PLoS ONE: Klassificering af epidermal vækstfaktor receptor Gene Mutation status Brug Serum proteomiske Profilering forudser tumorrespons i patienter med trin IIIB eller IV Ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Målsætninger

epidermal vækstfaktor receptor (EGFR)

genmutationer i tumorer forudsige tumor respons på EGFR tyrosinkinaseinhibitorer (EGFR-TKI’er) i ikke-småcellet lungecancer (NSCLC). Men opnåelse tumorvæv for mutationsanalyse er udfordrende. Her har vi til formål at opdage serum peptider /proteiner forbundet med

EGFR

genmutation status, og teste, om en klassificering algoritme baseret på serum proteom profilering kunne udvikles til at analysere

EGFR

genmutation status til støtte terapeutisk beslutningstagning.

patienter og metoder

Serum indsamlet fra 223 trin III B eller IV NSCLC patienter med kendt

EGFR

genmutation status i deres tumorer før behandling var analyseret ved matrix-assisteret laser desorption /ionisering time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF-MS) og ClinProTools software. Forskelle i serum peptider /proteiner mellem patienter med

EGFR

gen TKI-sensitive mutationer og vildtype

EGFR

gener blev påvist i en uddannelse gruppe på 100 patienter; baseret på denne analyse blev et serum proteomisk klassifikation algoritme udviklet til at klassificere

EGFR

genmutation status og testet i en uafhængig validering gruppe på 123 patienter. Sammenhængen mellem

EGFR

genmutation status, som identificeret med serum proteomisk klassificeringen og respons på EGFR-TKI’er blev analyseret.

Resultater

Nine peptid /protein toppe var signifikant forskellige mellem NSCLC patienter med

EGFR

gen TKI-sensitive mutationer og vildtype

EGFR

gener i uddannelsen gruppen. En genetisk algoritme model, som består af fem peptider /proteiner (m /z 4092,4, 4585,05, 1365,1, 4643,49 og 4438,43) blev udviklet fra uddannelsen gruppen at adskille patienter med

EGFR

gen TKI-sensitive mutationer og vildtype

EGFR

gener. Klassificeringen udstillet en følsomhed på 84,6% og en specificitet på 77,5% i valideringen gruppen. I de 81 patienter fra valideringen gruppen behandlet med EGFR-TKI’er, 28 (59,6%) af 47 patienter, hvis matchede prøver blev mærket som “mutant” af klassificeringen og 3 (8,8%) af 34 patienter, hvis matchede prøver blev mærket som ” vilde “opnåede et objektivt respons (p 0,0001). Patienter, hvis matchede prøver blev mærket som “mutant” af klassificeringen havde en signifikant længere progressionsfri overlevelse (PFS) end patienter, hvis matchede prøver blev mærket som “vilde” (p = 0,001).

Konklusion

peptider /proteiner relateret til

EGFR

genmutation status blev fundet i serum. Klassifikation af

EGFR

genmutation status ved hjælp af serum proteomiske klassificeringen etableret i den foreliggende undersøgelse i patienter med stadie IIIB eller IV NSCLC er mulig og kan forudsige tumor respons på EGFR-TKI’er

Henvisning.: Yang L, Tang C, Xu B, Wang W, Li J, Li X, et al. (2015) Klassificering af

epidermal vækstfaktor receptor

Gene Mutation status Brug Serum proteomiske Profilering forudser tumorrespons i patienter med trin IIIB eller IV Ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 10 (6): e0128970. doi: 10,1371 /journal.pone.0128970

Academic Redaktør: Ramon Andrade de Mello, University of Algarve, Portugal

Modtaget: Februar 3, 2015; Accepteret: 21 marts 2015; Udgivet: 5 Juni 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Folkerepublikken Kina (kinesisk National Instrumentation Program, No. 2011YQI70067; webadressen på Funder hjemmeside:. www. most.gov.cn; XQL modtaget finansiering). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [1]. Ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) er den mest almindelige histologiske type af sygdommen og udgør ca. 80% af lungecancere [2]. Fordi mere end 70% af patienter med lungekræft er diagnosticeret med fremskreden fase sygdom [3], systemisk behandling spiller en vigtig rolle i den kliniske behandling. Kemoterapi har været hjørnestenen i behandling for NSCLC i mange år. Men epidermal vækstfaktor receptor tyrosinkinasehæmmere (EGFR-TKI’er), såsom erlotinib, gefitinib og icotinib, har vist, at i høj grad forbedre kliniske resultater og sikkerhed sammenlignet med kemoterapi hos nogle patienter med fremskreden NSCLC [4-8]. EGFR-TKI følsomhed er blevet associeret med aktiverende mutationer i kinase domæne

