PLoS ONE: En TRIP230-retinoblastoma Protein Complex Regulerer Hypoxi-Inducerbar Factor-1α-medieret transskription og Kræft Cell Invasion

Abstrakt

Lokaliseret iltsvind i solide tumorer aktiverer transkriptionelle programmer, der fremmer den metastatiske transformation af celler. Ligesom hypoxi-inducerbar hyper-vaskularisering, tab af retinoblastomproteinet (Rb) er et træk fælles for fremskredne stadier af tumorprogression i mange metastatiske cancere. Imidlertid er der etableret nogen forbindelse mellem den rolle, Rb og hypoxi-drevne metastatiske processer. Vi påviste, at Rb er en vigtig mediator af den hypoxiske respons medieret af HIF1α /β, master regulator af hypoxi reaktion, og dets væsentligste co-aktivator, thyreoidea hormon receptor /retinoblastoma-interagerende protein (TRIP230). Desuden, tab af Rb afslører den fulde co-aktivering potentiale TRIP230. Brug små hæmmende RNA tilgange

in vivo

, vi konstateret, at Rb dæmper den normale fysiologiske respons på hypoxi ved HIF1α. Især tab af Rb resulterer i hypoxi-afhængig biokemiske ændringer, der fremmer erhvervelsen af ​​en invasiv fænotype i MCF7 brystcancerceller. Desuden Rb er til stede i HIF1α-Arnt /HIF1β transskriptionelle komplekser forbundet med TRIP230 som bestemt ved co-immunopræcipitation, GST-pull-down og chip assays. Disse resultater viser, Rb er en negativ modulator af hypoxi-reguleret transkription i kraft af dens direkte virkninger på HIF1 kompleks. Dette arbejde er den første forbindelse mellem den funktionelle ablation af Rb i tumorceller og transkriptionel aktivering og invasion HIF1α-afhængige

Henvisning:. Labrecque MP, Takhar MK, Jagdeo JM, Tam KJ, Chiu C, Wang TY, et al. (2014) En TRIP230-retinoblastoma Protein Complex Regulerer Hypoxi-Inducerbar Factor-1α-medieret transskription og Cancer Cell Invasion. PLoS ONE 9 (6): e99214. doi: 10,1371 /journal.pone.0099214

Redaktør: Sonia Rocha, University of Dundee, Storbritannien

Modtaget: Marts 5, 2014 Accepteret: 12. maj 2014 Udgivet: 11 juni 2014

Copyright: © 2014 Labrecque et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle data er inkluderet i manuskriptet

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af driftstilskud fra den canadiske Breast Cancer Foundation BC /Yukon (https://www.cbcf.org/bc/Pages/default.aspx ) og naturvidenskab og teknik Forskningsråd, RGPIN 356.355 (https://www.nserc-crsng.gc.ca/index_eng.asp) i Canada til TVB. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hypoxi inducerbare faktor-1α (HIF1α), dens ortholog HIF2α, og deres dimerisering partner aryl hydrocarbon receptor nukleare translokatoren, (Arnt eller HIF1β), som udgør HIF1 kompleks [1], [2] regulerer en celles respons på betingelser med lav oxygen. I sundt væv, den HIF1 kompleks dirigerer bestilt og stramt reguleret ekspression af gener styrer

de novo

syntese af ny vaskulatur til at understøtte vækst af væv eller væv re-perfusion. Under hypoxi, HIF1α akkumuleres, translokerer til kernen, og binder Arnt. De HIF1 komplekse rekrutterer co-aktivatorer, herunder CBP /p300 [3], og Brm /Brg-1 [4] og aktiverer ekspressionen af ​​gener, såsom vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF), erythropoietin (EPO), og de metastatiske markører, CXCR4 og procollagen lysylhydroxylase 2 (PLOD2) [1], [5], [6]. Tyder på, at den HIF1 komplekset kan aktivere genekspression selvstændigt eller sammen med andre transkriptionsfaktorer [7], [8]. Påvisning af, at HIF1α er stand til at interagere med c-Myc, Notch og for nylig FOXA2 til direkte bestilte transkription og forbedre tumordannelse [9] – [11] åbner mulighed at HIF1 komplekset er en kerne transkriptionsenhed som modulerer multiple intracellulær signalering netværk, hvoraf mange kan være involveret i metastatisk transformation. Således er mange af de molekyler, der styrer forskellige aspekter af HIF1 funktion er endnu ikke identificeret.

