PLoS ONE: Rekruttering og Aktivering af pancreas Stjemeformige Celler fra knoglemarv i kræft i bugspytkirtlen: En model af Tumor-Host Interaktion

Abstrakt

Baggrund og Formål

Kronisk pancreatitis og bugspytkirtelkræft er kendetegnet ved omfattende stjerneformet cellemedieret fibrose, og nuværende terapeutisk udvikling omfatter målrettet kræft i bugspytkirtlen stroma og tumor-vært interaktioner. Nylig dokumentation har antydet, at cirkulerende knoglemarvsceller afledte stamceller (BMDC) bidrager til faste organer. Vi havde til formål at definere den rolle af cirkulerende hæmatopoietiske celler i det normale og syge bugspytkirtel.

Metoder

Hele knoglemarv blev høstet fra mandlige β-actin-EGFP donor mus og transplanteres ind i bestrålede kvindelige modtager C57 /BL6-mus. Kronisk pancreatitis blev induceret med gentagne injektioner af caerulein, mens carcinogenese blev induceret med en intrapankreatiske injektion af dimethylbenzanthracen (DMBA). Fænotype af indpodede donor-afledte celler i bugspytkirtlen blev vurderet ved immunhistokemi, immunofluorescens og

in situ

hybridisering.

Resultater

GFP-positive celler var synlige i eksokrine pancreas epitel fra 3 måneder efter transplantation. Disse udviste acinar morfologi og var positive for amylase og jordnøddeagglutinin. Mus administreret caerulein udviklet kronisk pancreatitis, mens DMBA mus udstillet precursor læsioner og kræft i bugspytkirtlen. Ingen acinære celler blev identificeret til at være donor-afledte efter ophør af cerulein behandling, men i sjældne tilfælde knoglemarv-afledte acinarceller blev observeret under pancreas regenerering. Øget rekruttering af BMDC blev observeret inden for den desmoplastiske stroma, der bidrager til den aktiverede bugspytkirtlen stjerneformet celle (PASC) befolkning i begge sygdomme. Angivelse af stjerneformet cellemarkører CELSR3, PBX1 og GFAP blev observeret i BMD cancer-associerede PaSCs, men cancer-associeret, men ikke pancreatitis-associeret BMD PaSCs udtrykt kræft PASC specifikke markør CELSR3.

Konklusioner

Denne undersøgelse viser, at BMDC kan inkorporere i bugspytkirtlen og vedtage den differentierede tilstand af eksokrine rummet. BMDC der bidrager til den aktiverede PASC population ved kronisk pancreatitis og pancreascancer har forskellige fænotyper, og kan spille vigtige roller i disse sygdomme. Endvidere kan knoglemarvstransplantation være en nyttig model til undersøgelse af tumor-vært interaktioner i kræft og pancreatitis

Henvisning:. Scarlett CJ, Colvin EK, Pinese M, Chang DK, Morey AL, Musgrove EA, et al. (2011) Rekruttering og Aktivering af pancreas Stjemeformige Celler fra knoglemarv i kræft i bugspytkirtlen: En model af Tumor-Host Interaction. PLoS ONE 6 (10): e26088. doi: 10,1371 /journal.pone.0026088

Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland

Modtaget: August 19, 2010; Accepteret: September 19, 2011; Udgivet: 14 oktober 2011

Copyright: © 2011 Scarlett et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Cancer Institute i New South Wales (CINSW), National Health og Medical Research Council (NHMRC) i Australien, The Cancer Råd New South Wales, St. Vincents Clinic Foundation, Royal Australian College of Surgeons, den australske Cancer Research Foundation, og RT Hall Trust. AVB, CJS, DKC, EAM og EKC understøttes af stipendier fra CINSW. RLS er en Senior Principal Fellow af NHMRC og holder Petre formanden for Breast Cancer Research. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen (PC) er fortsat et af de mest ødelæggende kræftformer, og er den fjerde hyppigste årsag til kræft død i vestlige samfund med en overlevelse på mindre end 5% [1]. Intet bortset fra pancreas resektion i en andel af patienter (10-20%), tilbyder nogle helbredende potentiale, med kemoterapeutiske midler opfylder begrænset succes [2]. Kronisk pancreatitis er en væsentlig risikofaktor for udvikling af kræft i bugspytkirtlen, og begge er kendetegnet ved omfattende stjerneformet cellemedieret fibrose, som i tilfælde af pancreascancer letter udviklingen af ​​kræft og metastaser [3], [4]. For nylig, Olive