EGFR

gen, især en

exon 19

sletning og mutationer i

exon 21 (L858R)

og

exon 18 (G719X)

[9-11]. Alle

EGFR

gen TKI-følsomme mutationer resulterer i aktivering af EGFR-tyrosinkinasen domæne, som er målet for EGFR-TKI’er. Derfor patienter med disse

EGFR

gen TKI-sensitive mutationer har en væsentlig bedre respons på EGFR-TKI’er, mens dem med vildtype

EGFR

gener udviser en værre tumor respons. Vurdering af

EGFR

genmutation status er kritisk vigtigt for terapeutisk beslutningstagning.

National omfattende cancer-netværk (NCCN) retningslinjer angiver, at DNA mutationsanalyse i tumorceller er den foretrukne metode til at vurdere

EGFR

genmutation status. Men i nogle tilfælde, tumorvæv enten er utilstrækkelige for molekylær test på grund af sin lille mængde eller meget lavt tumor indhold eller er ikke umiddelbart tilgængelig [3]. har opdaget Flere grupper

EGFR

genmutationer i DNA isoleret fra plasma [3, 12-16] eller serum prøver [17, 18], der tjener som erstatning for tumorvæv; nogle grupper har påvist en sammenhæng mellem mutation status i plasma /serum og tumorvæv [3, 12, 13, 15-18]. Desuden

EGFR

genmutationer fundet i plasma eller serum kan være prædiktiv for svaret på EGFR-TKI’er [3, 13, 14, 16, 18]. Men de metoder, der anvendes til at vurdere

EGFR

genmutation status i plasma eller serumprøver er ikke godkendt af de nuværende retningslinjer. Således andre følsomme og invasive metoder til evaluering

Der er stadig behov EGFR

genmutation status ved hjælp af surrogat tumorvæv at forudsige EGFR-TKI effekt.

Matrix-assisteret laser desorption /ionisering tid-of- flyvning massespektrometri (MALDI-TOF-MS) er en følsom, hurtig, billig og enkel teknik til proteomisk analyse af komplekse biologiske prøver, såsom væv, urin og blod [19-26]. Toppe i massespektret svarer til ioner dannet af forholdsvis rigelige arter i prøven, overvejende peptider og proteiner. For nylig, peptidmassefingeraftryk baseret på MALDI-TOF-MS har været meget anvendt til at detektere diagnostiske, prognostiske og prædiktive proteom biomarkører. I for nylig offentliggjorte undersøgelser har peptidmassefingeraftryk held været anvendt til at analysere serum fra patienter og raske kontroller til at påvise forskelle i peptider /proteiner; Disse forskelle blev brugt til at udvikle klassificering algoritmer til sygdomsdiagnose [22-25]. Desuden kan peptidmassefingeraftryk detektere forskelle i serum /plasma peptider /proteiner mellem undergrupper af patienter med samme type sygdom. Taguchi [26] og Wu [27] anvendes MALDI-TOF-MS analyse serum og plasma fra NSCLC-patienter; de observerede subtile forskelle i serum /plasma peptider /proteiner mellem to undergrupper, der har oplevet markant forskellige EGFR-TKI effektiviteter og udviklet klassificering algoritmer ved hjælp af differentierede peptider /proteiner til at forudsige effekten af ​​EGFR-TKI i NSCLC patienter. Fordi effekten af ​​EGFR-TKI er blevet forbundet med

EGFR

genmutation status, de konstituerende peptider /proteiner af algoritmer serum /plasma klassifikation udviklet af Taguchi og Wu at forudsige EGFR-TKI effekt kan være forbundet med

EGFR

genmutation status [27, 28].