HIF1 kompleks udfører denne funktion ved at rekruttere transskriptionelle co-aktivator-proteiner, herunder thyroid hormon receptor /retinoblastoma-interagerende protein- 230 (TRIP230) til de regulerende regioner af hypoksi-responsive gener for at aktivere transkription [12]. TRIP230, blev oprindeligt identificeret som en thyroid hormon receptor (TR) -interacting protein, forbedret TRs aktivitet [13]. Desuden har TRIP230 blevet isoleret som en del af p160 co-aktivator-kompleks [14], en bona fide ARNT co-aktivator-kompleks [15]. Vigtigere er, har vi vist, at TRIP230 ansættes af Arnt som en transkriptionel co-aktivator og det er vigtigt for den transkriptionelle aktivitet af HIF1 komplekset [12]. Endvidere blev det vist, at TRIP230 interagerer med Rb og at Rb svækker TRIP230-forstærket TR-drevet transkription [16]. Dette og en efterfølgende undersøgelse viste, at kun den hyper-phosphorylerede form af Rb interagerer med TRIP230 [17] fremhæve en funktion for Rb adskilt fra sin kanoniske E2F-afhængig regulering af cellecyklus, specifikt til sin hypo-phosphorylerede form.

tab af

RB1 ​​

, det gen, der koder for Rb [18], og eller tab af funktion af Rb er forbundet med udvikling og metastatisk progression af mange andre faste tumorer, herunder kræft i æggestokkene, lunge, bryst, prostata og hjerne [19] – [23]. Den bedst forstås funktion af Rb er den for cellecyklus regulator undertrykke E2F transkriptionsfaktor funktion derved mediere celleproliferation og differentiering [24]. Hypo-phosphoryleret Rb blokerer cellecyklusprogression ved binding til E2F transkriptionsfaktorer og påvirker E2F-afhængige transkriptionelle resultater. Det gør den ved at rekruttere kromatin-remodeling transskriptionsrepressor proteiner såsom Sin3a /b, HDAC, SUV39H1 og DNMT1 [25] – [27]. Hyper-phosphoryleret Rb ikke undertrykke E2F’ere og giver dem mulighed for at aktivere eller undertrykke forskellige genekspression programmer [24].

Nylige undersøgelser tyder på, at Rb kan have fysiologiske roller ud over sin kanoniske E2F funktion [28]. Tidligere viste vi en direkte interaktion mellem TRIP230 og Arnt [12]. Derudover demonstrerede vi, at TRIP230 var nødvendig til transkription medieret af to forskellige dimeriseringsindretninger partnere Arnt, nemlig aryl- carbonhydrid-receptoren og HIF1α [12]. I denne rapport, giver vi de første beviser for eksistensen af ​​en Rb-TRIP230-Arnt kompleks, der medierer HIF1 transskription. Derudover viser vi, at Rb dæmper aktiviteten af ​​Arnt transskriptionelle komplekser i kraft af sin tilknytning til TRIP230 og uafhængig af E2F. I sidste ende, dette værk afslører evne Rb at modulere HIF1-aktiveret genekspression med konsekvenser for kræft celle transformation.

Resultater

HIF1-reguleret genekspression forstærkes af siRNA Knock-down af Rb

TRIP230 er kendt for at binde direkte til TR og Arnt [12], [16]. Eftersom hyper-phosphoryleret-Rb undertrykker TRIP230 co-aktiveret TR-aktivitet [16], [17], og at TRIP230 ekspression er nødvendig for transkriptionel aktivitet af Arnt partnere, AHR og HIF1α [12], vi hypotese, at Rb kan dæmpe hypoxia- inducerbar gentransskription. For at undersøge, hvilken rolle Rb på akkumulering af hypoxi-inducerbare målgen mRNA arter, vi forarmet Rb i humane kræftceller ved siRNA-medieret gen

knock-down

. MCF7 og LNCaP-celler blev transficeret med enten krypteret (SCX) styrer siRNA eller to Rb-specifikke siRNA’er og mRNA akkumulering af HIF1 målgener udsat for normoxi og hypoxi blev sammenlignet (figur 1). Rb-RNA og protein niveauer blev tilsvarende undertrykt under både normoxiske og hypoxiske betingelser (figur 1A og E). Ingen ændring blev observeret i CXCR4 eller VEGF-ekspression i Rb siRNA transficerede celler under normoxiske betingelser, men en stigning i PLOD2-mRNA akkumulering under normoxiske betingelser blev iagttaget i MCF7-celler (figur 1D), men ikke i LNCaP-celler (figur 1E). Desuden MCF7-celler transficeret med de Rb-specifikke siRNA’er udviste signifikant forøget mRNA akkumulering af HIF1 målgener CXCR4, VEGF og PLOD2 under hypoxiske betingelser (Figur 1B-D). Der blev set en lignende hypoxi-afhængig effekt på CXCR4, VEGF og PLOD2 induktion i respons på undertrykt Rb udtryk i LNCaP prostatacancerceller (Figur 1E) tyder på, at denne observation ikke er celletype specifik.