et al

[5], har vist, at ved at målrette stroma ved anvendelse inhibitorer af hedgehog signalering, forbedrer leveringen af ​​kemoterapeutiske midler til epitel rum af tumoren, og selv om virkningen var forbigående, forbedret samlede effekt. Endvidere Kraman

et al

viste, at målrette specifikke subpopulationer af stromale celler til destruktion kunne fjerne deres hæmmende virkning på værtens immunrespons på tumoren [6].

Observationer gjort i de seneste år har vist, at voksne stamceller har bemærkelsesværdig fleksibilitet i deres differentiering repertoirer. Denne plasticitet giver voksne stamceller, især dem af knoglemarven oprindelse, at indpode alternative ikke-hæmatopoietiske steder og transdifferentiate i celletyper passende til deres nye niche. Dette er især tydeligt, når modtageren orgel er beskadiget [7], [8]. Knoglemarv afledte celler (BMDC) kan enten indpode eller sikring til at vedtage eller omprogrammeres til den differentierede tilstand af den særlige epitel [9] (revideret i [10]). Dette antyder, at den endogene stamcelle af et organ, og dets rolle i vækst og regeneration, er ikke begrænset til hver enkelt organ, men kan være et dynamisk system med cirkulerende BMDC med stamcelletransplantation niche miljøer regulerer rekruttering, proliferation og differentiering [7], [11]. Dette kan have betydelige konsekvenser for udviklingen af ​​kræft i mange solide organer, herunder bugspytkirtlen. Houghton

et al

vist, at i en model af

Helicobacter felis

induceret gastrisk carcinogenese, udvikling af metaplasi og dysplasi var knyttet til engraftment og udvidelse af BMDC befolkning, i sidste ende giver anledning til gastrisk adenocarcinom [12]. Observationer i kvinder, der fik knoglemarvstransplantationer fra mandlige donorer, og som efterfølgende udviklede en kræft, identificeret at myofibroblaster (pancreas stjerneformet celle tilsvarende) inden for disse tumorer blev afledt fra donor knoglemarv [13].

De fleste af tidligere undersøgelser, der vurderer rolle BMDC i bugspytkirtlen regenerering og reparation har koncentreret sig om at genoprette endokrine funktion efter ø-celle skade [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Kun få studier har fokuseret på bidrag BMDC til vækst og regenerering af eksokrine pancreas, eller deres rolle i kræft i bugspytkirtlen. Wang

et al

[22] beskriver bidrag BMDC til pancreas kanalen dannelse i neonatale mus, Marrache

et al

[23], og Watanabe

et al

[24 ] demonstrere i en model af caerulein induceret kronisk pancreatitis, at BMDC bidrage til pancreas stellatum cellepopulation antyder en rolle i vævsreparation, mens mere nylig Pan

et al

[25] identificerede et bidrag BMDC til pancreas stjerneformet cellepopulation i en rottemodel af kemisk carcinogenese.

Her vi genererer en robust model af hele knoglemarvstransplantation at vise, at i pancreas carcinogenese, og i kronisk pancreatitis, BMDC bidrage væsentligt til den aktiverede pancreas stellatum celle (PASC ) befolkning. De, der er forbundet med kræft i bugspytkirtlen udtrykkelige gener er karakteristiske for peritumorale stjerneformige celler i forhold til dem, der ikke er forbundet med malignitet, hvilket tyder på, at BMDC kan spille en vigtig rolle i at støtte bugspytkirtlen carcinogenese. Desuden kan disse modeller af knoglemarvstransplantation vise sig nyttige i at undersøge tumor-vært interaktioner

in vivo

.

