PLoS ONE: en retrospektiv undersøgelse på Canine Papillomavirus 1 (CPV1) i Oral onkogenese afslører Hunde er ikke en egnet dyremodel for High-Risk HPV-induceret Oral Cancer

Abstrakt

CPV1 (også kaldet COPV) er en papillomavirus ansvarlig for oral papillomatosis i unge hunde. Inddragelsen af ​​denne viral type oral onkogenese har været en hypotese i orale planocellulære karcinomer (SCCS), men er aldrig blevet undersøgt i andre neoplastiske og hyperplastiske orale læsioner af hunde. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge forekomsten af ​​CPV1 i forskellige neoplastiske og hyperplastiske læsioner for at vurdere dets rolle i hunde oral onkogenese; ifølge de opnåede resultater, et andet formål med undersøgelsen var at definere hvis hunden kan betragtes som en gyldig dyremodel for orale højrisiko HPV-inducerede tumorer. Firs-otte formalinfikserede, paraffinindlejrede (FFPE) hunde orale læsioner, herunder 78 mundtlige tumorer (papillomer, VKF, melanomer, ameloblastomas, oral adenocarcinomer) og 10 hyperplastiske læsioner (gingival hyperplasi) blev undersøgt med immunhistokemi for tilstedeværelsen af ​​papillomavirus L1 protein og med Real-Time PCR for CPV1 DNA. RT-PCR for RNA blev udført på udvalgte prøver. Alle virale papillomer testet var positive for immunhistokemi og Real-time PCR. I 3/33 (10%) SCC’er blev viralt DNA påvist men ingen virale RNA blev fundet. Nr positivitet blev observeret både med immunhistokemi og Real-Time PCR i de andre hyperplastiske og neoplastiske læsioner i mundhulen hos hunde. Selvom konstateringen af ​​CPV1 DNA i få SCC i ansigtet af en negativ immunhistokemi kunne støtte hypotesen om en mislykket infektion i udviklingen af ​​disse læsioner, fraværet af virus-RNA påpeger, at CPV1 mere sandsynligt repræsenterer en uskyldig tilskuer i SCC onkogenese. Undersøgelsen viser en stærk forbindelse mellem CPV1 og mundtlige virale papillomer hvorimod viral bidrag til patogenesen af ​​andre orale læsioner forekommer usandsynligt. Desuden er det tyder på, at en hund model af CPV1 infektion for HPV-induceret onkogenese kunne være uhensigtsmæssig

Henvisning:. Porcellato I, Brachelente C, Guelfi G, Reginato A, Sforna M, Bongiovanni L, et al. (2014) en retrospektiv undersøgelse på Canine Papillomavirus 1 (CPV1) i Oral onkogenese afslører Hunde er ikke en egnet dyremodel for High-Risk HPV-induceret Oral Cancer. PLoS ONE 9 (11): e112833. doi: 10,1371 /journal.pone.0112833

Redaktør: Xuefeng Liu, Georgetown University, USA

Modtaget: 9. juni 2014, Accepteret: Oktober 16, 2014; Udgivet: November 17, 2014

Copyright: © 2014 Porcellato et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Papillomavirus (PV) er en gruppe af virus, der tilhører den

