PLoS ONE: Altered Plasma Apolipoprotein Ændringer i patienter med kræft i bugspytkirtlen: Protein karakterisering og Multi-Institutional Validation

Abstrakt

Baggrund

Blandt de mere almindelige menneskelige maligniteter, invasivt duktalt carcinom i bugspytkirtlen har de værste prognose. Den dårligt resultat synes at kunne tilskrives svært ved tidlig påvisning.

Metoder

Vi sammenlignede plasma protein profiler af 112 bugspytkirtlen kræftpatienter med de 103 køns- og aldersmatchede raske kontrolpersoner ( kohorte 1) ved hjælp af en nyudviklet matrix-assisteret laser desorption /ionisering (oMALDI) QqTOF (quadrupol tid-of-flight) massespektrometri (MS) system.

Resultater

Vi fandt, at hemi -truncated apolipoprotein AII dimer (ApoAII-2; 17252

m /z

), uglycosylerede apolipoprotein CIII (ApoCIII-0; 8766

m /z

), og deres opsummerede værdi blev signifikant reduceret i pancreas kræftpatienter [

P

= 1,36 × 10

-21,

P

= 4,35 × 10

-14, og

P

= 1,83 × 10

-24 (Mann-Whitney

U

-test); arealet under kurven værdier på 0,877, 0,798, og 0,903 henholdsvis]. Betydningen blev yderligere valideret i alt 1099 plasma /serum prøver, der består af 2 retrospektive kohorter [Kohorte 2 (

n

= 103) og Kohorte 3 (

n

= 163)] og et prospektivt kohorte [kohorte 4 (

n

= 833)] indsamlet fra 8 medicinske institutioner i Japan og Tyskland.

konklusioner

Vi har opbygget en solid kvantitativ MS profilering systemet og brugte det til at validere ændringer af modificerede apolipoproteiner i flere kohorter af patienter med kræft i bugspytkirtlen

Henvisning:. Honda K, Okusaka T, Felix K, Nakamori S, Sata N, Nagai H, et al. (2012) Altered Plasma Apolipoprotein Ændringer i patienter med kræft i bugspytkirtlen: Protein karakterisering og Multi-Institutional Validation. PLoS ONE 7 (10): e46908. doi: 10,1371 /journal.pone.0046908

Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland

Modtaget: 30. maj 2012; Accepteret: September 6, 2012; Udgivet: 8. oktober, 2012 |

Copyright: © Honda et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Program til fremme af grundlæggende Studier i Health Sciences foretaget af Statens Institut for Biomedical Innovation of Japan, Sundhed og Labour Sciences Research Tilskud fra Ministeriet for sundhed, arbejde og velfærd i Japan, National Cancer center for Forskning og Udvikling Fund , og dels af den tyske Research Foundation (DFG) (FE 940 /2-1). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. HK og TS er medarbejderne i Mitsui Viden Industri og YO og NO bruges til tilhører Molecuence Corporation. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om deling af data og materialer. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes andre konkurrerende interesser.

Introduktion

Med en 5-års overlevelse på mindre end 10%, invasivt duktalt karcinom i bugspytkirtlen har den værste prognose blandt de mere fælles humane maligniteter [1], [2], [3]. Den dårlige resultat af pancreas kræftpatienter synes at kunne tilskrives vanskeligheder med tidlig påvisning. De fleste patienter med tidlige fase kræft i bugspytkirtlen har ingen symptomer, og ikke besøge klinikker, indtil sygdommen har udviklet sig til et fremskredent stadium. Fordi kirurgisk resektion er i øjeblikket den eneste helbredende behandling for kræft i bugspytkirtlen, tidlig påvisning før udviklingen af ​​metastaser er afgørende for at forbedre dens udfald. Imidlertid er der ikke påvist screeningsmetode til bugspytkirtelkræft [2]. Enhanced computertomografi (CT) og positronemissionstomografi (PET) er anvendelige til diagnosticering af pancreatiske sygdomme, men disse modaliteter er potentielt farlige og ville sandsynligvis være for arbejdskrævende og cost-ineffektive til masse-screening, på grund af den relativt lave forekomst af kræft i bugspytkirtlen.

den cirkulerende blod proteom lover godt som et reservoir af information, der kunne bruges til diagnosticering af forskellige fysiologiske og patologiske tilstande [4]. Vi har tidligere fundet et plasma biomarkør sæt, der var i stand til at skelne i bugspytkirtlen kræftpatienter herunder med trin I og II sygdom fra raske individer ved massespektrometri (MS) -baserede proteomics [5]. Dog var det ikke muligt at identificere de markørproteiner, og antallet /kilder til sager og typer af sygdom var begrænset [6].