I denne undersøgelse, vi havde til formål at opdage serum peptider /proteiner forbundet med

EGFR

genmutation status og teste om en klassifikation algoritme baseret på serum proteom profilering kunne udvikles til analyse af

EGFR

genmutation status til at hjælpe med terapeutisk beslutningstagning. For at opnå dette, vi anvendte peptid masse fingeraftryk ved hjælp af MALDI-TOF-MS kombineret med ClinProTools software til at analysere serum fra 223 NSCLC patienter med en kendt

EGFR

genmutation status (dvs. bestemt ved forstærkning ildfast mutation systemet [ARMS ] i tumorvæv) og påvise forskelle i serum peptider /proteiner mellem NSCLC patienter med

EGFR

gen TKI-sensitive mutationer og NSCLC patienter med vildtype

EGFR

gener. Vi udviklede en serum proteomisk klassifikatør at evaluere

EGFR

genmutation status og testet klassificeringen på en uafhængig validering gruppe. Vi analyserede også sammenhænge mellem

EGFR

genmutation status som identificeret af serum proteomisk klassificeringen og respons på EGFR-TKI’er at teste potentialet nytte af

EGFR

genmutation status identificeret af serummet proteomiske klassificeringen til forudsigelse af klinisk respons til EGFR-TKI behandling.

patienter og metoder

patienter og prøver

for at være berettiget til undersøgelsen, patienterne skulle have patologisk bekræftet stadie IIIB eller IV NSCLC, en østlig Cooperative Oncology Group performance status på 0 til 2, foruddefinerede

EGFR

genmutation status i tumorvæv baseret på ARMS (skorpioner forstærkning refraktær mutation-system, Qiagen, Tyskland) før behandling og tilgængelig serum. Kun patienter, der behandles på 307 Hospital PLA fra maj 2011 til april 2013, var indskrevet. Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med protokoller, der er godkendt af den lokale etiske komité (de etiske komitéer i 307 Hospital, PLA), og alle patienter forudsat skriftligt informeret samtykke til at deltage i denne undersøgelse og gav tilladelse til brug af deres blodprøver. Til vurderingen tumorrespons, vi evaluerede objektive responser efter 8 ugers behandling på grundlag af computertomografi (CT) scanninger. Tumorrespons blev bestemt ifølge RECIST 1.0. Samlet overlevelse (OS) blev defineret som tiden fra datoen for lungekræft diagnose til dødsdagen. Progressionsfri overlevelse (PFS) blev defineret som tiden fra starten af ​​EGFR-TKI-behandling til datoen for sygdomsprogression eller død uanset årsag. Den skæringsdato for opfølgning var 10. november blev 2014. Rygning Baseret på optegnelser fra patienternes første klinik besøg, og folk, der havde røget mere end 100 cigaretter i deres levetid blev betragtet rygere. Laboratorie data blev opnået og registreres uafhængigt af efterforskere, der var blindet til de kliniske data, indtil analyserne blev afsluttet med biostatistisk.

Halvtreds patienter blev tilfældigt udvalgt fra patienter med

EGFR

gen TKI-følsomme mutationer og vildtype

EGFR

gener henholdsvis (i alt 100 patienter) for at danne træning gruppe til påvisning af forskelle i serum peptider /proteiner mellem NSCLC patienter med

EGFR

gen TKI- følsomme mutationer og NSCLC patienter med vildtype

EGFR

gener, og generation af modellen klassificering, og de resterende patienter dannede validering gruppe til at teste modellen.

patienterne fastet natten over. Alle blodprøver blev indsamlet før patienterne fik førstevalgsbehandling. Blodprøver blev opsamlet i opsamlingsrør vakuum blod indeholdende koaguleringsmiddel og adskillelse gel og centrifugeret ved 3000 rpm i 10 min ved 4 ° C for at adskille serummet. Supernatanten blev opdelt i 100-pi alikvoter og opbevaret ved -80 ° C indtil bearbejdning.