papillomaviridae

familie, der er meget artsspecifik, der kan påvirke pattedyr, fugle og krybdyr [1] . PV’er har en cirkulær dobbeltstrenget DNA-genom på ca. 8 kb i størrelse, der typisk indeholder otte ORF’er (åbne læserammer), kodning tidligt (E1, E2, E4, E5, E6 og E7) og sene (L1 og L2) virusproteiner [ ,,,0],2], [3]. E1 er et DNA helicase essentiel for replikation og opformering af det virale episom i kernen af ​​inficerede celler [4]. E2-proteiner deltager i initieringen af ​​virus-DNA-replikation, men er centrale for transkriptionel regulering og fordeling af viralt genom samt [5]. E6 og E7 oncoproteiner er ansvarlige for celleproliferation og transformationsprocesser, med E7 blive anerkendt som en af ​​de mest effektive cellecyklus deregulator [6]. E4 sammen med E5, er involveret i reguleringen af ​​virale genom forstærkning og repræsenterer den mest rigelige udskrift i produktive læsioner [7], [8]. Sene proteiner (L1, L2) koder for de strukturelle proteiner af viral capsid, som er grundlæggende for gennemførelsen af ​​PV livscyklus [8]. HPV’er (Humane papillomavirus) inddeles i kutane og slimhinder typer baseret på deres tropisme til hud eller slimhinde epitel henholdsvis og kan enten fortsætter asymptomatisk eller forårsage godartede hyperproliferative sygdomme eller maligniteter [2], [9]. Slimhinde HPV’er kan underinddeles i høj-risiko og lav risiko typer med hensyn til deres forening til kræft udvikling [10]. Denne klassificering blev oprindelig kun baseret på epidemiologiske data og senere bekræftet med yderligere dokumentation fra in vitro-analyser [11]. Mere end 170 typer af HPV er blevet identificeret hidtil, mens kun 14 typer CPVs (Canine Papillomavirus) i hunde medicin er kendt på dette tidspunkt [12], [13]. Rolle CPVs i patogenesen af ​​cancer er ikke klart belyst og ingen af ​​de hunde virale typer er blevet forbundet til en bestemt cancer enhed. Tværtimod i humanmedicin den onkogene rolle højrisiko HPV typer såsom HPV 16 og HPV 18 er velkendt og betragtes at bidrage til over 70% af livmoderhalskræft [14]. For nylig er HPV-infektion også blevet forbundet med hoved- og halscancer, især med pladecellecarcinom i oropharynx [15], [16]. Hos hunde, den første PV typen dokumenteret er den ætiologiske agent for hunde oral papillomatosis, oprindeligt kaldt COPV (Canine Oral Papillomavirus) og for nylig omdøbt CPV1 [2], [17]. DNA’et af dette virus er 8607 basepar lang og derfor er den største PV sekventeret [18]. Selvom arrangementet i CPV1 genomet er magen til de andre PV’er, mangler det den E5 regionen, og det er kendetegnet ved en lang sekund ikke-kodende region [19]. Canine oral papillomatosis forårsaget af CPV1 er hyppigere hos hunde på ca. et år og typisk forårsager blomkål-lignende eksofytiske vorter; lejlighedsvis, kan tumorer også frynsede eller nodulær. Læsioner normalt lokaliseret på mundslimhinden, læber og slimhinder vejkryds, men er ikke begrænset til disse websteder [17]. De gennemgår sædvanligvis spontan regression, der er associeret med en fremherskende infiltration af CD4 + og CD8 + lymfocytter [20]. Selvom CPV1 typisk er relateret til godartede og spontant regression papillomer er denne viral form blevet lejlighedsvist rapporteret i ikke-regression læsioner, især i mundtlige og perioral planocellulært karcinom [21], [22]. I de sidste par år har tilstedeværelsen af ​​HPV-DNA blevet bredt undersøgt og demonstreret i forskellige orale tumorer, såsom pladecellecarcinom [23], ameloblastoma [24], spytkirtel carcinom [25], [26], samt i kutant melanom [27] og andre tumorer [28], [29], [30]. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge forskellige hunde orale tumorer og hyperplastiske læsioner for tilstedeværelse af CPV1 DNA og RNA samt virusantigen lokalisering i læsioner. Vurdering viral udbredelse i orale neoplastiske begivenheder i hunde kunne give vigtig indsigt om potentielle rolle denne specifikke virale type hunde oral onkogenese og om nytten af ​​hunde model til oral HPV-induceret onkogenese menneskehandel. Denne undersøgelse blev udført på tumorer af epitel oprindelse, såsom pladecellecarcinomer, ameloblastomas og orale adenokarcinomer. En gruppe af melanomer, som er de mest almindelige og invasive oral cancer i hunde, blev også behandlet i denne undersøgelse. Da det er almindeligt accepteret, at solceller er afhængige af epitheldifferentiering for afslutningen af ​​deres livscyklus [8], denne undersøgelse omfattede også en gruppe af gingival hyperplastiske læsioner. Rutinemæssig histologi, immunohistokemi og Real-Time PCR blev anvendt i denne undersøgelse. Vores undersøgelse fokuserede på den rolle, CPV1 i mundtlig onkogenese gennem retrospektive immunhistokemiske og molekylær analyse af en bred vifte af neoplastiske og ikke-neoplastiske orale læsioner.