MCF7-celler (A , B, C og D) og LNCaP-celler (E) blev transficeret med enten scrambled siRNA (SCX) eller Rb siRNAs siRb 1, og siRb 2. Fireogtyve timer efter transfektion cellerne enten blev holdt under normoxiske betingelser eller 1% O

2 i yderligere 24 timer. Genekspression blev bestemt ved kvantitativ realtids-PCR efter isolering og revers transkription af totalt RNA. VEGF blev CXCR4, PLOD2 og Rb ekspression normaliseret til konstitutivt aktiv 36B4 genekspression. Åbne søjler repræsenterer normoxi (20% O

2) og lukkede (grå) søjler repræsenterer hypoxi (1% O

2). Fejl søjler repræsenterer ± standardafvigelse * P. 0,05

Rb og Rb-associerede repressorproteiner rekrutteres til de regulatoriske regioner af Hypoxi Inducerbare Gener under Aktiveret Transskription

Vi observerede, at tab af Rb resulterede i overdrevet udtryk af HIF1 målgener i en hypoxi-afhængig måde. Således var vi interesseret i at bestemme, om tilstedeværelsen af ​​Rb kunne registreres i løbet af de regulatoriske regioner HIF1-regulerede gener huser velkarakteriserede hypoxi responselementer løbet aktiveret transkription; nemlig VEGF-promotoren og EPO enhancer. En skematisk af disse regioner og placeringen af ​​oligonukleotider til PCR-amplifikation af kromatin er afbildet i figur 2A. Kromatin immunopræcipitation (chip) analyse afslørede, at Rb associerer med regulatoriske regioner af HIF1-regulerede gener, VEGF og EPO i en hypoxi-afhængig måde i MCF7-celler (figur 2B). For at sikre, at vores eksperimentelle betingelser produceret den passende reaktion på hypoxi, vi udfældet også kromatin med antistoffer mod HIF1α, Arnt, TRIP230 eller en kontrol kanin IgG. Kontrol-IgG var i stand til at udfælde kromatin indeholder de regulatoriske regioner VEGF og EPO. Som vi har vist tidligere [12], var vi lettere kunne forstærke kromatin udfældet fra hypoxi behandlede lysater end fra dem, der stammer fra lysater holdt under normoxiske forhold ved hjælp af HIF1α, Arnt, TRIP230 og Rb antistoffer. Vi kunne forstærke lave niveauer af VEGF-promotoren og EPO forstærker under normoxiske betingelser (figur 2B), når fældning af kromatin med vores TRIP230 antistof, derfor kan vi ikke udelukke, at TRIP230 associerer med hres ved lave niveauer trods normal ilt spændinger. Men for at vores manglende evne detektere HIF1α eller HIF2α protein under disse betingelser (figur 2C) antyder den mulighed, at Rb ikke er rekrutteret til disse HRE regioner under normoxiske betingelser.

(A) En skematisk af VEGF-proximale promotor og EPO enhancer og den relative placering af oligonukleotider anvendt til PCR-amplifikation. (B) status HIF1α, Arnt, TRIP230, og Rb ved VEGF-promotoren og EPO enhancer i MCF7-celler som analyseret ved kromatin-immunopræcipitation (chip) og polymerasekædereaktion (PCR) og sammenlignet med amplifikationsreaktioner afledt fra lysater udfældet med kontrol-IgG. Alle chips blev udført mindst tre gange undtagen hvor det er angivet. (C) HIF1α og HIF2α proteinniveauer dramatisk beriget under hypoxi i MCF7-celler. MCF7-celler blev holdt i kultur i enten 20% eller 1% O