peptidindhold isolation

Serumprøver blev optøet på is og fraktioneret med svag kationbytter magnetiske perler (MB- WCX, Det nationale center for Biomedical Analysis, Kina). Prøverne blev bearbejdet efter tre trin: binding, vask og eluering. For hver analyse 5 pi perler vasket tre gange i 50 pi bindende opløsning (National Center of Biomedical Analysis, Kina), 20 pi bindende opløsning og 5 pi prøve blev tilsat til et Eppendorf-rør og inkuberet i 10 minutter ved stue temperatur. Røret blev anbragt på en magnetisk perle separeringsindretning at isolere samlede peptidindhold. Supernatanten blev fjernet, og perlerne blev vasket tre gange med 100 pi vaskeopløsning (National Center of Biomedical Analysis, Kina) til at skille ubundne proteiner. Endelig blev kuglerne vasket med 20 ul elueringsopløsning (Nationale Center for Biomedical Analysis, Kina) til erhverve bundet proteiner til MALDI-TOF-MS-analyse.

MALDI-TOF-MS-analyse

for MALDI-TOF-MS-analyse, 1 pi peptid eluat blandet 1: 1 (v /v) med en matrix opløsning bestående af mættede α-cyano-4-hydroxy-kanelsyre (α-HCCA, Bruker Daltonics, Tyskland ) i 50% acetonitril (ACN, Sigma-Aldrich, USA) og 0,1% trifluoreddikesyre (TFA, Sigma-Aldrich, USA) blev spottet over på prøve anker pletter af en AnchorChip 600/384 målplade (Bruker Daltonics, Tyskland) og lov til at lufttørre ved stuetemperatur for at lade matrixen krystallisere. ClinProt Peptid Calibration Standard I (Bruker Daltonics, Tyskland), en kommercielt tilgængelig blanding af protein /peptid-kalibratorer, som bestod af angiotensin II (m /z 1,047.19), angiotensin I (m /z 1,297.49), substans P (m /z 1,348.64) , bombesin (m /z 1,620.86), ACTH clip 1-17 (m /z 2,094.43), ACTH clip 18-39 (m /z 2,466.48), og somatostatin (m /z 3,149.57) blev blandet 1: 1 (v /v ) med matrix-løsning, og 0,5 ml blev deponeret på kalibrant anker pletter af AnchorChip target plade til justering af instrumentet.

Massespektrometri analyser blev udført på en Ultraflex III MALDI-TOF-MS (Bruker Daltonics, Tyskland). Driftsbetingelserne var som følger: lineær positiv ion-mode; gentagelseshastighed, 200 Hz; ion kilde spændinger, 25 og 23.50 kV; linse spænding, 6,5 kV; pulseret ion ekstraktionstid, 100 ns. For matrix undertrykkelse, brugte vi en høj gating faktor med signal undertrykkelse af op til 300 m /z. For hvert spektrum blev 3000 skud erhvervet manuelt fra seks tilfældige positioner over overfladen af ​​stedet (dvs. 500 skud pr position). Dataopsamling blev udført ved 43% af den maksimale laserenergi. Hvert spektrum blev eksternt kalibreret. Toppe i m /z vifte af 800-10,000 Da blev registreret med FlexControl købet software v3.4 (Bruker Daltonics, Tyskland).

Bioinformatik

Spectral behandling.

ClinProTools software V2.1 (Bruker Daltonics, Tyskland) blev anvendt til automatisk at behandle MALDI-TOF-MS spektre data ved hjælp af forberedelse af data indstillinger efter følgende standard workflow: Hvert rå spektrum blev normaliseret til den samlede ion strøm; alle spektre blev rekalibreret ved hjælp af de fremtrædende, fælles m /z-værdier; baseline subtraktion, blev udjævning, og topdetektion udført; og toparealerne for hvert spektrum blev beregnet. Signal-støj-forhold blev fastsat til 5 for topdetektion. Peak områder blev beregnet ved hjælp af nul-niveau integration type. Spectra var også ” høj hat “baseline trukket med et minimum baseline bredde sat til 10%, glattet og behandles i 800-10,000 Da rækkevidde.

Træning og klassificering model etablering i uddannelsen gruppen.