Materialer og metoder

Etik redegørelse

Denne retrospektivt studie blev udført på FFPE eksemplarer tidligere sendt til vores afdelinger for histopatologisk diagnose og derfor var det ikke nødvendigt godkendelse fra etisk udvalg.

Sample udvælgelse og histopatologi

Toogtyve papillomer (Ps), 33 planocellulært karcinom (SCCS), 11 melanomer (MS) 10 ameloblastomas (AMS), 2 mundtlige adenocarcinomer (ACS) og 10 tilfælde af gingival hypertrofi /hyperplasi (GH), indsamlet data fra 2005 til 2012, blev udvalgt fra arkiverne hos Institut for Veterinær Medicin (University of Perugia, Italien), og for det Naturvidenskabelige Veterinary Medicine (University of Teramo, Italien). Diagnosen blev revideret af 2 patologer på hæmatoxylin-eosin dias. Papillomer blev efterfølgende klassificeret i virale papillomer (VPS) og planocellulære papillomer (SPS). VP blev diagnosticeret på basis af tilstedeværelsen af ​​typiske histologiske træk er indikative for virale cytopatiske virkninger såsom epitelproliferation, koilocytose, hypergranulosis, hyperkeratose og tilstedeværelsen af ​​inklusionslegemer.

Immunhistokemi

Sektioner af 2 um blev skåret fra 88 formalinfikserede og paraffinindlejrede (FFPE) prøver og monteret på positive ladede dias. Immunhistokemi blev udført under anvendelse af et kanin-polyklonalt antistof mod stærkt konserveret L1 capsidprotein af BPV1 (1:200 fortynding; Anti-bovint papillomvirus /BPV1, BO580 DakoCytomation, Glostrup, Danmark), som rapporteret i andre undersøgelser [31]. Kort fortalt blev FFPE vævssnit afparaffineret, rehydreret og vasket i destilleret vand. Intet antigen hentning blev udført. Endogen peroxidase blev blokeret med 3% H

2O

2 i 8 minutter ved stuetemperatur. Objektglas blev derefter vasket i TBS og inkuberet med det primære antistof i 1 time i et fugtigt kammer ved stuetemperatur. Objektglas blev inkuberet med sekundært biotinyleret universal sekundært antistof, efterfulgt af sekventiel inkubation med peroxidase-mærket streptavidin (LSAB + /System-HRP, Dako, Glostrup, Danmark). Tre-amino-ni-ethylcarbazol blev anvendt som chromogen (AEC + substrat-kromogen Klar-til-brug, Dako, Glostrup, Danmark) og Carazzi hematoxylin som kontrastfarve. Dækglas blev monteret med vandigt monteringsmedium. Negative kontroller blev behandlet på samme måde, dog udelades det primære antistof og inkubering vævssnit med TBS. Positive kontroller blev opnået fra bovine kutane papillomer

Primere design

Sonder blev designet på den rapporterede sekvens af CPV1. [GenBank: L22695.1] især om fire mål ORF’er: E4, E7, L1 og L2. Blandt tidlige virale produkter, blev E4 valgt som et målgen grund af dets høje ekspression (op til 30% af det samlede proteinindhold i nogle produktive vorter) i produktive læsioner og E7 grund af dens anerkendte onkogene rolle [6], [7 ]. L1 og L2, de sene proteiner, blev medtaget på grund af deres centrale rolle i færdiggørelsen af ​​PV virale cyklus [8]. Til påvisning af hvert viralt gen, forward og reverse primere og prober blev designet (tabel 1). Sonder til E4, E7 og L1 var også velegnet til virus-RNA detektion. De designede primere blev verificeret ved NCBI blast analyse og ClustalW tilpasning analyse for at sikre specificiteten.

Nukleinsyre ekstraktion

DNA og RNA-ekstraktion blev udført fra 5 um paraffinsnit med en kommerciel kit ifølge producentens instruktioner (Wizard Genomisk DNA oprensningskit, Promega, Milano, Italia og RECOVERALL Total Nucleic Acid Isolation kit, Ambion, Austin, Texas). Totalt DNA og RNA blev kvantificeret med et fluorometer (qubit 2,0, Invitrogen, Carlsbad, Californien) ved anvendelse af en high-sensibilitet kommercielt kit (qubit’en dsDNA HS eller RNA HS Assay Kit, Invitrogen, Carlsbad, Californien) ifølge producentens instruktioner.