I den foreliggende undersøgelse, vi bestemt aminosyre-sekvenser og modifikationer af markør proteiner og valideret deres betydning i større kohorter. Her rapporterer vi, at de to modificerede former af plasma /serum apolipoproteiner er nedsat hos patienter med pancreas sygdomme.

Materialer og metoder

Patient prøver

Fire kohorter (nemlig Kohorter 1 -4), der består af i alt 1314 plasma eller serumprøver blev indsamlet på følgende medicinske institutioner i to lande (Japan og Tyskland) (tabel S1 og S2):

Kohorte 1.

215 plasmaprøver [køns- og aldersmatchede patienter med histologisk eller cytologisk bevist pancreas duktalt adenokarcinom (

n

= 103) og raske kontroller (

n

= 112)] indsamlet på National Cancer center Hospital (NCCH) (Tokyo, Japan) og Tokyo Medical University Hospital (TMUH) (Tokyo, Japan) fra august 2002 til februar 2005 som tidligere rapporteret [5].

Kohorte 2.

103 plasmaprøver [køns- og aldersmatchede bugspytkirtlen kræftpatienter (

n

= 62) og raske kontroller (

n

= 41)] nyligt indsamlet på NCCH mellem august 2003 og den maj 2005.

Kohorte 3.

163 serum prøver [bugspytkirtlen kræftpatienter (

n

= 52), patienter med kronisk pancreatitis (

n

= 58) og raske kontroller (

n

= 53)] indsamlet ved Institut for General Surgery, University of Heidelberg (Heidelberg, Tyskland) mellem 2003 og 2006 [7], [8].

Kohorte 4.

833 plasma (og serum) prøver indsamlet fremadrettet fra 7 medicinske institutioner i Japan [NCCH, Osaka Rigshospitalet (Osaka, Japan), Jichi Medical School Hospital (Shimotsuke, Japan), Osaka Medical center for Cancer og hjerte-karsygdomme (Osaka, Japan), TMUH, Osaka Medical College Hospital (Osaka, Japan) og Fukuoka University Hospital (Fukuoka, Japan)] mellem august 2006, og oktober 2008 denne undersøgelse. Et dokument beskriver standardprocedurer blev distribueret til hver institut, og alle plasmaprøver blev indsamlet prospektivt under identiske betingelser. Det var en i det væsentlige hospital kohorte bestående af raske frivillige og nytilkomne hovedsageligt gastrointestinale tjenester på de deltagende hospitaler. De endelige diagnoser af patienterne blev indsamlet separat fra deres blodprøver. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hvert emne. Undersøgelsen Protokollen blev gennemgået og godkendt af den etiske komité for hver deltagende institution.

betingelser indsamling og opbevaring (såsom indsamling rør, antikoagulantia, temperatur og antal optøning og nedfrysning cykler) blev holdt strengt identiske blandt plasmaprøver inden for samme kohorte. Tilsyneladende hæmolyserede prøver blev udelukket. Alle prøver blev blindet og randomiseret før MS-analyse (detaljerede procedurer er tilgængelige i Methods S1). Kun plasmaprøver blev anvendt til MS-analyse af Cohort 4. For at sikre reproducerbarhed af målinger blev prøverne i gruppe 4 analyseret uafhængigt af to efterforskningshold på forskellige laboratorier [NCCRI (Tokyo, Japan) og Molecuence Corporation (Yokohama, Japan)] .

Immunopræcipitation og Immunoblotting

Anti-pan ApoAII kanin polyklonale antistof blev købt fra Abcam (Cambridge, UK). Immunpræcipitation blev udført under anvendelse immunaffinitetskromatografi (IAC) protein G-perler (Bruker Daltonics). To kanin polyklonale antistoffer blevet rejst mod ApoAII monomere peptider med -ATQ og -AT C-termini. cDNA-fragmenter af ApoAII (kodende aminosyrer 1-100 og 1-99; NP_001634) blev amplificeret ved PCR og subklonet i pGEX-6P-2 plasmider (GE Healthcare). N-terminalt glutathion S-transferase (GST) -mærket fusionsproteiner blev udtrykt i

Escherichia coli

og affinitetsoprenset på glutathion-Sepharose 4B (GE Healthcare) som beskrevet tidligere [9]. Reaktiviteten af ​​antistoffer med GST-mærkede proteiner blev vurderet som tidligere beskrevet [10].