Kun spektre fra træning gruppe blev anvendt. Forskelle i peptid toppe mellem patienter med

EGFR

gen TKI-sensitive mutationer og patienter med vildtype

EGFR

gener blev udvalgt ved hjælp toparealer på grundlag af statistiske forskelle. Indbygget matematiske modeller i ClinProTools 2,1 (dvs. genetiske algoritme (GA), overvåget neurale netværk (SNN) algoritme og hurtig klassifikator (QC) algoritme) blev derefter anvendt til at vælge peptidtoppe og oprette klassifikationsmodeller at bestemme de optimale planer adskillelse mellem prøver fra patienter med

EGFR

gen TKI-sensitive mutationer og vildtype

EGFR

gener. Efter hver model blev genereret, blev en tilfældig cross-valideringsprocessen udføres med softwaren, og procent at udelade og antal gentagelser blev sat til 20 og 10, henholdsvis.

For at bestemme nøjagtigheden af klasse forudsigelse model, softwaren kvantificerer krydsvalidering og anerkendelse evne. Krydsvalidering er et mål for pålideligheden af ​​en model og kan bruges til at forudsige, hvordan en model vil opføre sig i fremtiden. Denne metode anvendes til evaluering af udførelsen af ​​en algoritme for et givet datasæt og under et bestemt parametrisering. Anerkendelse kapacitet beskriver udførelsen af ​​en algoritme, dvs den korrekte klassificering af en given datasæt.

Blind test af klassificeringen model, der mest effektivt adskilt prøver fra patienter med

EGFR

gen TKI- følsomme mutationer fra prøver fra patienter med vildtype

EGFR

gener i valideringen gruppen.

Denne validering blev udført i en blændet måde at MALDI-TOF-MS-analyse blev udført, og prøverne var klassificeret før de kliniske outcome data blev stillet til rådighed for efterforskerne.

for hver patient fra validering grupper, blev et tilsvarende spektrum præsenteret for den valgte klassificering model (opkaldt klassificeringen), som derefter returneres en etiket, enten ” mutant “(dvs., klassifikation til klassen bestående af prøver fra patienter med

EGFR

gen TKI-sensitive mutationer) eller” vilde “(dvs. klassifikation til klassen bestående af prøver fra patienter med vildtype

EGFR

gen), eller output et budskab om, at spektret var ufordelt. Resultaterne fra den valgte model klassificering blev sammenlignet med resultater fra ARMS i tumorer at estimere adskillelse effektiviteten af ​​modellen.

Statistisk analyse

De kliniske og sygdom egenskaber mellem forskellige arme, den objektivt respons (ORR) og sygdomsbekæmpelse rate (DCR) mellem patienter, hvis matchede prøver blev mærket som “mutant” og “vilde” blev sammenlignet ved hjælp af en χ

2 eller Fishers eksakte test. Den overensstemmelse mellem ARMS i tumorer og serum proteomisk klassificeringen evaluere

EGFR

genmutation status blev vurderet ved hjælp af en Kappa test. Overlevelseskurver blev estimeret ved Kaplan-Meier-metoden, og forskelle mellem kurverne blev evalueret ved log-rank test. Statistiske analyser blev udført med SPSS software, v19.0 (SPSS Inc., USA). En p-værdi mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Patient Kendetegn

I alt 223 patienter opfyldte indskrivning og blev indrulleret i denne undersøgelse. Baseret på kriteriet om ARMS i tumorer, der var 102 patienter med

EGFR

gen TKI-sensitive mutationer og 121 patienter med vildtype

EGFR

gener. Halvtreds patienter blev tilfældigt udvalgt fra dem med

EGFR

gen TKI-følsomme mutationer og fra dem med vildtype

EGFR

gener (dvs. i alt 100 patienter) at danne uddannelsen gruppen, og de resterende 123 patienter (dvs. 52 patienter med

EGFR

gen TKI-sensitive mutationer og 71 med vildtype

EGFR

gener) dannede valideringen gruppen. De kliniske og sygdomskarakteristika ved alle patienter er anført i tabel 1. Patienterne var afbalanceret mellem uddannelse gruppen og validering gruppen (tabel 2). I uddannelsen gruppen, var der ingen signifikante forskelle mellem patienter med

EGFR

gen TKI-sensitive mutationer og vildtype

EGFR

gener med hensyn til alder, histologiske type, eller sygdom fase, men blev observeret forskelle i køn og rygevaner mellem disse to arme, med flere hunner og mere ikke-rygere i patienter med

EGFR

gen TKI-sensitive mutationer (tabel 3).