2 i 24 timer. Nukleare ekstrakter blev analyseret ved immuno-blot og membraner blev probet med affinitetsoprensede antistoffer til HIF1α og α-tubulin. Sekventiel chip med den proximale VEGF-promotoren og EPO enhancer under anvendelse af enten anti-HIF1α (D) eller anti-ARNT (E) affinitetsoprensede antistoffer efterfulgt af immunopræcipitation med anti-TRIP230 og anti-Rb antistoffer. (F) chips af VEGF-promotoren efter i MCF7-celler efter transfektion med enten krypteret siRNA eller siRb1 og immunopræcipitation med anti-TRIP230 antistof. Værdier er udtrykt som fold berigelse i forhold til kontrol og blev bestemt ved kvantitativ realtids-PCR. Hver eksperimentel værdi blev korrigeret for input og eksperimenter blev udført to gange. (G) Immuno-blot-analyse af siRNA-transficerede MCF7 cellelysater anvendt i CHIP eksperimenter. (H) chips af Rb-repressor komplekse proteiner i MCF7-celler. Cellerne blev behandlet som beskrevet ovenfor og chromatin komplekser blev isoleret med affinitetsoprensede antistoffer rettet mod Sin3a, Sin3b, og HDAC 1-3.

Vi udvidede vores undersøgelser i et forsøg på at bestemme, om TRIP230 og Rb har evnen til at interagere med individuelle DNA-elementer i forening med HIF1α og Arnt på hypoxiske responselementer. Vi udførte en sekventiel to-trins chip assay først isolere kromatin med affinitetsoprensede antistoffer til Arnt eller HIF1α efterfulgt af udfældning af disse oprensede kromatin fraktioner med antistoffer mod TRIP230 og Rb. I hvert tilfælde VEGF promotoren blev DNA amplificeret ved PCR i en hypoxi-afhængig måde (Figur 2D og E) hvilket kraftigt antyder, at HIF1α, Arnt, TRIP230 og Rb er til stede ved hres i et multi-protein-kompleks. Desuden knock-down af Rb som vurderet ved immuno-blot (figur 2G), førte ikke til yderligere berigelse af TRIP230 ved VEGF-promotoren (figur 2F) antyder, at Rb ikke interfererer med TRIP230 rekruttering til HIF1 responsive elementer.

Endelig var vi interesseret i at se, om kendte Rb-associerede repressor komplekser [26], [27] var til stede ved disse elementer under hypoxi-drevet transskription. Chip-analyse afslørede Sin3a /b, blev HDAC1 og HDAC3 beriget på HIF-responsive regulatoriske regioner af både VEGF og EPO gener under hypoxiske betingelser (Figur 2H) understøtter vores hypotese, at Rb er en del af transskriptionsrepressor komplekse handler på HIF1-regulerede transkription. I modsætning hertil HDAC2 opførte sig på en mere kanonisk mode og blev afskediget fra disse regioner i en hypoxi-afhængig måde (Figur 2H). Disse data antyder, at transkriptionelle repressorproteiner rekrutteres til hypoksi-regulerede gener under aktiveret transkription. Desuden støtter disse observationer den hypotese, at transskription skal dæmpes for at sikre en hensigtsmæssig transkriptionel respons.

Arnt og TRIP230 er afgørende for Rb-regulering af HIF1 Aktivitet

Da Rb og TRIP230 er interagerende proteiner blev de kvantitative RT-PCR-forsøg gentages under anvendelse af en siRNA rettet mod TRIP230. Hypoksisk gen induktion af CXCR4 mRNA akkumulering blev alvorligt forringet ved knock-down af TRIP230 (figur 3A og B). Knock-down af Rb under disse forhold, som det fremgår af immuno-blot-analyse (figur 3B) resulterede ikke i nogen væsentlig stigning i CXCR4 mRNA, hvilket giver yderligere beviser for, at denne effekt er TRIP230-afhængig. Billeder af hele immun-blots kan findes i figur S1. Desuden har tab af Rb ikke føre til en stigning i CXCR4 mRNA akkumulering i celler ablerede for ARNT af siRNA-medieret knock-down hvilket yderligere antyder, at virkningen medieres af Rb er hypoxia-afhængig (figur 3C og D). Desuden siRNA-medieret suppression af DP1 ekspression i MCF7-celler reagerede på hypoxi så let som kontrolceller (figur 3C og E) indikerer, at modulerende funktion af Rb på HIF-regulerede gener er uafhængig af E2F og kobles fra Rb s kanoniske rolle som en cellecyklus mediator.