Proteinprøver blev separeret ved SDS-PAGE og elektroblottet på polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore, Billerica, MA). Blots blev visualiseret med en forøget kemiluminescens-kit (GE Healthcare) og kvantificeret som tidligere beskrevet [11].

CA19-9 Måling

serumprøver i Cohort 4 blev analyseret ved anvendelse af kommercielt tilgængelige kemiluminescens enzymimmunassay kits til CA19-9 (LUMIPULSE Presto CA19-9, Fujirebio Inc., Tokyo, Japan) [5].

Statistik

Statistisk blev påvist signifikante forskelle ved hjælp af Mann-Whitney

U

-, Student

t

– og χ

2 tests. Modtager operatør karakteristiske (ROC) kurver blev genereret og AUC-værdier blev beregnet ved hjælp af StatFlexs software (version 5,0; Artech, Osaka, Japan) og modulerne i R-projektet (https://www.r-project.org/) [5 ], [12], [13].

Resultater

Udvikling af MS Måling med høj reproducerbarhed

Vi har udviklet et plasma protein profilering system ved at ansætte automatiseret hydrofob kromatografi og oMALDI QqTOF-MS. I en kvalitetskontrol forsøg blev 2173 uafhængig lav molekylær vægt (i intervallet 1000-30,000

m /z

) protein toppe opdaget fra en 5-ul prøve af blandet plasma fra raske frivillige. Den gennemsnitlige korrelationskoefficient (CC) værdi for alle 2173 toppe blandt tredobbelte målinger var 0,983 (fig. 1A). Reproducerbarheden af ​​målingen blev yderligere bekræftet ved at beregne Variationskoefficienten (CV) værdier for toppe af interesse (se nedenfor) (fig. 1B).

(A) To-dimensionelle plot analyse, der viser korrelationen af ​​2173 tilsvarende toppe mellem to af de tredobbelte målinger (angivet i rød, blå og grøn) af en standard plasma blanding. Linjer angiver 2-fold forskelle. (B) En standard plasma blanding blev analyseret 24 gange, og CV-værdier [= SD (barer) /middelværdi (søjler)] repræsentative protein toppe (ApoAI, ApoAII-2ox, ApoAII-2, og ApoCIII-0) blev beregnet . (C) Overgang af CC værdier mellem de duplikerede målinger af en standard plasma blanding i de 12 plader (24 målinger) af Kohorte 1. (D og E) Korrelation matrix (D) og distribution (E) af gensidig lighed (CC-værdier) for de 24 dobbelte målinger (1-24) 0,18.

Vi forberedt et stort lager af plasma blanding som en kvalitetskontrol standard, og to portioner af bestanden blev behandlet samtidigt med hver 22 prøveemner . CC værdi standarden blev overvåget for at sikre sammenhæng i måling for hver plade (Fig. 1C-E).

Protein Identifikation af Tandem-massespektrometri (MS /MS)

Kvantitativ plasma MS data blev indhentet fra 103 patienter med kræft i bugspytkirtlen og 112 køns- og aldersmatchede raske kontrolpersoner (Kohorte 1). Vi fandt en 17252-

m /z

MS top (fig. 2, angivet med dobbelt asterisk), der stod som har den højeste statistisk signifikans (

P

= 1,36 × 10

-21, Mann-Whitney

U

-test) (fig. S1). Molekylvægten var næsten identisk med den for et markørprotein vi havde identificeret tidligere ved hjælp af en anden MS-system [5]. MS /MS-analyse og database /litteratursøgning afslørede, at 17252-m /z protein var en heterodimer af ApoAII, en peptidkæde som manglede en glutamin (Q) rest ved C-terminalen (-ATQ /-AT) (dvs. , ApoAII-2) (fig. S2 og S3) [7], [14]. Den oxiderede form af ApoAII-2 (17.269

m /z

, ApoAII-2ox) [14] viste det næsthøjeste statistisk signifikans (

P

= 5,14 × 10

-20) (tabel S3).