Metoder

Etik Statement

Alle dyr arbejde blev godkendt af Garvan Institute of Medical Research /St Vincents Hospital Animal Ethics Committee (protokol # 06/53).

knoglemarvstransplantation

Hele knoglemarv blev høstet fra mandlige C57 /BL6 -TgN (ACTbEGFP) IOsb /J (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA; i det følgende benævnt β-actin-EGFP mus) ved at skylle skinneben og lårben med Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; Invitrogen, Eugene, OR, USA) under anvendelse af en 26G nål. Celler blev filtreret gennem en 70 uM cellefilter, talt, derefter vasket og resuspenderet i PBS. 5 × 10

6 β-actin-EGFP knoglemarvsceller blev transplanteret ind i bestrålede (950 Rad; Gammacell 40 exactor; Nordion International Inc. Canada) modtager 4-8 uger gamle hun C57 /B6 mus via halevenen. Mus blev givet antibiotikum vand (40 mg /5 ml trimethoprim + 200 mg /5 ml sulfamethoxazol) i 14 dage. Mens anvendelsen af ​​et forstærket grønt fluorescerende protein (GFP) er blevet markør af valg for mange typer af celletransplantation og afstamningsceller mærkning eksperimenter, er det ikke klart, at GFP udtrykt i knoglemarvsstamceller fortsat ville blive udtrykt i ikke-hæmatopoietisk væv efter nukleare omprogrammering [26], [27], [28]. Derfor udførte vi køns- forkerte transplantationer til at spore skæbne donor-afledte celler ved hjælp af Y-kromosomet genotypisk markør for at validere resultaterne observeret ved hjælp af GFP reporter.

Normalt Bugspytkirtel

Mus blev aflivet 3 (n = 12), 6 (n = 12), 9 (n = 12) og 12 (n = 11) måneder efter transplantation (figur 1). På hvert tidspunkt blev bugspytkirtlen høstet, halveret og anbragt i enten 10% neutral pufret formalin og derefter indlejret i paraffin, eller indlejret i koldt Tissue-Tek OCT-forbindelse (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA) og hurtigt nedfrosset i flydende N

2. Cellular fænotype af donor afledte celler i bugspytkirtlen blev vurderet ved immunhistokemi, immunofluorescens og

in situ

hybridisering for Y-kromosomet. Til overvågning indpodning af donor β-actin-EGFP knoglemarv, blev perifert blod vurderet for GFP positivitet hjælp fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) ved 1 måned efter transplantation og derefter efter aflivning (tabel 1).

5 × 10

6 knoglemarvsceller fra mandlige β-actin-EGFP-mus blev transplanteret ind letalt bestrålede female C57 /B6 mus. Til vurdering af de normale pancreas, blev pancreas høstet ved 3, 6, 9 og 12 måneder efter transplantation. For kronisk pancreatitis blev mus administreret caerulein intraperitonealt i 10 uger derefter aflivet efter ophør af behandlingen, samt 3, 6 og 9 måneder efter behandling for at vurdere regeneration. For kræft i bugspytkirtlen, efter 1 måned efter transplantation blev musene indgivet en intrapankreatiske injektion af 7,12-dimethylbenzanthracen (DMBA) og aflivet ved 4, 8, 12 eller 12 måneder post DMBA behandlingen, eller når en pancreatisk masse blev detekteret

Kronisk Pancreatitis

En måned efter transplantation, mus injiceret intraperitonealt med 50 ug /kg caerulein (# 152.860, MP Biomedicals Inc., Solon, OH, USA) 5 gange over 4 timer i træk, to gange om ugen i 10 uger som beskrevet tidligere [29]. Mus blev aflivet ved afslutningen af ​​caerulein behandling (n = 8) og 3 (n = 8), 6 (n = 8) og 9 (n = 8) måneder post caerulein behandling for at vurdere pancreas regenerering. En yderligere arm vurderet pancreas regenerering i mus behandlet med caerulein ved 6 måneder efter transplantation og aflivet efter 3 måneder efter ophør af caerulein behandling (n = 4) (figur 1).