(a) MCF7-celler blev transficeret med enten scrambled siRNA (SCX) eller Rb siRNAs siRb 1, og siRb 2, eller en kombination af TRIP230 siRNA og siRb1. Fireogtyve timer efter transfektion blev celler enten opretholdes under normoxiske betingelser eller 1% O

2 i yderligere 24 timer. Genekspression blev bestemt ved kvantitativ realtids-PCR efter isolering og revers transkription af totalt RNA. CXCR4 ekspression blev normaliseret til konstitutivt aktiv 36B4 genekspression. (B) Immuno-blot-analyse af TRIP230 og Rb efter siRNA transfektion med enten krypteret siRNA, eller en kombination af siTRIP230 og siRb. Alpha-tubulin (α-tubulin) blev anvendt som en loading kontrol. (C) MCF7-celler blev transficeret med enten scrambled siRNA (SCX) eller Rb siRNAs siRb 1, og siRb 2 eller Arnt, eller DP1 siRNA eller en kombination af Arnt /RB1 siRNA og behandles som beskrevet ovenfor. (D) Immuno-blot af Arnt og α-TUB efter transfektion med enten scrambled kontrol med siRNA rettet mod Arnt. (E) Immuno-blot af DP1, TRIP230 og α-tubulin (α-tubulin). MCF7-celler blev transficeret med enten scrambled kontrol (SCX) eller siRNA rettet mod DP1. Data i figur 3A og 3C blev analyseret ved anvendelse af en to-vejs-ANOVA. * P. 0,01

Tab af Rb fører til en stigning i HIF1 Target Gene Protein Expression

Vi var interesseret i at bestemme, om effekten af ​​Rb-tab på mRNA akkumulering blev afspejlet på proteinniveauet af HIF1 målgener og især hvis pro-metastatiske faktorer blev påvirket. Således har vi også undersøgt rolle Rb i udtrykket downstream metastatiske markører, der er følsomme over for iltmangel. Tab af Rb resulterede i en ledsagende stigning i CXCR4 proteinniveauer efter 48 timer af hypoxi og PLOD2 efter 96 timer af hypoxi (figur 4A). Desuden er en 24 timers udsættelse for hypoxi med Rb knock-down resulterede også i en forøgelse af ekspressionen af ​​mesenchymale markering, vimentin (Fig S2A). Desuden har tab af Rb ikke øge endogene niveauer af HIF1α (figur 4A), hvilket tyder på, at den observerede hypoxisk virkning ikke skyldtes en stigning i HIF1α ekspression eller stabilitet. Endelig tidligere rapporter viste, at TRIP230 associerer med hyper-phosphoryleret Rb [16], [17]. Immunblotting lysater fra MCF7 og LNCaP-celler med antistoffer rettet mod Rb, Rb-phospho-serin

780 og Rb-phospho-serin

807/811 viser, at der er en betydelig mængde af phosphoryleret Rb i MCF7 og LNCaP celler (figur 4B).

MCF7-celler (A) blev transficeret med enten scrambled siRNA (SCX) eller Rb siRNAs siRb 1, og siRb 2. Rb, CXCR4, HIF1α, PLOD2 og a-tubulin proteinniveauer var vurderet af immuno-blot efter udsættelse for atmosfærisk O

2 eller 1% O

2 for 48 (Rb og CXCR4) eller 96 timer (HIF1α, og PLOD2). (B) immuno-blots af hele cellelysater fra MCF7 og LNCaP-celler enten efterladt på normoxi (N) eller behandlet med 1% O

2 til 6 timer (H). Blots blev sonderet med primære antistoffer til den samlede Rb, Rb-phospho-serin

780 (Rb-pS

780), Rb-phospho-serin

807/811 (Rb-pS

807/811 ), eller α-tubulin som en belastning kontrol.

Tab af Rb Fremmer en invasiv Fænotype i MCF7 brystkræftceller

evne Rb knock-down for at forbedre HIF1 kompleks transkriptionelle aktivitet og proteinekspression førte os at vurdere, om Rb suppression også kan forbedre hypoxi-induceret celleinvasion i traditionelt ikke-invasive MCF7 brystcancerceller [29]. For celler med en komplet komplement af Rb (dvs. celler transficeret med SCX kontrol siRNA), hypoxi havde ingen effekt på invasion af MCF7-celler i matrigel (figur 5A og B). Imidlertid siRNA knock-down af Rb ført til øget invasion af MCF7-celler under hypoxiske betingelser, men havde ingen effekt på invasion under normoxiske betingelser (figur 5A og B). Disse data understøtter den rolle, Rb som en tumor suppressor af hypoxi-regulerede metastatiske programmer.