(A) Spectra for repræsentative bugspytkirtlen kræftpatienter og kontrol inden for de rammer 16.900 til 17.500

m /z

(øverst) og 8500-9250

m /z

(nederst). (B) Gel-lignende billeder af ApoAII og ApoCIII-0 i Kohorte 1 (215 tilfælde). (A og B) Sorte enkelt stjerne (*), rød dobbelt asterisk (**), sort tredobbelt stjerner (***), og røde firdoble stjerner (****) indikerer MS toppe af ApoAII-1, ApoAII-2 , ApoAII-3, og ApoCIII-0, hhv.

for at bekræfte identiteten af ​​proteinet, vi udført immunopræcipitation med et antistof specifikt for ApoAII, og de immunopræcipiterede proteiner blev analyseret af oMALDI -QqTOF-MS (fig. S4). ApoAII-2 (-ATQ /-AT) og dens oxiderede form (ApoAII-2ox) blev påvist sammen med andre posttranslationelt modificerede former af ApoAII [AII-1 (17380

m /z

) og AII- 3 (17124

m /z

)]. ApoAII-1 er en homodimer af untruncated ApoAII peptider med C-terminale ender af -ATQ /-ATQ. ApoAII-3 er en homodimer af AII peptidkæder, både de C-terminale ender som mangler glutamin (Q) -rester (-AT /-AT) (fig. 3) [14].

(A) Predicted tredimensionelle struktur af dimeriseret ApoAII protein. Modellen blev bygget ved hjælp MOE softwarepakke (Ryoka Systems Inc., Tokyo, Japan). Rød farve indikerer en disulfidbinding. (B) Aminosyresekvenser og beregnede teoretiske molekylmasser på ApoAII homo /heterodimerer (ApoAII-1 til -5). To peptider blev dimeriseret via en N-terminal disulfidbinding.

Et andet protein med en molekylstørrelse på 8766

m /z

også viste en meget signifikant forskel (

P

= 4,35 × 10

-14) mellem bugspytkirtlen kræftpatienter og raske kontrolpersoner (fig. 2, angivet med firdobbelt asterisk). Molekylstørrelsen af ​​proteinet var også næsten identisk med en af ​​4 markørproteiner, som vi havde rapporteret i vores tidligere undersøgelse [5]. MS /MS-analyse (fig. S5) identificerede 8766-

m /z

protein som ApoCIII, som er en 79-amino-syre-glycoprotein kendt for at have tre forskelligt glycosylerede isoformer {uglycosylerede (CIII-0), monosialyated (CIII-2), og disialylated (CIII-2) [15], [16]}, og 8766-

m /z

protein svarer til ApoCIII-0. Identiteten blev bekræftet ved MS-analyse af proteiner immunpræcipiteret med anti-ApoCIII antistof (data ikke vist).

Kombination af ApoAII-2 og ApoCIII-0 og dens Validering

ApoAII-2 og ApoCIII -0 var i stand til at differentiere pancreas kræftpatienter 103 fra 112 raske kontroller (kohorte 1) med et areal-under-kurven (AUC) værdi på 0,877 og 0,798, (fig. 4A og tabel S3). Fordi både ApoAII-2 og ApoCIII-0 blev nedsat i pancreas kræftpatienter og fordelingen var uafhængige af hinanden (fig. S6), enkel summerende af de to biomarkører forbedret AUC værdi til 0,903.

(A og B ) ROC-analyse af ApoAII-2, ApoCIII-0, og deres kombination (ApoAII-2 + CIII-0) i Kohorter 1 (A) og 2 (B). (C) ROC analyse, der viser kapacitet ApoAII-2, ApoCIII-0, ApoAII-2 + CIII-0, og CA19-9 for diskrimination af bugspytkirtlen kræftpatienter fra raske kontroller i den tyske kohorte (Kohorte 3). (D) ROC-analyse af ApoAII-2 + CIII-0 i Kohorte 4 ifølge klinisk fase (Kohorte 4). (E) Fordeling af ApoAII-2 + CIII-0 i henhold til klinisk fase. Linjer angiver medianværdier (Kohorte 4).

Den høje evne ApoAII-2, ApoCIII-0, og deres opsummerede værdi forskelsbehandling (herefter betegnet som ApoAII-2 + CIII-0) mellem kræft i bugspytkirtlen patienter og kontroller blev valideret i en uafhængig kohorte bestående af 41 køns- og aldersmatchede raske kontrolpersoner og 62 bugspytkirtlen kræftpatienter (kohorte 2) (fig. 4B og tabel S3).

for at bekræfte universelle dette diskrimination på tværs af forskellige etniske grupper, vi næste undersøgt 163 serumprøver indsamlet i Tyskland (Kohorte 3) (fig. 4C og tabel S4) [7], [8]. Reduktionen af ​​ApoAII-2 og ApoCIII-0 i pancreas kræftpatienter var tydelig selv i denne kohorte. Imidlertid blev faldet i ApoAII-2 og ApoCIII-0 fundet ikke at være specifikke for kræft i bugspytkirtlen. ApoAII-2 + CIII-0 blev reduceret betydeligt i patienter med kronisk pancreatitis (

P

= 8.86 × 10

-11).