Reverse Transcription

Ca. 20 ng af total RNA blev revers transkriberet i 20 pi iSCRIPT cDNA (BioRad, Hercules, CA) under anvendelse af vilkårlige hexamerer ifølge producentens forslag. Ingen-RT kontroller blev inkluderet for at kontrollere for genomisk DNA-kontaminering.

DNA og cDNA Real-Time PCR

Ifølge producentens forslag, 4 pi DNA (30-50 ng) eller 4 pi af cDNA (1-10 ng) blev amplificeret under anvendelse 12,5 pi Hot-Rescue Real-Time Master mix (Diatheva, Fano, Italien), 0,125 pi Hot-Rescue DNA Polymerase (Diatheva Fano, Italien), 5 pmol af sonde , 10 pmol af primere (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) og DNAse /RNAse-frit vand til 25 uL. Alle PCR-reaktioner blev udført på en Bio-Rad iCycler Real-Time PCR med en initial inkubation ved 95 ° C i 15 minutter, efterfulgt af 45 cykler ved 95 ° C i 15 sek og 60 ° C i 1 min, i løbet af hvilken fluorescensdata blev opsamlet. Hver prøve blev kørt tredobbelt, og resultaterne blev beregnet. Den Ct blev automatisk beregnet af hver kurve. Prøve amplifikation fidelity blev verificeret ved agarosegelelektroforese. PCR-produkterne blev oprenset og sekventeret ved QIAquick PCR Purification Kit (Quiagen, Valencia, CA). De 18S blev anvendt som endogen kontrol at normalisere prøve variationer i mængden af ​​udgangsmateriale RNA-prøver som tidligere beskrevet [32]. For hver PCR-kørsel, blev der ikke skabelon kontroller og Nort kontroller inkluderet for at fastslå fraværet af forurenende gDNA.

Resultater

Histologi og immunhistokemi

Med histologisk undersøgelse på rutinemæssigt farvede snit blev papillomer klassificeret i VPS (15/22) og SP’er (7/22) evaluering af tilstedeværelsen af ​​karakteristiske cytopatiske træk af PV-infektion (epidermal spredning, koilocytose, hypergranulosis hyperkeratose og inklusion organer) (Figur 1). Et tilfælde med mild hypergranulosis og fokal hyperkeratose var vanskeligt at klassificere på grund af manglen på inklusionslegemer og Koilocytter. Men efter seriel sektionering blev lejlighedsvise Koilocytter observeret, og sagen blev klassificeret som en VP. Histologiske karakteristika SP’er og VPS er vist i tabel S1. Positiv intranucleær immunfarvning bekræftede alle VPS tidligere diagnosticeret på HE farvede sektioner (figur 2). Positive celler blev lokaliseret især i interdigiterende epidermis og ofte i områder, hvor epitelet var karakteriseret ved alvorlig hypergranulosis. Kun i ét tilfælde blev immunomærkning overvejende ses i overfladiske desquamating celler. Alle de andre tumorer og hyperplastiske læsioner var negative for PV immunfarvning. Ikke desto mindre blev en fint granulært cytoplasmatisk farvning påvist i fem tilfælde af SCC’er

H 40x

AEC og Carazzi hematoxylin.; 40x.

Real-Time PCR-amplifikation af DNA og RNA

DNA-ekstraktion udbytte varierede fra 50 til 90 ng /pl og RNA-koncentrationen var omkring 20 ng /pl. Bekræftelse af de immunhistokemiske resultater, Real-Time PCR påvises viralt DNA i alle 15 VPS. VPS var positive for alle de fire sonder specielt designet til detektion af CPV1. Tre SCC’er af 33 resulterede positive for tilstedeværelsen af ​​CPV1 DNA med alle fire testede prober. Ingen overlapning med de fem SCC’er med fint cytoplasmatisk immunfarvning blev dokumenteret. Sekventering af alle ampliconer demonstrerede en fuldstændig identitet (100%) med sekvensen i GenBank-databasen (accession nummer L22695.1). Ingen viralt DNA blev amplificeret i samtlige AMS Ms, ACS og GH testet. Real-Time PCR for cDNA blev udført på et udvalg af 5 VPS 5 SP’er, 8 VKF, 3 som var dem positive for CPV1 viralt DNA. Kriterierne for udvælgelse af de prøver, der skal testes var baseret på tilgængeligheden af ​​materiale til RNA ekstraktion, efter tidligere tests var blevet udført. I de 3 tilfælde af SCC positive for viral DNA, blev mængden af ​​væv begrænset ( 1 mm