Chemical Model af pancreascancer

en måned efter transplantation, blev musene bedøvet med isofluoran og en venstre lateral subcostal snit i bugvæggen blev udført, og milten exteriorised at afsløre krop og hale i bugspytkirtlen. 1 mg /50 pi 7,12-dimethylbenzanthracen (DMBA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) blev opløst i PBS /0,1% TWEEN og injiceret i halen af ​​bugspytkirtlen under anvendelse af en 25G nål som beskrevet tidligere [30 ]. Milt og bugspytkirtel blev returneret til bughulen og bughinden /muskellag og huden blev sutureret lukket. Mus blev aflivet mellem 1-4 (n = 16), 5-8 (n = 6), 9-12 (n = 4) og 12 (n = 2) uger efter DMBA behandlingen, eller når en pancreatisk masse blev detekteret efter abdominal palpation (figur 1). Som med den model af kronisk pancreatitis, en ekstra arm vurderede bidrag BMDC til pancreas carcinogenese efter induktion med DMBA både 6 (n = 10) og 9 (n = 10) måneder efter transplantation.

FACS-analyse

perifert blod og knoglemarvsceller blev analyseret for GFP-ekspression ved hjælp af fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) (tabel 1).

perifert blod.

1 måned efter transplantation og ved offer, blev blod opsamlet via hale bløder og opsamles i BD mikrotainere med lithium /heparin (BD, Franklin Lakes, NJ, USA). 1000 pi FACSlyse (1X) blev derefter tilsat og inkuberet i 10 minutter ved stuetemperatur. Rørene blev centrifugeret ved 1000 g i 5 minutter, supernatanten blev fjernet, og cellerne resuspenderes i 200 pi kold PBS på is indtil analysen.

Bone Marrow.

Knoglemarv blev skyllet fra lårben med transplanterede mus med kold PBS ved anvendelse af en 26G nål, filtreret gennem en 70 uM cellesigte og holdes på is indtil analyse. Fluorescens-cellesortering (FACS) analyse blev udført ved hjælp af en BD FACS CANTO (BD, Franklin Lakes, NJ, USA).

Immunhistokemi /Immunofluorescens /In-situ-hybridisering

Immunhistokemi.

paraffinindlejret pancreas vævssnit (4 um) blev afvokset og rehydreres før H DAKO Corporation). Snit blev derefter inkuberet i 60 minutter med primært antistof (se nedenfor) derefter et mærket polymer peberrodsperoxidase anti-kanin detektionssystem blev anvendt (30 minutter; Envision + anti-kanin; DAKO Corporation) og 3,3′-diaminobenzidin blev anvendt som en substrat. Counter-farvning blev udført med Mayers hematoxylin (DAKO Corporation).

Immunofluorescens.

I immunfluorescensanalyse, 4 um paraffinsnit blev afvokset, rehydreret og antigen hentet som beskrevet ovenfor. Snit blev derefter blokeret med Protein Block (10 minutter), derefter primære antistoffer (se nedenfor) blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur, vasket i DAKO-buffer (3 × 5 minutter) og inkuberet i sekundære antistoffer (se nedenfor) i 1 time ved stuetemperatur. Fluorescerende farvning af apikale membraner i eksokrine acinarceller blev udført under anvendelse rhodamin-konjugeret jordnøddeagglutinin (PNA; 1:200; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Objektglassene blev skyllet derefter modfarvet og monteret i Vectashield hårdt indstillet Mounting Medium med DAPI (H-1500; Vector Laboratories)

primære antistoffer:. GFP kanin polyklonale (A11122; Invitrogen, Eugene, OR, USA; 1: 1000 IHC, 1:200 IF), GFP ged polyklonale (ab5450; Abcam, Cambridge, MA, USA; 1:1000), amylase ged polyklonale (C-20; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA; 1 :200 IF), desmin (Thermo Scientific, Fremont, CA, USA; 1:200 IHC), α-glatmuskelactin monoklonalt muse (klon 1A4, A5228; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA; 1: 1: 500 IHC /IF), vimentin (SP-20; Epitomics, Burlingame, CA, USA; 1:200 IHC), cytokeratin 5/6 (D-13; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA; 1: 100 IHC), glial fibrillært surt protein (GFAP) kanin polyklonalt (Z0334, DAKO Corporation, Carpenteria, Californien, USA; 01:50), præ-B-celle-leukæmi transkriptionsfaktoren 1 (PBX1) kanin polyklonalt (ab12001; Abcam, Cambridge , MA, USA; 1:100), cadherin EGF LAG syv-pass type G receptor 3 (CELSR3) kanin polyklonalt (ab12958; Abcam, Cambridge, MA, USA; 1:100)