Den gennemsnitlige alder af raske kontrolpersoner i Kohorte 3 ( 39.1 år) var signifikant lavere end den for patienter med kræft i bugspytkirtlen (63,1 år) eller pancreatitis (50,3 år) (tabel S1). Derfor kan muligheden for, at den ekstremt høje værdi af ApoAII-2 (0,958) i denne kohorte skyldes denne aldersforskellen ikke udelukkes.

Prospective Multi-institutionel Validation

plasma- /serum protein profilering ved direkte MS blev indført som et revolutionerende nyt værktøj til biomarkør opdagelse [17], [18]. Imidlertid har sin gyldighed været hyppigt diskuteret [6], [19], primært på baggrund af mulige skævheder i prøvetagning, opbevaring og fryse /optøning, samt dårlig masse nøjagtighed, således at der skabes problemer med identifikation protein. For at sikre, der ikke foreligger nogen prøvetagning bias, vi derefter indsamlet plasmaprøver fremadrettet fra 7 medicinske institutioner i Japan (Kohorte 4) ved hjælp af den samme forudbestemte protokol af blod indsamling, opbevaring og frysning /optøning. Denne multi-institutionelle samarbejde studiegruppe var arrangeret af “Tredje-Term Omfattende Kontrol Research for Cancer” udført af MHLWJ og tilknyttet International Cancer Biomarkør Consortium (ICBC) (https://www.fhcrc.org/science/international_biomarker /) og følger princippet om sondedesign (potentielle prøveindsamling før resultatet konstatering og retrospektiv blindet evaluering).

Alle prospektivt indsamlede prøver blev blindet, randomiseret, og sendes til et laboratorium på Molecuence Corporation. Selv denne uafhængig /blindet validering viste, at bugspytkirtlen kræftpatienter, herunder dem med tidlige fase sygdom, var let skelnes fra raske kontrolpersoner ved hjælp af kombinationen af ​​ApoAII-2 og ApoCIII-0 (ApoAII-2 + CIII-0). de AUC-værdierne for ApoAII -2 + CIII-0 var 0.920, 0,918, og 0,919 for bugspytkirtlen kræftpatienter på kliniske stadier i-II, III-IV, og alle stadier [TNM klassifikation, UICC (International Union mod kræft)] henholdsvis (fig. 4D).

Sammenligning og Kombination med CA19-9

Kombinationen af ​​ApoAII-2 og ApoCIII-0 (ApoAII-2 + CIII-0) var i stand til at opdage 66,1% (160 /242) af pancreascancer patienterne i forhold til raske individer (tabel S5) ved en afskæringsværdi [189 arbitrære enheder (AU)], der var blevet bestemmes vilkårligt at opnå en specificitet på 95% eller højere [97,5% (115/118) ]. Med denne afskæring, følsomheden af ​​ApoAII-2 + CIII-0 blev ringere end CA19-9 [79,8% (193/242)], men specificiteten var bedre end CA19-9 [94,9% (112 /118)], og AUC værdi ApoAII-2 + CIII-0 var næsten lig med den af ​​CA19-9. Men reduktionen af ​​ApoAII-2 + CIII-0 blev ikke påvirket af den kliniske fase af sygdommen, og var påviselig selv hos patienter med trin I pancreascancer (fig. 4E). AUC af ApoAII-2 + ApoCIII0 for trin I pancreascancer (0,868) var højere end den for CA19-9 (0,774) (tabel S5), hvilket antyder den potentielle fordel ApoAII-2 + ApoCIII0 løbet CA19-9 til påvisning af tidlige fase kræft i bugspytkirtlen. Men antallet af trin I bugspytkirtlen kræftpatienter undersøgt i denne undersøgelse var stadig lille (7 sager), og dette spørgsmål er endnu ikke bekræftet.