Forskelle af toppe i serum mellem patienter med

EGFR

gen TKI-sensitive mutationer og patienter med vildtype

EGFR

gener i uddannelsen gruppe

i alt 129 peptid toppe blev identificeret i spektre af datasættet træning gruppe frembragt af MALDI-TOF-MS, og 9 toppe var signifikant forskellige (p 0,05) mellem patienter med

EGFR

gen TKI- følsomme mutationer og patienter med vildtype

EGFR

gener (tabel 4). To signaler (med m /z 1365,1 og 1866,47) udviste en lavere peak område og syv signaler (med m /z 3315,75, 3883,79, 3956,66, 4092,4, 4585,05, 4643,49, og 5866,96) udviste en højere peak område i patienter med

EGFR

gen TKI-sensitive mutationer sammenlignet med patienter med vildtype

EGFR

gener. Peptid toppe med m /z 4092,4 og 4585,05 udstillet den største forskel i peak områder mellem patienter med

EGFR

gen TKI-sensitive mutationer og patienter med vildtype

EGFR

gener (p 0.00001) . Derfor er disse to toppe (m /z 4092,4, x-akse; m /z 4585,05, y-akse). Blev plottet i en 2D peak fordeling view (Fig 1)

diskriminerende træk ved de to udvalgte peptider var genereret af ClinProTools bioinformatik-software. Værdierne repræsenterer peptid overflod ratio, og disse værdier var signifikant forskellig mellem patienter med

EGFR

gen TKI-sensitive mutationer og patienter med vildtype

EGFR

gener. De ellipser repræsenterer standardafvigelsen af ​​klassen gennemsnit af peak områder /intensiteter.

Klassifikation model etablering

Tre algoritmer, GA (optimeret ved at justere antallet af naboer for en k-nærmeste nabo klassifikation), SNN og QC, blev anvendt til klassificering model konstruktion ved hjælp af spektrale data fra træning gruppen frembragt af MALDI-TOF-MS. Evnen anerkendelse og cross-validering af modellerne er vist i tabel 5, og model GA-7 (opkaldt klassificeringen), der bestod af fem peptid toppe med m /z 4092,4, 4585,05, 1365,1, 4643,49 og 4438,43, udviste bedste effektivitet i at adskille prøver fra patienter med

EGFR

gen TKI-sensitive mutationer og prøver fra patienter med vildtype

EGFR

gener, med en anerkendelse evne på 93,32% og en cross-validering af 81,23% (figur 2).

Blinded test af klassificeringen i valideringen gruppen

klassificeringen blev derefter valideret i en uafhængig validering gruppe af 123 NSCLC patienter i et blindet test (tabel 6). Tre af de 123 prøver gav ufordelt spektre (dvs. en prøve var fra en patient med

EGFR

gen TKI-følsomme mutation, og to var fra patienter med vildtype

EGFR

gener, som bekræftet af ARMS i tumorer). Blandt de 52 prøver fra patienter med

EGFR

gen TKI-sensitive mutationer bekræftet af våben i tumorer, 44 (84,6%) blev mærket som “mutant” af serummet proteomiske klassificeringen; og blandt de 71 prøver fra patienter med vildtype

EGFR

gener bekræftet af våben i tumorer, 55 (77,5%) blev mærket som “vilde” af serummet proteomisk klassificeringen, opnå en samlet nøjagtighed på 80,5%, med en følsomhed på 84,6% og en specificitet på 77,5%, hvilket viste en høj sammenhæng mellem ARMS i tumorer og serum proteomisk klassificeringen evaluere

EGFR

genmutation status (P 0,001; Kappa værdi 0,648; 3 patienter med ugyldige spektre blev udelukket). Men af ​​52 prøver fra patienter med

EGFR

gen TKI-sensitive mutationer bekræftet af våben i tumorer, 7 (13,5%), blev mærket som “vilde” af klassificeringen; på samme måde, af 71 prøver fra patienter med vildtype

EGFR

gener bestemmes af våben i tumorer, 14 (19,7%) blev mærket som “mutant” af klassificeringen.