sekundære antistoffer:. Anti-kanin Cy5 (1:250; # 711-176-152, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA), anti-ged Cy5 (1:250; # 705-175-003, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA), anti-ged Cy3 (1:500; # 715-166-147, Jackson ImmunoResearch), anti-mus Cy3 (1:500; # 715- 166-150; Jackson ImmunoResearch)

In-situ hybridisering

Hele mus Y-kromosom-probe mærket med fluorescein (Star * FISK, # 1189-YMF-01;.. Cambio Ltd) blev anvendt til 3 um paraffinsnit følgende afparaffinering i xylen, forbehandling med DAKO target Retrieval solution (TRS: 30 min ved 95 ° C), protease-fordøjelse ved 37 ° C i 15 minutter og post-fiksering i neutral bufret formalin i 10 minutter. Hybridisering site blev udvalgt på grundlag af en seriel sektion farvet med H + E. 3,5 pi probe blev påført under en 15 × 15 mm dækglas forseglet med gummi cement. Co-denaturering ved 90 ° C blev efterfulgt af hybridisering natten over ved 37 ° C på en termisk variatorblok. Efter post hybridisering skylninger i 2X SSC /0,3% NP-40 (2 × 2 minutter ved 72 ° C), objektglas blev tørret og modfarvet med DAPI. Signal blev analyseret med en Zeiss Axioscope II mikroskop med digital AxioCam og AxioVision software.

Resultater

Vellykket rekonstituering af knoglemarv i transplanteret mus var påviselig i perifert blod ved 1 måned efter transplantation hjælp FACS-analyse for GFP-ekspression. Desuden blev langsigtet engraftment kontrolleres på tidspunktet for aflivning. GFP positivitet af perifert blod og knoglemarv ved hvert tidspunkt var sammenlignelig med donorens β-actin-EGFP mus (Blood, 70,07% ± 3,90 SEM; Marrow, 30,87% ± 1,60 SEM). (Tabel 1)

BMDC og normale eksokrine pancreas Salg

fra 3 måneder efter transplantation, individuelle, blev donor-afledte GFP-positive celler ses i exokrine pancreas epithelial rum af ikke-behandlet kontrol transplanterede mus (figur 2A). Små GFP-positive celler, som var spindel-lignende, eller immun cellemorfologi forekom spredt interstitium (data ikke vist), mens sjældne forekomster af GFP-positive celler med acinar morfologi var til stede i exokrine rum. Ved yderligere undersøgelse under anvendelse af co-immunofluorescens, disse celler var positive for GFP, amylase og jordnøddeagglutinin (figur 2C, 2D), markører specifikke for pancreatiske acinære celler, hvilket antyder, at BMDC kan inkorporere i den voksne pancreas og vedtage den differentierede tilstand af eksokrine rum. Sammenhængende klynger af 2-3 celler blev observeret fra 6 måneder efter transplantationen, mens lejlighedsvise hele acinære enheder bestående af donor-afledte GFP-positive celler var også tydelig (figur 2B, 2E, 2F).

GFP immunhistokemi af pancreas identificeret person GFP + ve donor-afledte celler med acinar cellemorfologi fra 3 måneder efter transplantation (A), og lejlighedsvis hele acinære enheder (B), blev observeret fra 6 måneder efter transplantation. Immunofluorescens billeder af donors afledt GFP + ve acinære celler co-farvning positiv for både GFP og amylase (C, E); og GFP og PNA (D, F).