Fireogtyve timer efter siRNA transfektion blev cellerne underkastet Matrigel invasion assay. Plader blev inkuberet i normoxisk (20% O

2) eller hypoksiske betingelser (1% O

2) ved 37 ° C i 24 timer og invaderende celler blev fikseret og visualiseret med toluidinblåt. (A) mikrofotografier af Matrigel-embedded MCF7-celler. (B) Numerisk repræsentation af relativ invasion af Matrigel-embedded MCF7-celler efter behandling med SCX eller siRb og udsættelse for normoxiske eller hypoxiske betingelser (n = 6), (C) Knock-down af Rb i MCF7-celler ændrer ikke celleproliferation i reaktion på CoC

2. Celler blev transficeret med siRNA s som beskrevet ovenfor. Fireogtyve timer efter transfektion blev celler behandlet med vehikel eller 100 uM CoC

2 at aktivere HIF1α og celler blev talt ved 0, 6, 12, 24, 36 48 og 72 timer senere. Fejl søjler repræsenterer ± S.E.M. * P. 0,01

Vi var bekymret for, at den øgede invasionsevne kan skyldes en dramatisk stigning i celledeling grund af tab af Rb styring af cellecyklus. For at undgå perioder med langvarig, alvorlig hypoxi, viste vi, at HIF1α stabiliserende middel CoCl

2 vil efterligne virkningerne af hypoxi i matrigel assay (figur S2C). Disse data understøtter endvidere vores hypotese, at de observerede virkninger medieres via HIF1 kompleks. Med CoCl etableret

2 som en effektiv efterligning af hypoxi efter knock-down af Rb i Matrigel assay, kunne vi bestemme, om den observerede stigning i celleinvasion skyldtes en stigning i celleproliferation (figur 5C). MCF7 celle vækstdynamik blev overvåget med jævne mellemrum ved at tælle levedygtige celler over en 72 timers periode. I celler transficeret med enten SCX kontrol siRNA eller Rb siRNA og med særskilte prøver af hver hverken i nærvær eller fravær af CoCl

2 observerede vi, at tabet af Rb nedsat proliferation i både ubehandlet og CoCl

2 -behandlede celler (figur 5C) med ingen signifikant forskel mellem de andre behandlinger. Ligeledes matrigel invasion af SCX kontrolceller kunne ikke skelnes under nogen betingelse. Cellesortering efter propidiumiodidfarvning afslørede en større andel af Rb knock-down celler i sub-G1-fasen af ​​cellecyklussen (Fig 5D og E). Tilsammen disse data tyder på, at tabet af Rb fremmer celle invasion i en hypoxi-afhængig måde, og at disse effekter er ikke på grund af øget celletal eller proliferation.

Rb Associates med PAS-B /TRIP230- interaktion domæne af Arnt Protein

muligheden for, at Arnt, TRIP230 og Rb kan være en del af et multimert kompleks blev udforsket af immuno-udfældning af TRIP230 forbundet komplekser fra de nukleare ekstrakter af MCF7-celler inkuberet i 6 timer under hypoxiske betingelser (figur 6A). Immuno-blot-analyse afslørede Arnt og Rb at være til stede i anti-TRIP230 immuno-bundfald, mens ingen af ​​de tre faktorer blev påvist i præcipitater af lysater udført med ikke-immunt IgG. Disse resultater giver stærke beviser for, at nativt TRIP230 protein er i stand til protein-protein interaktioner med Arnt og Rb.

(A) Immuno-blot af komplekser udfældes ved anvendelse af enten et monoklonalt muse-antistof rettet mod TRIP230 eller mus kontrol IgG fra de nukleare ekstrakter af MCF7-celler. Blots blev probet for tilstedeværelse af TRIP30, Arnt og Rb. Den venstre vognbane i hver skamplet indeholder nukleare ekstrakt udgør 10% af input. (B) GST-Arnt-PAS-B er i stand til at trække ned TRIP230 og Rb. Immuno-blot-analyse af GST-Arnt-PAS-B pull-down og GST pull-down af TRIP230 og Rb fra MCF7 nukleare ekstrakter. GST-dele blev fikseret til glutathion-agarose-perler og inkuberet i 90 minutter ved 4 ° C med 500 ug MCF7 celle kerneekstrakt. Input baner blev fyldt med 250 ug af kerneekstrakt. Komplette blots for panel A og B kan findes i Supplemental Figur S1. GST-Arnt-PAS-B er i stand til at trække ned phosphoryleret Rb. (C) Immuno-blot-analyse af GST-Arnt-PAS-B pull-down og GST pull-down af Rb-phospho-serin