Korrelation mellem

EGFR

gen TKI-sensitive mutationer identificeret af klassificeringen og den terapeutiske effekt af EGFR-TKI’er i valideringen gruppen

i valideringen gruppen, tre af de 123 prøver gav ufordelt spektre, og de tre tilsvarende patienter blev udelukket fra analysen. Blandt de resterende 120 patienter, 81 havde målbare tumorer og modtaget EGFR-TKI behandling. De kliniske og sygdom kendetegn ved disse 81 patienter er vist i tabel 7, og median follow-up tid af disse patienter var 29,0 måneder (interval, 7,0 til 40,0 måneder). Patienter, hvis matchede prøver blev mærket som “mutant” og “vilde” af klassificeringen udstillet forskellige tumor respons på EGFR-TKI’er; disse responser er anført i tabel 8. Otteogtyve (59,6%) af 47 patienter, hvis matchede prøver blev mærket som “mutant” af klassificeringen og 3 (8,8%) af 34 patienter, hvis matchede prøver blev mærket som “vilde” af klassifikatør udviste en objektiv respons (p 0,0001). Sygdomsbekæmpelse blev bemærket i 41 (87,2%) af 47 patienter, hvis matchede prøver blev mærket som “mutant” af klassificeringen og 12 (35,3%) af 34 patienter, hvis matchede prøver blev mærket som “vilde” af klassificeringen (p 0,0001 ). Kaplan-Meier overlevelsesrater plots af PFS og OS for patienter, hvis matchede prøver blev mærket som “mutant” og “vild” af klassificeringen er vist i figur 3. Den mediane PFS tid for patienter, hvis matchede prøver blev mærket som “mutant” og ” wild “af klassificeringen var 10,0 måneder (95% CI, 9,0 til 10,9) og 2,3 måneder (95% CI, 1,9-2,7), hhv. Patienter, hvis matchede prøver blev mærket som “mutant” af klassificeringen havde en signifikant længere PFS end patienter, hvis matchede prøver blev mærket som “vilde” af klassificeringen (p = 0,001, log-rank test, Fig 3A). Patienter, hvis matchede prøver blev mærket som “mutant” af klassificeringen havde en OS tid på 29,0 måneder (95% CI, 25,2 til 32,8) sammenlignet med 28,0 måneder (95% CI, 17,7-38,3) for de patienter, hvis matchede prøver blev mærket som “vildtype” af klassificeringen. Der var ingen signifikant forskel i OS mellem de to grupper (p = 0,441, log-rank test, fig 3B).

(A) PFS mellem patienter, hvis matchede prøver blev mærket som ” mutant “(n = 47) og patienter, hvis matchede prøver blev mærket som” vilde “(n = 34). (B) OS mellem patienter, hvis matchede prøver blev mærket som “mutant” (n = 47) og “vilde” (n = 34).

Diskussion

Vurderingen af ​​

EGFR

genmutation status i tumorvæv har vigtig prædiktiv værdi og kan bruges til at vælge terapier til behandling af NSCLC. Mange patienter med fremskreden og metastatisk NSCLC er diagnosticeret med små biopsier eller ved fin nål aspiration af tumorer, som ofte giver tilstrækkelig DNA til evaluering

EGFR

genmutation status. Noninvasive metoder til evaluering af

EGFR

genmutation status ved hjælp af erstatninger for tumorvæv vil være af værdi for patienter, hvor tilstrækkelig tumorvæv er ikke tilgængelig [16]. Tabel 9 indeholder oplysninger om de forskellige metoder, der anvendes i tidligere rapporter at opdage

EGFR

genmutationer i serum /plasma prøver [3, 12-18]. Afhængigt af den teknik, overensstemmelsen mellem