BMDC og bugspytkirtlen skade

En eksperimentel arm til at vurdere engraftment af donor BMDC i bugspytkirtlen specifik skade (kronisk betændelse i bugspytkirtlen) og regenerering var også etableret. Efter 10 ugers caerulein behandling, mus havde pancreas, der havde forkrøblede, og peri-acinære fibrose udviklet som en fin meshwork hele eksokrine kirtel. Intra-acinar lumina blev forstørrede. Nogle acinære enheder syntes at udvikle et duktalt fænotype med tab af zymogen granula og mere centralt beliggende kerner. Disse rørformede komplekser bestod af cylindre med en bred lumen foret med et monolag af flade kanal-lignende celler (figur S1B, E) [31], [32]. Kontrol- pancreas var histologisk normal (Figur S1A). Sirius red-farvning af interstitiel collagen var mere fremtrædende i de caerulein behandlede mus, indikerer kronisk skade. Farvning i kontroldyr blev lokaliseret primært omkring kanaler, små blodkar med tynde tråde strækker sig mellem større lobules og ikke omkring individuelle acinære enheder. I caerulein behandlede dyr periacinar collagen forøget, omgivende individuelle acinære enheder, svarende til den fibrose observeret i human kronisk pancreatitis (figur S1D, E).

Ved ophør af caerulein behandling (3 måneder efter transplantation umiddelbart efter skade) der blev forøget BMDC rekruttering til pancreas (figur 3A). Dette omfattede rekruttering af GFP-positive inflammatoriske celler, såsom lymfocytter (positive for CD45-ekspression; data ikke vist) og makrofager, mens nogle BMDC placeret interstitielt var positive for desmin, og spindel-lignende peri-acinære celler besad morfologien af ​​pancreas stjerneformige celler ( PASC s; figur 3C). Ingen acinære celler blev identificeret til at være donor afledt (GFP positive) på dette tidlige tidspunkterne.

Bemærk den øgede tilstedeværelse af GFP-positive celler i interstitium af de tilskadekomne pancreas, herunder inflammatorisk infiltrat (A), når der sammenlignes med det regenererede bugspytkirtlen (B); samt GFP-positive spindel-lignende celler (sorte pile) med en pancreatisk stjerneformet cellemorfologi (C) omgivende acinære enheder (a); (D) Y-kromosom FISH bekræftede minimale bidrag BMDC regenerering af eksokrine parenkym, mens der sås nogle Y positive lymfocytter hele parenkym (hvide pile).

BMDC og bugspytkirtlen regenerering

Efter ophør af caerulein behandling blev dyrene tilbage inddrive at vurdere bidraget af BMDC til pancreas regenerering. Efter 3 måneder på genopretning efter ophør af caerulein behandling, pancreas af behandlede dyr tilbage til en histologisk normal fænotype (figur S1c), der ligner den for ikke-behandlede dyr. En reduktion af interstitiel og periacinar collagen var også synlig (figur S1F). Som for normale bugspytkirtlen, kun sjældne tilfælde af enkelt og små klynger af GFP positive acinarceller viser amylase og PNA positivitet blev observeret, hvilket tyder på, at BMDC kunne vedtage den differentierede tilstand af eksokrine rum i løbet af bugspytkirtlen regenerering. Interstitiel GFP-positive inflammatoriske celler blev formindsket i antal som regenereringstiden forøget (figur 3B). Lignende resultater blev observeret for mus, som blev behandlet med caerulein følgende langsigtede engraftment (6 måneder efter transplantation) og venstre at komme sig.

In situ

hybridisering for Y-kromosomet bekræftet, at der ikke var nogen stigning i bidraget fra BMDC til exokrine bugspytkirtel med regenerering (figur 3D).

BMDC og kræft i bugspytkirtlen

To uger efter injektion af DMBA, rørformede komplekser var til stede fokalt blandt acinære celler med duktalt metaplasi støder op til den normale acinære væv observeret af 1 måned. Fra 1 måned efter DMBA behandling, pancreas precursor læsioner (mPanIN) med varierende grader af dysplasi var til stede. Foci af adenocarcinom i forhold til mPanIN blev set i bugspytkirtlen fra 2 måneder efter DMBA, mens duktalt adenokarcinom (sarcomatoid variant) udviklet på 3-4 måneder (figur S1G-I). Denne fænotype lignede, at set i en lignende model, der anvendes af Kimura et al [30].