Det var bemærkelsesværdigt, at 93,4% (226/242) af patienterne med kræft i bugspytkirtlen blev opdaget af enten ApoAII-2 + CIII-0 eller ved CA19-9 uden at kompromittere specificitet for raske personer [93,2% (110/118)]. Endvidere ApoAII-2 + CIII-0 var i stand til at detektere et bredt spektrum af sygdomme i pancreas og hepatobiliære region med en følsomhed på 60% (tabel 1). Men reduktionen af ​​ApoAII-2 + CIII-0 ikke synes at være specifikke for pancreas og hepatobiliære sygdomme. Patienter med esophageal, gastriske og colorektale cancere viste også reduktion af plasma ApoAII-2 + CIII-0 med en frekvens på 36,4% (4/11), 23,9% (34/142), og 32,4% (46/142), henholdsvis.

Lignende signifikans blev reproducerbart opnås ved MS-målinger udført uafhængigt på National Cancer center Research Institute (NCCRI) (fig. 5 og data ikke vist).

Distribution (peak intensitet i arbitrære enheder) (A), spektre af repræsentative sager (B), og ROC-analyse (C) af de angivne modificerede former af ApoAII i Kohorte 4. C, sund kontrol (

n

= 128); P, bugspytkirtelkræft (

n

= 249)

Novel Ændring af ApoAII

De fleste ( 95%). Af cirkulerende ApoAII proteinmolekyler danner N terminalt disulfidbundne dimerer. Ud over de 3 kendte isoformer af ApoAII (ApoAII-1 til -3) [14] vi nyligt identificerede to andre forskelligt modificerede ApoAII dimerer (ApoAII-4 og AII-5) (fig 3 og 5.):

ApoAII-4 (17023

m /z

), som mangler C-terminale glutamin (Q) og threonin (T) rester fra den ene peptid og en glutamin rest fra den anden (-A /-AT) .

ApoAII-5 (16922

m /z

), som mangler C-terminale glutamin og threoninrester fra begge peptider (-A /-A).

ApoAII -1 (intakte ApoAII med -ATQ /-ATQ termini) blev ikke reduceret i bugspytkirtlen kræftpatienter (fig. 5A), hvilket indikerer, at faldet i ApoAII-2 ikke er forårsaget af en simpel reduktion af den samlede protein produktion, men ved protein modifikation . Den specifikke stigning på ApoAII-5 i bugspytkirtlen kræftpatienter viser, at accelereret fordøjelse kan være en af ​​de mekanismer, der er ansvarlige for reduktion af ApoAII-2 (se afsnittet Diskussion).

Produktion af antistof specifikt til ApoAII peptid med en -ATQ eller -AT ende.

for at verificere trunkering af ApoAII hos patienter med pancreas sygdomme, vi nyligt produceret en polyklonale antistof, som specifikt genkender ApoAII peptid med en intakt C-terminal (-ATQ), men ikke, at med et spaltet C-terminus (-AT) (fig. 6A), samt et polyklonalt antistof, der specifikt genkender det Apo-AII-peptid med en spaltet (-AT) C-terminus, men ikke at med en intakt ( -ATQ) C-terminalen (fig. 6B). Salg

(A og B) Reaktivitet af anti-ApoAII (-ATQ) (A) og anti-ApoAII (-AT) (B) peptid-antistoffer med GST tagged ApoAII monomerer bærer -ATQ (GST-ATQ) (aminosyrerne 1-100) og -AT (GST-AT) (aminosyrer 1-99) termini. (C) Ikke-denaturerende immunoblotanalyse af plasma prøver fra raske kontroller (baner af) og repræsentative bugspytkirtlen kræftpatienter (bane gl) med antistoffer mod panden ApoAII protein (øverst), ApoAII (-ATQ) peptid (midten), og ApoAII ( -ATQ) peptid (nederst). En pancreascancer patient (bane i) viser en langsommere migrerende ApoAII proteinet (angivet med ‡), men dens molekylære beskaffenhed skal stadig bestemmes. (D) Gel-lignende billede af oMALDI-QqTOF-MS-spektre i intervallet 16,900-18,100 m /z for repræsentative raske kontroller (baner AF svarende til C) og pancreas kræftpatienter (bane gL svarende til C).