EGFR

genmutation status i tumor og plasma /serumprøver varierer fra 66% til 100%, med den højeste korrelation indeks, der rapporteres til denaturering højtydende kromatografi [3], og mutant-beriget PCR [13]. Men disse metoder til vurdering

EGFR

genmutation status i plasma eller serum prøver ikke udbredt til at guide EGFR-TKI-behandling i klinisk praksis på grund af deres ringere følsomhed sammenlignet med resultater fra tumorvæv eller det faktum, at studier undersøger disse metoder har udnyttet små stikprøvestørrelser. I denne undersøgelse fandt vi, at blandt 123 patienter i valideringen gruppen, vurderinger af

EGFR

genmutation status ved hjælp af serum proteom klassificører givet resultater, der var overensstemmende med resultaterne af våben i tumorer i 80,5% af tilfældene, med en høj følsomhed på 84,6%.

Men vi fandt

EGFR

genmutationer, der lykkedes identificeret ved kun én metode (dvs. serum proteom klassificeringen eller ARMS i tumorer) i 17,1% af patienterne i valideringen gruppen (dvs. 11,4% [14/123] af serummet proteomisk klassificeringen kun 5,7% [7/123] af ARMS i tumorer kun). Det er vigtigt at bemærke, at de tilfælde, hvor testresultater var inkonsekvent mellem serum proteomisk klassificeringen og ARMS i tumorer ikke kan betragtes som konventionelle “falske-negative” eller “falske positiver.” En mulig forklaring på denne uoverensstemmelse i bestemmelsen af ​​mutations status er heterogenitet af genetiske abnormiteter i tumorer. I sådanne tilfælde kan tumorbiopisier ikke bære

EGFR

genmutationer identificeret af serum proteomiske klassificeringen fordi disse klassificeringen-udgør peptider /proteiner relateret til

EGFR

genmutation status kunne være afledt af forskellige dele af tumoren. Det lavere tumorcelle indhold i nogle af tumorerne kan også bidrage til den manglende påviselige mutationer. Tilsvarende enten der er lille eller ingen klassificeringen-udgør peptider /proteiner relateret til

EGFR

genmutation status bliver udgydt i blodet i en given sag, eller mængden af ​​peptider /proteiner i serum påvirkes af visse betingelser, såsom inflammation, klassificering af

EGFR

genmutation status baseret på serum proteom profilering kan hindre trods af tilstedeværelsen af ​​mutationer i tumorer.

EGFR, der kodes af vildtype

EGFR

gen er et transmembran tyrosinkinasereceptor med en molekylvægt på 170 kDa. Forskellen mellem EGFR, der kodes af

EGFR

gen med TKI-sensitive mutationer og EGFR kodet af vildtype

EGFR

gen er, at førstnævnte havne aktiverende tyrosinkinasedomæne. Disse to EGFR’er bør have lignende molekylvægte. På grund af den høje molekylvægt, er det vigtigt at bemærke, at MALDI-TOF-MS er beskrevet i denne undersøgelse er hverken egnet til direkte påvisning EGFR kodes af

EGFR

gen med TKI-sensitive mutationer eller EGFR kodet af vildtype -type

EGFR

gen, fordi den typiske observerbare masse interval er fra 800 til 10.000 da. I stedet har vi opdaget de differential peptid /protein-profiler mellem EGFR kodet af

EGFR

gen med TKI-sensitive mutationer og EGFR kodet af vildtype

EGFR

gen. De identitet udgør peptider /proteiner er ukendte på nuværende tidspunkt; Det er muligt, at de er ukendte co-udtrykte peptider /proteiner med lave molekylvægte, der er involveret, eller at vi har registreret fragmenter af EGFR eller andre proteiner med høj molekylvægt, såsom proteiner fra EGFR-signalvejen [29]. Det er velkendt, at tumorcelle formidling og apoptotiske processer i tumorer og ved tumor-væv grænser medfører en ændring i proteolytiske aktiviteter af en række forskellige proteaser, som kan føre til dannelsen af ​​proteinfragmenter, hvilket giver en stærk korrelation med tumorvæv, og at så godt tjene som grundlag for tumor differentiering og prognose [29-32].