Vi vurderede bidrag BMDC til desmoplastiske stroma, især til befolkningen i bugspytkirtlen stjemeformige celler, ved at vurdere samarbejdet ekspression af GFP og den stjerneformede celle selektive markører desmin, glial fibrillært surt protein (GFAP), α-glat muskulatur actin (αSMA), co-ekspression definerer aktiverede stjerneformede celler [3], [33], [34] ( revideret i [35]). Disse markører, oprindeligt identificeret som PASC specifik, bruges til at skelne PASC er fra normale fibroblaster grund af co-ekspression af den mellemliggende filament proteiner desmin og GFAP [33], [34], mens ekspression af αSMA i PASC s oprindeligt blev beskrevet som en kilde til fibrose ved kronisk pancreatitis og kræft i bugspytkirtlen, som betegner aktiveret PASC s [3], [36]. Der var signifikant BMDC rekrutteringen til stroma omkring forstadielæsioner følgende DMBA behandling, med bidrag BMDC til den aktiverede pancreas stellatum cellepopulation (GFP, desmin og αSMA positiv, figur S2A, C, E). Co-immunofluorescensanalyse viste også, at donor-afledte BMDC positive for både GFP og αSMA var til stede i celler støder direkte op til pancreas intraepitelialneoplasi (mPanIN) læsioner (Figur S2B, D, F). Vi har også observeret udviklingen af ​​et stort, dårligt differentieret og invasive cytokeratin positiv /vimentin negativ duktalt adenokarcinom (sarcomatoid) tumor med en signifikant BMDC population (figur 4A, 4B), som omfattede en omfattende donor afledt inflammatorisk infiltrat, demonstrerede hjælp FISH for Y-kromosom (Y-FISH, figur 4C), samt knoglemarv-afledte aktiverede pancreas stjemeformige celler (figur 4D), visualiseret ved co-immunfluorescens af GFP med αSMA (figur 4D). Knoglemarv-afledte epiteliale tumorceller blev ikke set. Vi kvantificeret andelen af ​​BMDC inden tumor mikromiljø i 5 høje power forstørrelse felter (400x) og fastslog, at 41,8% (± 2,77 SEM) af celler knoglemarv afledt (figur 4). Lignende resultater blev observeret, når vi administreret DMBA efter langtidsbehandling engraftment (6 måneder efter transplantation)

(A) H (B) GFP IHC og (C) Y-kromosom FISH demonstrere omfattende knoglemarv afledt cellepopulation i tumoren; (D) Co-immunfluorescens af GFP med αSMA identificeret knoglemarv afledte aktiverede stjerneformede celler i tumor (pilespids).

For nylig Erkan

et al

[37] anvendte udskrift profilering til at identificere markører til at differentiere PASC er forbundet med kronisk pancreatitis versus dem af pancreascancer, med det formål at subtypning PASC s til enten betændelse eller cancer-associeret. Præ-B-celle-leukæmi transkriptionsfaktoren 1 (PBX1) blev opreguleret i inflammationsassocieret PASC er sammenlignet med tumorassocieret PASC s, mens LAG cadherin EGF syv-pass type G receptor 3 (CELSR3) ekspression blev opreguleret i tumorassocieret PASC s sammenlignet til den for inflammation-associerede PASC s [37]. Vi undersøgte 5 sektioner hver fra 3 mus, der udviklede adenocarcinom og observerede, at GFAP, PBX1 og CELSR3 udtryk blev co-lokaliseret med GFP i tumor associeret PASC s (figur S3A, S3B, S3C henholdsvis), og selv om PBX1 (men ikke CELSR3) blev påvist i stroma i pancreatitis, det ikke co-lokalisere med GFAP, hvilket tyder på, at det ikke blev udtrykt i aktiverede stjerneformede celler.

diskussion

Køn-uoverensstemmende hele knoglemarvstransplantationer viste, at BMDC migrere til bugspytkirtlen og udvide som klonede enheder til at vedtage differentierede tilstande af eksokrine rum. Selv om der var minimal rekruttering til acinar cellepopulationen, som steg ikke med skader, regenerering, eller carcinogenese, der var betydelig rekruttering til stroma. Selv om størstedelen af ​​rekrutterede celler under akut skade og cancer var inflammatoriske celler, en andel differentieret i stjerneformige celler. De, der er forbundet med kræft udtrykte markører karakteristisk for tumor-associerede stjerneformede celler tyder de var koopterede, og ændret af tumor mikromiljø.