resultaterne af immunoblot analyser ved hjælp af disse antistoffer (fig. 6C) var i overensstemmelse med dem, der opnås ved oMALDI-QqTOF-MS (fig. 6D). I 2 patienter bugspytkirtelkræft (bane g og h), der manglede ApoAII-1 og ApoAII-2, men besad ApoAII-4 og ApoAII-5 (fig. 6D), immunoblotanalyse under ikke-denaturerende (native) betingelser afslørede tab af 17 -kDa ApoAII peptid påviseligt med anti-ApoAII (-ATQ) antistof (midten, fig. 6C), og en hurtigere migrerende (mindre) ApoAII peptid blev påvist med anti-Pan Apo-AII-antistof (top, angivet med en asterisk, fig . 6C).

diskussion

kræft i bugspytkirtlen er en ødelæggende sygdom, men en stor del af patienterne kan helbredes, hvis påvisning er muligt på et tidligt tidspunkt [20], [21]. For at forbedre resultatet af kræft i bugspytkirtlen, etablering af et effektivt screeningsmetode er afgørende. Selvom faldet i modificeret plasma /serum apolipoproteiner rapporteret her er ikke specifik for kræft i bugspytkirtlen, denne test er minimalt invasiv og i den forstand kan anses for anvendelse til primær screening af asymptomatiske patienter med kræft i bugspytkirtlen samt andre gastrointestinale sygdomme blandt generelt (tilsyneladende sunde) befolkning, hvis den efterfølges af en passende anden screening for differentialdiagnose, såsom forbedret CT eller ultralyd [22]. Screening af blod ved MS ville give asymptomatiske patienter med en dyrebar chance for at modtage klinisk opmærksomhed og i sidste ende øge hastigheden af ​​opdagelsen af ​​den tidlige fase kræft i bugspytkirtlen. Men følsomheden og specificiteten af ​​det aktuelle sæt (ApoAII-2 + CIII-0), selv når det kombineres med CA19-9, synes ikke at være tilstrækkelige, og antallet af patienter med tidlige fase bugspytkirtelkræft undersøgt i denne undersøgelse var lille. Det vil være nødvendigt at gennemføre et prospektivt randomiseret forsøg, før en endelig konklusion kan drages om nytten af ​​reducerede ApoAII-2 og ApoCIII-0 i fastsættelsen af ​​kræftscreening.

De fleste tumormarkører udskilt af kræftceller i omsætning viser ikke en signifikant stigning, når kræften er i sin tidlige fase og tumorbelastning i forhold til hele kroppen er lille. Denne karakter af de fleste konventionelle tumormarkører gør deres anvendelse på kræftscreening vanskelig [3], [23]. Men i modsætning til konventionelle tumormarkører, blev de modificerede apolipoproteiner reduceret hos patienter med kræft i bugspytkirtlen og andre gastrointestinale sygdomme. Apolipoproteiner produceres hovedsageligt i leveren, og ApoAII og ApoCIII proteiner sandsynligvis ikke vil blive produceret af kræftceller. Men 17252-

m /z

ApoAII heterodimer med -At /-ATQ C-terminale ender (ApoAII-2) og 8766-

m /z

uglycosylerede ApoCIII (ApoCIII-0) protein viste sig at være faldet mest markant hos patienter med kræft i bugspytkirtlen, herunder dem med debuterende (trin i og II) sygdom. Disse resultater indikerer, at reduktionen af ​​disse specifikke former for apolipoprotein ikke er en følge af nedsat produktion protein grund af destruktion af pancreasvæv, men skyldes visse posttranslationelle mekanismer.

Det er blevet rapporteret, at forhøjet serum carboxyl- og aminopeptidaseaktiviteter generere cancerspecifikke peptidindhold mønstre gennem spaltning af C- eller N-terminale ender af forskellige plasma /serumproteiner [24]. Øget serum carboxypeptidase En aktivitet er blevet rapporteret hos patienter med tidlige fase bugspytkirtelkræft [25]. Syntetisk

N

acetyl-phenyl-L-3-thiaphenylamine er blevet anvendt som et følsomt substrat til måling af aktiviteten af ​​enzymet, men den lille indledende spaltning af en C-terminal glutamin (Q) rest kan prime /bevidstgøre ApoAII protein til yderligere proteolytisk fordøjelse og dermed nedbrydningen /fald i ApoAII-2 kan være påviselig følsomt selv hos patienter med tidlige fase kræft i bugspytkirtlen. Den gensidige forøgelse af ApoAII homodimer med -A /-A ender (ApoAII-5) understøtter dette begreb (fig. 5A). Nogle pancreas cancer patienter udviste endog fuldstændig udtømning af ApoAII-1 og -2 proteiner og fremkomsten af ​​nye ApoAII-4 og -5 proteiner (bane f og g, Fig. 6C og 6D), hvilket indikerer, at forøgelse af proteolytisk spaltning er ansvarlig for reduktionen af ​​ApoAII-2 hos disse patienter.