780 (Rb-pS

780) fra MCF7 kerneekstrakter høstet fra celler venstre ved normoxi (N) eller behandlet med 1% O

2 til 6 timer (H). (D) kromatin immunopræcipitation assay af EPO enhancer og VEGF promotorregioner i MCF7-celler under anvendelse af kontrol eller Rb-phospho-serin

780 antistoffer. Celler blev behandlet som beskrevet ovenfor. Rb dæmper TRIP230-medieret co-aktivering af Arnt-afhængig transkriptionel aktivitet. De Rb- og Arnt-interaktion domæner er angivet. Hepa-1c1c7-celler (E) og MCF7-celler (F) blev transficeret med en hypoxi responsiv 4xHRE-drevet luciferase-konstruktion som en reporter, ekspressionsplasmider for TRIP230, TRIP230ΔRB og Rb som angivet og udsattes for 1% O

2 eller atmosfærisk (20%) O

2 i 24 timer. Hele cellelysater blev analyseret for luciferaseaktivitet. (G) En skematisk af TRIP230ΔRB mutanten. (H) TRIP230 proteinniveauer er upåvirkede ved transfektion af Rb ekspressionsplasmid ind Hepa1c1c7 celler. Hele cellelysater blev analyseret ved immuno-blot og membraner blev probet med affinitetsoprensede antistoffer til TRIP230, Rb og α-tubulin. * P. 0,05

I betragtning af at tidligere

in vitro

interaktionsstudier fastslået, at Rb ikke direkte interagerer med Arnt [30] vi derfor var interesseret i at afgøre, om TRIP230 interaktion domæne inden ARNT kunne anvendes til at isolere Rb fra MCF7 celler kerneekstrakter. Partch og kolleger har identificeret, at TRIP230 interaktion domænet inden Arnt ligger i sin PAS-B region [31]. Vi smeltet aminosyrerne 344-479 huser den udvidede PAS-B-domænet i mus Arnt til GST. Brug af denne minimale interaktion domæne blev gjort delvis at mindske risikoen for ARNT at interagere med andre nukleare proteiner. Pull-down af TRIP230 og Rb fra nukleare ekstrakter af hypoxi-condition MCF7-celler blev dramatisk beriget ved hjælp af GST-Arnt-PAS-B-domæne i forhold til GST alene (figur 6B). Således er det muligt, at en ARNT kompleks herunder TRIP230 og Rb er dannet gennem ARNT PAS-B-domænet. Dette domæne medierer interaktionen mellem Arnt og flere co-aktivatorer, der er afgørende for Arnt-medieret transskription nemlig TRIP230 [12], de p160 /NCoA /SRC-familien af ​​transkriptionelle co-aktivatorer [15], og kakao [32] .

Endelig vi ønskede specifikt at afgøre, om hyper-phosphoryleret Rb var involveret i HIF1 reguleret gentranskription. Vi probed immuno-blotting med et anti-phospho-serin

780 Rb-specifikt antistof efter pull-down hjælp GST-PAS-B. På denne måde observerede vi hyper-phosphoryleret Rb i blots genereret fra normoxiske og hypoxiske MCF7 cell kerneekstrakter (Figur 6C). Endvidere søgning i transskriptionelle regulatoriske regioner af HRE-holdige VEGF-promotoren og EPO enhancer afslørede tilstedeværelsen af ​​Rb-Pser-

780 i en hypoxi-afhængig måde (figur 6D).