2 sektioner). I disse tilfælde totalt mRNA mængden var meget lav (ca. 1 ng /pl) på grund af knappe tilbageværende væv efter tidligere test. Virale papillomer blev anvendt som en positiv kontrol og viral mRNA blev hentet i dem alle. De tre SCC’er positive for viral DNA var stedet negative. Ekstraktion af RNA og assay forsøg blev gentaget to gange for at vurdere resultatet og udelukke miljøforurening. Resultater af Real-Time PCR er vist i tabel 2.

Histologiske karakteristika CPV1-associerede SCC’er

Undersøgelsen af ​​CPV1 positiv SCC viste ikke ejendommelige histologiske karakteristika, der kunne være mistænksom af papillomvirus infektion, sammenlignet med gruppen af ​​CPV1 negative SCC’er (tabel S2).

diskussion

den foreliggende undersøgelse evaluerede tilstedeværelsen af ​​CPV1 i forskellige hyperplastiske /neoplastiske hunde orale læsioner, med henblik på at undersøge den rolle af dette virus i oral onkogenese. I human medicin har oncogenetic rolle højrisiko-HPV’er blevet påvist for livmoderhalskræft [16] og mere bevidsthed vokser for deres rolle i patogenesen af ​​hoved og hals SCC’er [15]. Den stigende Vederlaget til studiet af solceller i veterinærmedicin er begrundet såvel den voksende opmærksomhed for dyresundhed og ved muligheden for at bruge hunden som en eksperimentel model til at studere samspillet mellem PV-infektion og carcinogenese hos mennesker [33], [ ,,,0],34]. På trods af dette, få oplysninger om forekomsten af ​​CPVs i hunde tumorer. Med denne undersøgelse vi påpegede, at CPV1 er stærkt forbundet med VPS i hunde i mundtlige og perioral sites. Desuden observerede vi tilstedeværelsen af ​​viralt DNA kun i tre SCC’er, hvorimod ingen viralt mRNA viste sig at demonstrere viral aktivitet. Dette resultat bekræfter, hvad der er beskrevet i den veterinære litteraturen [22], [35] om den lave potentielle af malign transformation forbundet med CPV1 infektion. Baseret på vores data, bør hunden ikke anvendes som model for studiet af maligne læsioner forårsaget af højrisiko-genotyper af HPV’er.

Resultater opnået fra den histologiske evaluering af alle de orale papillomer indgår i den foreliggende undersøgelse viste, at koilocytose og hypergranulosis var mere tydelig i VPs forhold til SP’er. Men viste 2/7 SP’er mild eller moderat hypergranulosis, så dette morfologiske aspekt alene ikke kan betragtes som en pålidelig indikator for virusinfektion. Ifølge vores resultater, tilstedeværelsen af ​​Koilocytter og inklusionslegemer udgør den vigtigste histopatologisk tegn på viral tilstedeværelse. Immunhistokemi var nyttigt, ikke kun for at bekræfte den histologiske klassifikation og vurdere den fase af infektion, men var særlig hjælpsom i tilfælde af sen fase PV infektion, hvor koilocytose og inklusionslegemer ikke var tydelig histologisk. I disse tilfælde blev immunolabeling begrænset til desquamating celler i epidermis. Det cytoplasmatiske positivitet stødt i fem SCC’er, især i områder med pladedifferentiering, blev fortolket som et artefakt, på grund af det faktum, at disse tumorer var negative for DNA-amplifikation.

Real-Time PCR bekræftede tilstedeværelsen af ​​både CPV1 DNA i alle de 15 VPS af undersøgelsen og af viral mRNA i de fem udvalgte testede VPS. Dette bekræfter en stærk sammenhæng mellem CPV1 og VPS. I vores undersøgelse var de fleste VPS detekteret på mukokutane kryds og kun ét tilfælde blev biopsi fra huden af ​​hagen, efter aftale med tidligere undersøgelser rapporterer den mulige tilstedeværelse CPV1 i kutane læsioner [17], [22], [36]. CPV1 synes derfor at vise en mindre markant tropisme for slimhinderne i forhold til Alpha-HPV’er, som omfatter høj-risiko typer. Alpha-HPV- infektioner faktisk er generelt begrænset til mundslimhinden og kan sjældent findes i kutane læsioner [37], [38], [39].