Der er en svaghed, der skal overvindes, før de nyeste resultater kan anvendes klinisk. Det er almindeligt accepteret, at et fald i niveauet af enhver biomarkør er vanskeligt at anvende som et diagnostisk foranstaltning, fordi en meget reproducerbar målesystem er nødvendig for at undgå falsk negativitet. kan i øjeblikket registreres og kun kvantificeres ved MS De små protein ændringer rapporteret her. Vi konstruerede en robust analytisk system, der anvender automatiseret prøveforberedelse hjælp magnetiske perler [26]. Denne automatisering reducerede udsving i håndtering og anvendelse af ortogonale MS udryddet enhver masse unøjagtighed forårsaget af de lidt ujævne overflader af MALDI plader. Vi har også omhyggeligt fjernet enhver mulig præ-analytisk bias prøveudtagningsmetoder og undgået ved hjælp af komplicerede computing algoritmer. Men MS-baserede protein kvantificering er stadig en kompliceret teknologi til rutinemæssig klinisk brug, og dens anvendelse på kræftscreening kræver yderligere forbedring af robusthed, gennemløb, og omkostningseffektivitet.

I denne undersøgelse succes produceret vi et par antistoffer specifikt genkender intakte ApoAII peptid med en -ATQ endestation og afkortet ApoAII peptid med en -AT endestation (fig. 6). Vi er nu i færd med at etablere en sandwich enzymbundet immunosorbentassay at kvantificere ApoAII-2 heterodimer med en hemi-afkortet C-terminalen (-ATQ /-AT) ved hjælp af disse antistoffer. Vi mener, at perfektion af denne analyse i høj grad vil lette den kliniske anvendelighed af de nuværende resultater.

Støtte Information

figur S1.

Nedsættelse af 17252-m /z peak i patienter med kræft i bugspytkirtlen

doi:. 10,1371 /journal.pone.0046908.s001

(PDF)

Figur S2.

Identifikation af ApoAII-2 heterodimer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0046908.s002

(PDF)

figur S3.

Identifikation af ApoAII-2 heterodimer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0046908.s003

(PDF)

figur S4.

Bekræftelse af protein identitet ved immunopræcipitation og MS

doi:. 10,1371 /journal.pone.0046908.s004

(PDF)

Figur S5.

Identifikation af ApoCIII

doi:. 10,1371 /journal.pone.0046908.s005

(PDF)

figur S6. .

Korrelation af ApoAII-2 og ApoCIII0

doi: 10,1371 /journal.pone.0046908.s006

(PDF)

tabel S1. Salg Kliniske karakteristika for enkeltpersoner i Kohorter 1 til 3.

doi: 10,1371 /journal.pone.0046908.s007

(PDF)

tabel S2. Salg Kliniske karakteristika for enkeltpersoner i Kohorte 4 (n = 833)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0046908.s008

(PDF)

tabel S3.

Reduktion af plasma ApoAII-2 og ApoCIII-0 i patienter med kræft i bugspytkirtlen (Kohorter 1 og 2)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0046908.s009

(PDF)

Tabel S4 .

Validering af ApoAII-2 og ApoCIII-0 i den tyske kohorte (Kohorte 3)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0046908.s010

(PDF)

tabel S5.

Reduktion af ApoAII-2 + ApoCIII-0 i patienter med tidlige fase bugspytkirtelkræft (Kohorte 4)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0046908.s011

(PDF)

Metoder S1 .

doi: 10,1371 /journal.pone.0046908.s012

(PDF)

Tak

Vi takker Drs. T. Yoshida, S. Hirohashi, N. Moriyama, og T. Kakizoe (NCC) for nyttige diskussioner og opmuntring; Ms T. Umaki, og Ms Y. Nakamura (NCC) om assistance Ms C. Ebihara (Molecuence), Mr. T. Goto, M. Kikuchi, M. Hirata (PerkinElmer), Mr. I. Nakajima, Ms Y. Matsuyama (Bruker Daltonics), og Ms. I. Sakurai (Beckman Coulter) til teknisk support; og Mr. T. Hatakeyama (SRL Inc., Tokyo, Japan) til transport af prøverne.