Mens regenerativ kapacitet opretholdes i den voksne eksokrine pancreas, oprindelsen af ​​regenererende epitel rester uklart [38]. For nylig er en mekanisme af klonal udvikling af pancreas acini blevet beskrevet med beviser, at en enkelt progenitorcelle, hvad enten det er en moden acinært celle eller en multipotent stamcelle, giver anledning til alle exokrine celler i en acinus [39]. Endvidere slægt sporing undersøgelser dokumenterer, at nye acinarceller er genereret ud fra allerede eksisterende acinære celler efter delvis pankreatektomi [40] og caerulein induceret pancreatitis [41]. På baggrund af disse data, og vore observationer i de normale pancreas, vi hypotese, at BMDCs bidrager til regenereringen af ​​exokrine rum. Trods at bruge forskellige skade protokol tidspunkter kunne vi ikke påvise en signifikant stigning i BMDC bidrag til acinære cellepopulation. Y-kromosom FISH data udelukket GFP lyddæmpning [42], [43], [44] som en potentiel årsag til manglende GFP udtryk, og reflekteret GFP positive celle distribution.

PASC s er hjemmehørende myofibroblastlignende celler findes i den periacinar rum eksokrine pancreas, og der er stigende tegn på, at de er centrale deltagere i patogenesen af ​​pancreas exokrine sygdomme, især inden for produktion af rigelige fibrøst stroma, som er en funktion af kræft i bugspytkirtlen [3]. Selv om der var signifikant BMDC rekruttering til det inflammatoriske infiltrat på tidspunktet for pancreas skade i overensstemmelse med tidligere rapporter [45], [46], var forbigående og celletal formindsket over tid til lave niveauer, når regenerering var fuldstændig. Imidlertid stjerneformede celler forblev blandt de resterende population af BMDC. Denne observation tyder på, at BMDC spille en rolle i at støtte den regenererende proces, men ikke omdanne til at bidrage til selve den regenerative epitel. Tumorassocierede BMDC PASC kan blive tilbageholdt i peri-tumorale stroma, mens de, der er forbundet med pancreatitis er ikke. Selv om antallet af knoglemarven afledt PASC var lidt mindre i fastsættelsen af ​​pancreatitis sammenlignet med kræft, ville længere tidspunkter være forpligtet til at afgøre, om BMDC fortrinsvis blev tilbageholdt i bugspytkirtlen i fastsættelsen af ​​kræft.

Som i kronisk pancreatitis, blev der øget rekruttering af BMDC til bugspytkirtlen efter behandling med DMBA. Dette omfattede igen et inflammatorisk infiltrat og aktiveret PASC s. Vigtigere, ekspression af CELSR3 i BMDC forbundet med tumor tyder på, at der var modifikation af disse PASC s ved tumormikromiljøet. Dette understøttes af de seneste undersøgelser, hvor knoglemarv-afledte mesenkymale stamceller fortrinsvis lokalisere til regioner i pancreas tumor vækst [47], og har vist sig at forvandle tumorassocierede myofibroblaster i insulinomer [48]. Bugspytkirtelkræftceller secernerer vækstfaktorer, såsom TGF-β1, PDGF og VEGF samt ekstracellulære matrix (ECM) metalloproteinase induktorer, der transformerer de normalt hvilende PASC s i en aktiveret myofibroblastlignende typen fænotype og udskiller overskydende mængder af ECM og matrix-nedbrydende enzymer [ ,,,0],3], [4], [49] (revideret i [50]). Vonlaufen og kolleger [51] fremlægge dokumentation for en tovejs interaktion mellem tumorceller og bugspytkirtlen stjerneformige celler.