store befolkning med detaljerede oplysninger risiko giver betydelige beviser for inddragelse af SNPs som prædiktorer eller modulatorer af risikoen blærekræft. Der er dog visse begrænsninger på undersøgelse. F.eks yderligere fin kortlægning og funktionelle assays er nødvendige for at afsløre potentielle molekylære mekanismer i disse SNP’er eller andre forbundne kausale polymorfier. Derudover blev kun kaukasere inkluderet i denne undersøgelse. Det ville være interessant at eksamen disse SNPs i minoritetsgrupper. Endelig, selv om vores data er stort set internt valideret, er der behov for fremtidige replikation studier i uafhængige populationer at validere nogle af resultaterne.

Støtte oplysninger

tabel S1.

udvalgte gener af TGF-β-vejen til denne undersøgelse

doi:. 10,1371 /journal.pone.0051758.s001

(DOC)