På trods af fraværet af PV-immunomærkning, PCR afslørede tilstedeværelsen af viralt DNA i 3/33 SCC’er testet. Denne begrænsede antal CPV1 DNA positive tilfælde ikke tillader os at drage statistisk signifikante konklusioner om mulige histomorfologiske kriterier der kan være forbundet med tilstedeværelsen af ​​virus. Hver af de tre sager viste forskellige histologiske grader af differentiering, cellulære atypi og inflammation. Værd at bemærke er, at søgningen efter viral mRNA i disse tre SCC’er positive for CPV1 DNA ikke give positive resultater. Forskellige hypoteser kan gøres for at retfærdiggøre dette resultat. Først og fremmest mængden af ​​materiale fra FFPE biopsier af SCC var yderst begrænset, når skåret til RNA ekstraktion og dette kan have resulteret i en for lav mængde af viral mRNA på total mRNA udvundet, ikke at tillade forstærkning af Real-Time PCR. På den anden side, da positivitet for viral mRNA blev fundet i alle VPS anvendt som en positiv kontrol, kan vi antage, at CPV1 kunne fortolkes som en uskyldig tilskuer i forbindelse med SCC. Selvom sund hud af mennesker og hunde kan fungere som en potentiel reservoir for PV-infektion [40], [41] eksemplarer af denne undersøgelse tidligere var blevet behandlet med formalin, derfor forekommer usandsynligt hypotesen om en overfladisk forurening.

En negativ PV-immunomærkning forbundet med negative Real-Time PCR-resultater (både for viral DNA og mRNA) i alle de andre læsioner (hyperplastiske og neoplastiske) inkluderet i denne undersøgelse tyder på, at CPV1 har sandsynligvis ingen rolle i patogenesen af ​​hunde oral læsioner forskellige fra VPS.

Som konklusion med dette studie undersøgte vi rollen som CPV1 i en bred vifte af forskellige neoplastiske og hyperplastiske læsioner opstår i mundhulen hos hunden. CPV1 blev stærkt forbundet med VPS. Da tilstedeværelsen og den transkriptionelle aktivitet af CPV1 kun har vist sig for VPS synes det usandsynligt, at CPV udgør en høj risiko for neoplastisk progression. Ud over at udvide antallet af testede for tilstedeværelse af CPV1 tilfælde vil det være vigtigt at undersøge den rolle, andre typer CPVs i patogenesen af ​​de mest almindelige cancertyper i mundhulen hos hunde. I betragtning af vores resultater, mener vi, at CPV1-inducerede læsioner har en lav risiko for ondartet progression og at brugen af ​​CPV1 som en model for HPV-associeret hoved- og halskræft derfor ikke understøttes af vores data, især da forekomsten af ​​CPV1 i den testede SCC’er var meget lav.

Støtte oplysninger

tabel S1.

Histologiske karakteristika for de 22 squamous og virale papillomer i denne undersøgelse. Funktioner af forskellige tumorer blev gradueret: 1 = svag /mild; 2 = moderat; . 3 = høj /alvorlig

doi: 10,1371 /journal.pone.0112833.s001

(DOCX)

tabel S2. Salg Histologiske karakteristika for de 33 SCC’er af denne undersøgelse. IB = inklusionslegemer; IHC = immunhistokemi. Funktioner af forskellige tumorer blev gradueret: 1 = svag /mild; 2 = moderat; 3 = høj /svær. Immunhistokemi analyser med en usikker resultat (?) Blev klassificeret som negative og usikre positivitet stødt blev betragtet som et artefakt. N /A = ikke udført på grund af ringe materiale til rådighed for RNA-ekstraktion

Doi:. 10.1371 /journal.pone.0112833.s002

(DOCX)

anerkendelser

Forfatterne vil gerne takke Dr. Emilia del Rossi og Luca Stefanelli for deres indsats og teknisk support til denne undersøgelse.