TRIP230 medierer undertrykkende effekter af Rb på HIF-regulerede transskription

Vi har konstateret, at Rb co-renser med TRIP230 og at Rb dæmper ophobning af hypoxi-inducerbare målgen mRNA og protein niveauer. For at bestemme, om evne Rb at modulere HIF1-reguleret transkriptionel aktivitet blev medieret via TRIP230 undersøgte vi virkningerne af Rb på ekspressionen af ​​en hypoxi-responsiv reporter konstrukt under anvendelse deletionsmutanter af TRIP230 i RB-negative og -positive cellelinier . RB-negative Hepa1c1c7 celler blev transficeret med et ekspressionsplasmid, der koder TRIP230, eller et transkriptionelt kompetent deletion-mutant af TRIP230 (TRIP230ΔRb; skematisk i figur 6G) mangler RB-interaktionsdomænet [17], en Rb cDNA ekspressionsplasmid, og et syntetisk luciferase-reporterkonstruktion der indeholder en multimeriseret hypoxi-responsive element (HRE) promotor (figur 6E). Rb ophævet hypoksisk induktion af reporter-aktivitet i celler transfekteret med vildtype-TRIP230, men var ineffektiv i celler transficeret med mutant TRIP230. Transfektion af Rb i Hepa1c1c7 cellelinien havde ingen effekt på niveauer af endogent TRIP230 protein (figur 6H). Faktisk titrering af stigende mængder af Rb-ekspressionsplasmid undertrykt hypoxi-inducerbare reporteraktivitet på en dosis-afhængig måde (figur S2B). Transfektion af den mutante TRIP230 i Rb-positive MCF7 humane brystcancerceller yderligere forøget ekspression af reportergenet (fig 6F), således virker som en dominant negativ sandsynligt ved at konkurrere om hres med det endogene vildtype-TRIP230. Disse data tyder på, at kollektivt Rb er svækkende virkninger på HIF1 transkriptionel aktivitet synes at være medieret af TRIP230.

Diskussion

Vi har fastslået, at Rb dæmper det fysiologiske respons på hypoxi ved HIF1α og at det er et integreret og uundværlig del af HIF1 transkriptionel kompleks i kraft af en direkte interaktion med TRIP230. Denne effekt er uafhængig af andre protein-protein-interaktioner som den repressive effekt af Rb blev tabt i celler overudtrykker en transkriptionelt kompetent mutant af TRIP230 mangler RB-interaktionsdomænet (figur 6E og F) og i celler udtømt for TRIP230 (figur 3A ). Desuden siRNA-medieret knock-down af Rb medført en samtidig forøgelse af kendte HIF1 målgener i en hypoxi-afhængig måde i human MCF7 og i humane prostata LNCaP cancercellelinier (figur 1). Endvidere kunne vi optage Rb løbet velkarakteriserede hres i de regulatoriske regioner EPO og VEGF (figur 2), hvilket antyder, at Rb kan regulere ekspression af disse gener på det transskriptionelle niveau.

TRIP230 co-aktivator var klonet og karakteriseret baseret på dets evne til at interagere med thyroidhormonreceptor (TR) og øge dets transaktiveringsfunktion [13], [16], og i kraft af dets evne til at interagere med Rb [16]. I sidstnævnte rapport blev præsenteret beviser, der støttede en rolle for Rb som en transkriptionel dæmperen af ​​thyreoideahormon receptor funktion, sandsynligvis medieret gennem TRIP230 transkriptionelle co-aktivator. TRIP230 blev senere fundet til at fungere som en vigtig co-aktivator for Arnt-afhængige transkriptionelle aktiviteter, herunder hypoxi-inducerbar genekspression [12]. Vigtigere, fandt vi, at TRIP230 ikke interagere med HIF1α i en gær to-hybrid assay (T. Beischlag, upubliceret data). Vores immuno-nedbør studier beskæftiger antistoffer rettet til TRIP230 viser, at endogene Arnt og Rb interagere med TRIP230 i MCF7-celler (figur 6A) yderligere understøtter vores hypotese, at Rb er en del af en HIF1 transkriptionel kompleks.

For yderligere at afgrænse karakter af denne formodede kompleks og afgøre, om Arnt, TRIP230 og Rb eksistere i samme kompleks, vi slået andre kendte protein-protein-interaktion grænseflader inden Arnt og anvendt et GST pull-down strategi til affinitetsindfangning TRIP230 og Rb. Den omfattende analyse af GST pull-down udført af Elferink og kolleger ikke kunne påvise en direkte interaktion med Arnt og Rb

in vitro

[30]. Derudover baseret på vores tidligere undersøgelser, der karakteriserer vekselvirkningen mellem Arnt og TRIP230 [12], Partch og kolleger identificeret aminosyrer i Arnt PAS-B-domænet, der medierer ARNT-TRIP230 interaktion [31]. Vi har designet en GST-Arnt-PAS-B fusion dermed fjerne andre protein interaktion domæner inden Arnt. Evne Arnt-PAS-B region til pull-down Rb understøtter eksistensen af ​​en multi-meric kompleks indeholdende Arnt, TRIP230 og Rb (figur 6B). Faktisk har PAS-B-domænet dukket op som en bona fide platform for rekruttering af flere former for transkriptionelle samreguleringsforanstaltninger komplekser [12], [15], [31], [33].

HIF1 * P 0,05.